几件重要动物病原菌生物被膜形成的研究进展

细菌生物被膜是指由于单一或多种类群细菌为了适应周围环境,由自身产生的多聚基质包围而形成,吸附于异物或组织表面,具有三维立体结构的膜样物,是细菌微菌落聚集体。生物被膜保护着细菌得以在恶劣环境中存活生长,较之浮游细菌,其更能抵抗宿主的免疫反应、抗生素及消毒剂的攻击。目前致病菌生物被膜形成在兽医学上的重要性极少受到关注,本文对细菌生物被膜的基础知识及动物重要病原菌已做的研究作一综述,旨在阐明病原菌形成生物被膜的机理,更加重视细菌生物被膜状态在动物疾病中的重要作用,并针对细菌生物被膜形成过程中重要的关键基因设计新型药物。     

防控细菌生物被膜的新武器——噬菌体

细菌生物被膜(bacterial biofilms)是由细菌互相粘连、不可逆地固着于生物机体或物体表面并由细菌分泌的胞外基质包裹的微生物群落。生物被膜为细菌提供了一种保护性生活方式,其形成有利于微生物持续定植,抵抗宿主免疫系统清除,提高对抗生素的耐受性以及遗传物质的交换。细菌生物被膜的存在对生物医学、食品加工等方面极为不利,因此,迫切需要研发能够去除生物被膜的新技术。目前,噬菌体被认为是控制生物被膜的一种有效方法。本文综述了应用噬菌体防控生物被膜的最新进展。     

致羔羊脑炎粪肠球菌生物被膜形成能力及相关基因检测研究

为观察致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05株生物被膜（BF）的形成能力并检测致羔羊脑炎粪肠球菌BF形成相关基因的携带情况,本研究以XJ05为研究对象,运用96孔板建立不同时间BF模型,染色后酶标仪测定D_{595 nm}值,并用倒置显微镜观察BF形态。同时检测11株菌中与BF形成相关基因（gelE、esp、ace、asa1、asa373、efaA、ef0591、ef3314、ahrc、eep）的携带情况,并对相关基因片段做同源性分析。结果显示,在不同时间段XJ05株BF的生成量与空白对照组相比差异显著（P<0.05）,24 h时D_{595 nm}值最高且与其他各个时间段相比均差异显著（P<0.05）。显微镜下观察6 h时BF初具规模,可见散落的网状结构,12~24 h矩阵网格结构明显,24 h时形成高度有序的网格结构,24 h后网状结构逐渐脱落,BF开始降解。11株菌中10种相关基因的携带情况不同,有6株携带8种基因,1株携带7种基因,1株携带6种基因,1株携带2种基因,有2株未检测到10种基因的任何一种。检出的基因片段同源性均在93.3%~100.0%之间。结果表明,XJ05株能形成完整的BF,11株分离的致羔羊脑炎粪肠球菌中有9株携带部分与BF形成相关的基因。     

大肠埃希菌生物被膜研究进展

细菌生物被膜指多个细菌黏附于机体或物体表面,分泌胞外多聚物将其自身包裹其中而形成的结构。研究表明人类许多细菌感染与生物被膜有关,生物被膜具有极高的抗药性和免疫逃逸能力,这也是许多细菌感染难以根除的重要原因之一,近年来已成为医学界关注的热点。大肠埃希菌是最重要的条件致病菌之一,论文从大肠埃希菌生物被膜的形态结构、检测方法、耐药机制、应对策略4个方面综述了大肠埃希菌生物被膜研究的进展。     

猪源屎肠球菌致病力与耐药性及生物被膜形成能力的相关性分析

为研究猪源屎肠球菌的致病力与耐药性及生物被膜形成能力的相关性,本研究分别对9株猪源屎肠球菌进行动物试验、药敏试验和生物被膜形成能力的测定。结果显示有66.67%的菌株引起小鼠肝脏、脾脏出血等病变,并且其中部分菌株导致接种小鼠急性的高死亡率;9株屎肠球菌中KF-QX-1株耐药率最高为100%,其次为ZKXH01(95.24%)、NY01(90.48%)、NY-XY-4(80.95%)、SBLH(76.19%)、HUAX(71.43%)、NY-XY-1(71.43%)和ZHENGY(66.67%),耐药率低于50%的菌株只有JY02(14.29%);生物被膜检测结果显示9株菌中除NY01株外均有不同程度的的被膜形成能力,其中2株菌(JY02和NY-XY-1)生物被膜形成能力相对较强;通过对上述试验结果综合分析显示,肠球菌菌株对受试动物的致病力与其耐药性和生物被膜形成能力之间缺乏明显的相关性,但具有生物被膜形成及耐药两种特性会增强猪源肠球菌的耐药性和传播性,给人类和动物的疾病控制造成更大的威胁。     

SarA调控金黄色葡萄球菌生物被膜形成的研究进展

金黄色葡萄球菌生物被膜的形成是一个多基因和多因子共同调控的过程。葡萄球菌属辅助调节子SarA是金黄色葡萄球菌主要的毒力基因表达调控系统,能直接或间接调控多种生物被膜形成相关基因的表达。本文将对SarA的结构及其调控生物被膜形成的机制作一综述,为深入研究金黄色葡萄球菌的致病机理和开发新的抗生物膜感染策略提供参考。     

绵羊大肠埃希菌生物被膜形成及相关基因的检测

检测绵羊大肠埃希菌中的XJ10生物被膜(biofilm,BF)形成情况并确定与BF形成相关基因的携带情况。采用96孔聚苯乙烯微孔板培养XJ10观察BF的形态和测定OD值分析XJ10BF在不同的时间段形成的情况,采用PCR方法检测BF 12种形成相关基因的分布情况。结果表明,在37℃,BF的OD值从2 h开始逐渐升高,24 h左右接近最高峰,维持至36 h后,OD值开始缓慢下降,直至72 h仍维持较高水平,在整个检测时间段内XJ10BF OD值显著高于对照组,且差异显著(P0.05);6 h时BF形成初具形态,8 h～10 h呈现不完整的网格结构,12 h时BF形成较明显的网状结构,24 h～36 h形成有序的较为密集的网格结构,48 h后网状结构开始解离和脱落。同时在XJ10中检测到了其中8种与BF形成相关的基因,测序结果与GenBank公布的相应序列同源性为97.2%以上。试验表明XJ10具有形成BF的能力,但形成能力较弱,且携带8个与BF形成相关的基因。     

广西猪源沙门菌血清学分型及生物被膜形成能力的研究

为了研究近年广西地区流行猪源沙门菌的血清型和生物被膜形成能力,对从广西区内不同地区规模猪场分离鉴定的35株沙门菌,用玻片凝集法进行血清学分型;应用结晶紫染色微量板定量法检测菌株的生物被膜形成能力。结果显示:试验菌株分属14种血清型,所有菌株均具有生物被膜形成能力:20株弱成膜能力,4株中等成膜能力,11株强成膜能力。其中,鼠伤寒沙门菌的成膜能力较强。     

动物源性沙门菌的血清型、生物被膜形成能力和耐药性分析

本研究旨在探讨动物源性沙门菌的血清型分布、生物被膜形成能力及其耐药性.从不同动物病料中分离细菌,以PCR方法鉴定沙门菌,结合玻片凝集法和16S rRNA序列测定确定沙门菌的血清型和分布,结晶紫染色定量法检测分离株的生物被膜形成能力,药敏试验检测分离菌对常用药物的敏感性.结果共分离鉴定出58株沙门菌,包括鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、丙型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、都柏林沙门菌和阿哥那沙门菌等7种血清型,其中鸡群以鸡白痢沙门菌感染为主,肠炎沙门菌次之;水禽以鼠伤寒沙门菌感染为主.生物被膜测定结果显示51.72％的沙门菌分离株可形成生物被膜,其中83.33％的鼠伤寒沙门菌可形成生物被膜.20种抗生素(氨基糖苷类、磺胺类、喹诺酮类、林可酰胺类、氯霉素类、青霉素类、四环素类和头孢菌素类)敏感性试验表明所有菌株对林可霉素耐药,51.72％对4种及其以上抗生素耐药,并出现了1株对所有受试抗生素均耐药的鼠伤寒沙门菌.结果表明鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌是为目前在家禽中分离的优势血清型;同时具有生物被膜形成能力和多重耐药性的沙门菌将对家禽疾病控制和公共卫生带来更大的威胁.     

胸膜肺炎放线杆菌地方分离株和参考菌株的生物被膜形成

通过玻璃试管和聚苯乙烯微孔板结晶紫染色法分别对胸膜肺炎放线杆菌(APP)的15个血清型国际参考菌株和22个中国地方分离菌株在体外形成生物被膜的能力进行了定性和定量分析.在15个血清型(无14型)的参考菌株中,只有5b、6和11型能在聚苯乙烯微孔板上形成生物被膜;而59%的地方分离株(涵盖13种血清型,无14和15型)在聚苯乙烯微孔板上表现出产生生物被膜的能力.结果表明,大多数血清型的APP能在体外形成生物被膜,尤其在地方分离株中更普遍;与低毒力血清型的菌株相比,高毒力和中等毒力血清型的菌株更倾向于形成生物被膜.     

单增李斯特菌生物被膜形成不同时段sRNA的筛选

为了筛选与单增李斯特菌(LM)生物被膜形成相关的非编码小RNA(sRNA),并初步探索sRNA及其靶基因生物学功能,本研究通过高通量测序和实时荧光定量PCR比较LM浮游菌和生物被膜形成不同时段sRNA的差异情况,筛选与LM生物被膜形成相关的sRNA;预测sRNA的靶基因及分析其可能参与生物被膜形成的调节通路。结果表明：与LM浮游菌相比,预测到38个新的sRNA,其中sRNA00085、sRNA00019、sRNA00058在LM生物被膜形成中显著上调,sRNA00054、sRNA00081、sRNA00111显著下调;3个上调sRNA和3个下调sRNA的靶基因可能参与碳代谢、不同环境中微生物代谢、核糖体、糖代谢、氨酰基-tRNA生物合成及脂肪酸代谢6条调控通路,是潜在的LM生物被膜调控因子。研究结果为深入研究LM生物被膜sRNA调控机制提供了理论依据。     

毒素-抗毒素系统yafON缺失对ExPEC生物被膜形成的影响

肠外致病性大肠埃希菌(ExPEC)是一种重要的病原菌,近年来其对畜牧业(猪、禽、牛羊)、食品业和人类健康的造成了严重的威胁,多重耐药性和生物被膜形成更增加其防控难度。生物被膜在细菌抗逆生长中发挥着重要作用,其与细菌的致病性、耐药性、免疫逃逸等有着密切的关系;而毒素-抗毒素系统也普遍存在于细菌的基因组中,调节细菌的不同生理活动。本研究通过缺失肠外致病性大肠埃希菌的毒素-抗毒素系统yafON基因,发现yafON毒素-抗毒素系统缺失可以引起生物被膜形成能力下降,为解析毒素-抗毒素系统调控生物被膜形成的初步机制和机理奠定了基础。     

生物被膜形成关键基因csgD对鼠伤寒沙门菌黏附侵袭上皮细胞能力的影响

为了探究生物被膜形成关键基因csgD与鼠伤寒沙门菌黏附侵袭上皮细胞能力的关系,本研究利用Red同源重组系统构建鼠伤寒沙门菌S025株csgD基因缺失株(S025ΔcsgD),利用原核表达载体构建回复株(S025ΔcsgDR);运用结晶紫染色定量、共聚焦显微镜和扫描电镜观察、平板表型鉴定等方法检测鼠伤寒沙门菌生物被膜形成能力,并比较野生株、缺失株和回复株黏附侵袭Caco-2细胞和HeLa细胞的差异。结晶紫染色定量、共聚焦显微镜和扫描电镜观察结果显示,与野生株S025和回复株S025ΔcsgDR相比,S025ΔcsgD生物被膜形成能力显著降低;生物被膜成分分析发现,野生株呈红色干燥粗糙型菌落,而S025ΔcsgD呈白色光滑型菌落,表明其卷曲菌毛和纤维素成分减少,回复株的菌落与野生株相似。黏附与侵袭试验结果显示,与野生株与回复株相比,S025ΔcsgD的黏附率和侵袭率显著降低。结果表明,生物被膜形成关键基因csgD在鼠伤寒沙门菌黏附和侵袭宿主上皮细胞方面发挥关键作用,这为进一步阐明生物被膜状态下的鼠伤寒沙门菌的致病机理奠定了理论基础。     

牛乳房炎致病性大肠埃希氏菌耐药性、毒力基因与生物被膜分析

为分析宁夏、甘肃部分地区奶牛乳房炎致病性大肠埃希氏菌(E.coli)耐药性、耐药基因、毒力基因、生物被膜及系统发育分型,对临床乳房炎奶牛乳样中分离鉴定的54株E.coli用肉汤稀释法、聚合酶链反应(PCR)和结晶紫染色法,对其进行耐药性、耐药基因、毒力基因、系统发育分型及生物被膜检测。结果表明,54株E.coli对头孢噻肟耐药率高达100%,对氨苄西林、四环素、氟苯尼考、庆大霉素、头孢吡肟、替加环素、恩诺沙星,耐药率依次为74.07%、57.40%、24.07%、18.51%、11.11%、11.11%、5.56%,对美罗培南均表现为敏感;β-内酰胺类耐药基因中bla_CTX基因检出率最高94.44%,bla_TEM基因检出率为33.33%;四环素类耐药基因中tetB检出率为55.56%,tetA、tetC检出率为1.85%、3.7%,耐药基因高检出率与耐药性表现一致。毒力基因检测结果显示,菌毛黏附素fasA为31.48%,α溶血素hlyA为16.67%,志贺毒素stx1为7.4%;系统发育分型结果显示A型是该地区主要的流行菌株,其携带毒力因子的...     

多元摩拉菌分离株生物被膜形成能力及其致病和耐药情况研究

为了研究分离的猪多元摩拉菌生物被膜形成能力及相关特性,了解其致病性和耐药情况,试验采集天津市某猪场因患猪繁殖与呼吸道综合征并继发细菌感染而导致死亡的猪的心脏、肺脏进行细菌分离培养、生化试验、16S rDNA基因序列测定,并对分离菌进行药敏试验、生物被膜及相关基因检测、PK-15细胞黏附试验、致病力研究及毒力基因检测。结果表明：分离菌为革兰氏阴性球菌且多成对排列;氧化酶试验呈阳性,不分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、蕈糖、木糖,PCR产物大小为868 bp,结合16S rDNA测序结果经BLAST比对鉴定为摩拉菌属成员,与多元摩拉菌(M.pluranimalium)序列的同源性达99.71%,将分离菌命名为M.pluranimalium 1120;M.pluranimalium 1120对氟苯尼考、林可霉素、阿莫西林、恩诺沙星、左氧氟沙星耐药,对头孢噻肟中度敏感,对头孢曲松敏感;在培养至第60小时时生物被膜形成量达到峰值,并检测到生物被膜基因LuxS、LpxM、CRP、nanH、SiaB;对PK-15细胞的平均黏附率为13.3%,黏附能力较弱;对小鼠致病性弱,腹腔注射1×10¹¹     

抗菌肽Temprine-La(FS)抑制2型猪链球菌生物被膜形成的研究

试验旨在研究抗菌肽Temprine-La(S)(T-La(S))、Temprine-La(FS)(T-La(FS))、RGD-T-La(S)和RGD-T-La(FS)对2型猪链球菌(SS2)生物被膜形成的抑制作用。通过结晶紫染色法(CV)检测SS2生物被膜形成能力;微量稀释法测定抗菌肽对SS2生物被膜的最小生物被膜抑菌浓度(MBIC)和最小生物被膜杀菌浓度(MBEC);结晶紫染色法和扫描电镜(SEM)检测抗菌肽对SS2生物被膜形成的影响;XTT法检测抗菌肽对SS2生物被膜代谢活性的影响;苯酚硫酸法检测抗菌肽对SS2生物被膜胞外多糖含量的影响;建立猪链球菌-斑马鱼感染模型,HE染色法观察T-La(FS)对斑马鱼脑组织病理变化的影响;实时荧光定量PCR法分析抗菌肽对SS2生物被膜相关基因及对斑马鱼炎性细胞因子基因转录水平的影响。结果显示,SS2具有良好的生物被膜形成能力;T-La(S)、RGD-T-La(S)、T-La(FS)和RGD-T-La(FS)对SS2生物被膜的MBIC分别为31.3、15.6、7.8和15.6μg/mL;MBEC分别为62.6、31.2、15.6和31.2μg/mL;结晶紫染色结果表明,抗菌肽对SS2生物被膜的形成有抑制作用;扫描电镜结果显示,抗菌肽使SS2生物被膜中的细菌数量和生物被膜的形态发生明显变化,细胞外基质大量减少;XTT法结果显示,抗菌肽可显著降低SS2生物被膜的代谢活性;苯酚硫酸法结果显示,抗菌肽能有效抑制SS2生物被膜合成胞外多糖;实时荧光定量PCR结果表明,抗菌肽作用后降低了SS2生物被膜基因的转录水平;T-La(FS)作用后TLR2、MyD88及促炎性细胞因子基因的转录水平显著或极显著降低(P<0.05;P<0.01),抗炎性细胞因子基因的转录水平显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01)。抗菌肽主要通过影响生物被膜相关基因转录水平和阻断胞外多糖的合成与分泌来抑制SS2生物被膜的形成,其中T-La(FS)可能通过抑制TLR2信号通路中TLR2和MyD88分子表达,抑制炎性细胞因子的释放,减轻脑膜炎的炎性反应。     

抗菌肽Temprine-La(FS)抑制2型猪链球菌生物被膜形成的研究

试验旨在研究抗菌肽Temprine-La（S）（T-La（S））、Temprine-La（FS）（T-La（FS））、RGD-T-La（S）和RGD-T-La（FS）对2型猪链球菌（SS2）生物被膜形成的抑制作用。通过结晶紫染色法（CV）检测SS2生物被膜形成能力;微量稀释法测定抗菌肽对SS2生物被膜的最小生物被膜抑菌浓度（MBIC）和最小生物被膜杀菌浓度（MBEC）;结晶紫染色法和扫描电镜（SEM）检测抗菌肽对SS2生物被膜形成的影响;XTT法检测抗菌肽对SS2生物被膜代谢活性的影响;苯酚硫酸法检测抗菌肽对SS2生物被膜胞外多糖含量的影响;建立猪链球菌-斑马鱼感染模型,HE染色法观察T-La（FS）对斑马鱼脑组织病理变化的影响;实时荧光定量PCR法分析抗菌肽对SS2生物被膜相关基因及对斑马鱼炎性细胞因子基因转录水平的影响。结果显示,SS2具有良好的生物被膜形成能力;T-La（S）、RGD-T-La（S）、T-La（FS）和RGD-T-La（FS）对SS2生物被膜的MBIC分别为31.3、15.6、7.8和15.6 μg/mL;MBEC分别为62.6、31.2、15.6和31.2 μg/mL;结晶紫染色结果表明,抗菌肽对SS2生物被膜的形成有抑制作用;扫描电镜结果显示,抗菌肽使SS2生物被膜中的细菌数量和生物被膜的形态发生明显变化,细胞外基质大量减少;XTT法结果显示,抗菌肽可显著降低SS2生物被膜的代谢活性;苯酚硫酸法结果显示,抗菌肽能有效抑制SS2生物被膜合成胞外多糖;实时荧光定量PCR结果表明,抗菌肽作用后降低了SS2生物被膜基因的转录水平;T-La（FS）作用后TLR2、MyD88及促炎性细胞因子基因的转录水平显著或极显著降低（P<0.05;P<0.01）,抗炎性细胞因子基因的转录水平显著或极显著升高（P<0.05;P<0.01）。抗菌肽主要通过影响生物被膜相关基因转录水平和阻断胞外多糖的合成与分泌来抑制SS2生物被膜的形成,其中T-La（FS）可能通过抑制TLR2信号通路中TLR2和MyD88分子表达,抑制炎性细胞因子的释放,减轻脑膜炎的炎性反应。     

大环内酯类药物对木糖葡萄球菌敏感菌株及其耐药菌株生物被膜形成的影响

为了探究大环内酯类药物泰乐菌素和阿奇霉素对木糖葡萄球菌敏感菌株及其耐药菌株生物被膜形成的影响,试验首先通过倍比稀释法测定两种药物对木糖葡萄球菌敏感菌株及其耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC),然后利用结晶紫染色法考察木糖葡萄球菌敏感菌株及其耐药菌株生物被膜的形成能力,并测定细菌生长情况,最后考察两种药物浓度及药物孵育时间对生物被膜形成的影响。结果表明：木糖葡萄球菌耐药菌株生物被膜的形成能力弱于敏感菌株,木糖葡萄球菌敏感菌株与其耐药菌株的生长存在差异。0.312 5μg/mL的泰乐菌素和阿奇霉素对木糖葡萄球菌敏感菌株生物被膜的形成具有极显著抑制作用(P<0.01),对耐药菌株生物被膜形成的抑制作用不显著(P>0.05);25μg/mL的泰乐菌素和阿奇霉素对耐药菌株生物被膜的形成具有显著或极显著抑制作用(P<0.05或P<0.01)。随着药物孵育时间的延长,对生物被膜形成的抑制效果逐渐增强。说明大环内酯类药物泰乐菌素和阿奇霉素在一定程度上能抑制木糖葡萄球菌敏感菌株及其耐药菌株生物被膜的形成且具有时间依赖性。     

flaA基因的缺失对绵羊脑炎单核细胞增生李斯特菌的细胞黏附、侵袭能力及生物被膜形成能力影响的研究

为了探究flaA基因对单核细胞增生李斯特菌LM90SB_2黏附和侵袭MBMEC、RAW264.7能力、生物被膜(BF)形成能力的影响,本研究分别进行了flaA基因缺失株LM90SB_2-ΔflaA与野毒株LM90SB2对细胞黏附和侵袭试验,定性定量分析了他们生物被膜形成能力以及小鼠不同脏器中载菌量差异。结果显示:LM90SB_2-ΔflaA对MBMEC的黏附菌数较野毒株LM90SB_2低,且两者差异性显著(P<0.05),两者对MBMEC的侵袭数差异性不显著(P>0.05),而LM90SB_2-ΔflaA对RAW264.7的黏附和侵袭数均显著低于野毒株LM90SB_2(P<0.05);LM90SB_2-ΔflaA与LM90SB_2的BF形成规律基本相同,但缺失株形成的BF总量显著低于野毒株的(P<0.05),且与野毒株相比,缺失株的BF结构中核酸与多糖的分布均松散、稀疏、散点状分布。本研究结果表明,flaA基因对LM90SB_2的细胞黏附和侵袭能力均有影响,在其BF形成过程中发挥着重要的作用。