α-1,3-半乳糖苷转移酶基因沉默载体的构建

根据小鼠α-1,3-GT基因mRNA序列设计并合成了特异性的发夹状RNA干扰序列,以pCDNA3为基本骨架,选取人类H1启动子,构建了针对小鼠α-1,3-GT基因的特异性基因沉默载体,为进一步获得α-1,3-GT基因沉默小鼠,构建异种器官移植用小鼠模型奠定了基础.     

植物基因沉默机制研究进展

综述了植物体中转录水平、转录后水平基因沉默及RNA干扰（RNAi）导致基因沉默的机制,并阐述了RNAi技术在植物基因工程中的广泛应用。     

靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体的构建与鉴定

利用RNA干扰在线生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列(其结构特征为正链(19nt)-环(9nt)-负链(19nt))。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体中,构建重组载体pGene-NS3-1,pGene-NS3-2和pGene-NS3-3,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对转化产物进行kan+筛选,碱裂解法提取重组质粒,将酶切鉴定为阳性的质粒测序。结果显示,双链干扰片段克隆方向正确,序列中未出现核苷酸的插入,缺失等突变现象。表明靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体构建成功。     

畜禽日粮中的α-半乳糖苷以及相应酶制剂的应用

提高畜禽对饲料的利用效率一直是动物营养学非常关注的研究领域,尤其在当前饲料原料比较紧缺的情况下如何提高饲料的利用价值更值得重视.阻碍畜禽对饲料充分利用的一个重要因素是饲料原料中含有多种多样的抗营养因子.这些抗营养因子通过干扰畜禽的正常消化和代谢功能而影响动物生产潜能的充分发挥,降低饲料的利用效率.已经发现在豆类籽实和饼粕饲料中含有较高的α-半乳糖苷.部分研究报告指出α-半乳糖苷是一种抗营养因子.本文综述了近年来对α-半乳糖苷的抗营养作用研究,并且介绍了其相应酶制剂-α-半乳糖苷酶在饲料中的应用效果.     

植物内源小RNA及其介导的基因沉默途径

阐述了植物内源小RNA的种类及其介导的多种RNA基因沉默途径,RNA沉默途径中的主要效应蛋白及复合物的组成和功能,重点介绍了miRNA介导的基因沉默途径和siRNA介导的基因沉默途径的异同及其功能,为便于了解植物基因表达调控的多层次性和复杂性,进一步挖掘和利用植物内源信号途径提供一定的参考。     

茎部长度为21、27、29bp的shRNA表达载体构建

利用shRNA(Small hairpin RNA)载体调控基因表达已经成为研究基因功能的有力工具。针对增强型绿色荧光蛋白标记基因(Enhanced green fluorescent protein,egfp),分别设计茎部长度为21bp、27bp、29bp的干扰片段,体外合成的单链shRNA片段退火后连入带有U6启动子的真核表达载体psiSTRIKE中,酶切及测序结果证明设计的干扰片段已经成功克隆进入表达载体,为进一步在小鼠细胞以及个体水平上综合评价不同茎部长度shRNA的干扰效应奠定了基础。     

WRKY33转录因子基因沉默载体的构建

参照拟南芥WRKY33转录因子基因序列设计引物,利用RT—PCR技术从大白菜中克隆了WRKY33基因编码区460bp的序列,利用双链RNA介导的基因沉默技术,构建WRKY33基因沉默植物表达载体,为进一步研究该基因在植物与软腐病菌互作中的功能及其作用机制奠定基础。首先将WRKY基因片段连接至pUCm—T载体上,用PstI／BamHI和风fI／Xho1分别对pUCm—WRAT载体进行酶切,得到2个WRKY基因片段;先后将其连接到pBSSK—in载体上,构建成pBSSK．WRKY-in—WRKY载体,该载体中的2个WRKY片段大小一致,反向重复;并用SacⅠ／KpnⅠ酶切pBSSK—WRKY-in—WRKY载体得到WRKY-intron—WRKY片段,连入表达载体pCAMBIA1301中,构建成该基因的沉默植物表达载体。     

α-半乳糖苷酶及其在肉鸡日粮中的应用

[目的]综述α-半乳糖苷酶及其在肉鸡日粮中的应用。[方法]对α-半乳糖苷的结构、特性、抗营养作用机理及α-半乳糖苷酶的特性及在肉鸡日粮中的应用进行综述,并展望了其应用前景。[结果]α-半乳糖苷是无色透明状液体,甜度为蔗糖的70%,总能为8 136kJ/g,粘度低于麦芽糖,吸湿性比蔗糖小。α-半乳糖苷由半乳糖、葡萄糖和果糖组成,具有良好的热稳定性。在肉鸡日粮中添加α-半乳糖苷酶后,肉鸡日增重增加,能量代谢及养分利用率提高。[结论]该研究为进一步推进该酶制剂在肉鸡日粮中的合理应用奠定基础。     

α-半乳糖苷酶法合成α-半乳糖基-β-环糊精的研究

应用发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶法合成α-半乳糖基-β-环糊精,研究其合成工艺.通过BoxBehnken设计等方法,得出工艺条件为α-半乳糖苷酶用量73 nkat,时间28 h,pH 6.3,温度40℃,振荡速度75 r/min,反应体系包括2mL醋酸缓冲液(50 mmoL/L),β-环糊精0.4 mol/L,蜜二糖0.8...     

用牛αS1-酪蛋白基因构建乳腺生物反应器表达载体的研究

牛αS1-酪蛋白基因是制备乳腺生物反应器常用的表达载体,可以指导外源基因在动物乳腺中高水平表达。对牛αS1-酪蛋白基因的结构、表达载体的各种调控元件及其研究应用进展等方面作一综述。     

水稻OsDCL3b基因组织表达分析和沉默载体的构建

采用荧光定量PCR方法分析了籼稻93-11根、茎、叶和花药中OsDCL3b基因的表达,发现水稻不同组织OsDCL3b的表达量存在明显差异,花药中表达量最多,根中表达量最少.重点构建了水稻OsDCL3b基因的沉默载体,通过农杆菌介导转化粳稻中花11,获得了转基因To代阳性植株,为进一步研究OsDCL3b基因的功能打下了基础.     

根霉A03α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质初步研究

根霉（Rhizopus sp.A03）发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了2.3倍,总酶活回收率达到25.9%,SDS-PAGE显示其相对分子质量为168.8 kDa。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.5,最适温度为45℃,表观Km值为0.340±0.026 mmol/L,表观kcat/K_m值为2.866×10⁴ mol-1/（L·s）;水解蜜二糖和棉子糖的表观速率均为10.0μmol/（h·mg）;水解活性受Fe³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺和Hg⁺等离子的强烈抑制,但Fe²⁺对酶活性具有显著的激活作用。该酶活性在pH4.0～8.9保持稳定,在45℃时保温60min,残余酶活达到了77.4%。     

青花菜β-1,3葡聚糖酶基因的克隆、表达分析及其植物表达载体的构建

根据其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因保守域序列设计简并引物,扩增出青花菜β-1,3-葡聚糖酶基因的中心区段,结合5′RACE和3′RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列,经序列拼接获得1个1 277 bp 的cDNA,在GenBank 中登录号为EF484879,定名为BObg.序列分析结果表明,该cDNA 包含1个1 056 bp的开放阅读框,编码352个氨基酸,其理论上的等电点PI=7.314,相对分子质量为3.892×104,聚类分析显示该序列与已报道的其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高氨基酸序列同源性.利用未接种和接种霜霉病后不同时期的青花菜植株细胞进行半定量RT-PCR分析,结果表明,该基因在霜霉病接种后48 h优势转录表达,未接种和接种后其他时期都呈低水平转录表达.利用pBI121质粒构建含35S启动子的正义表达载体,酶切图谱和PCR分析结果证明该表达载体构建成功.     

转基因沉默HMW-GS基因的遗传规律及其在育种中的应用

以转基因小麦Glu-1-RNAi为供体亲本、弱筋品种扬麦18和扬麦13为受体亲本进行常规杂交与回交,采用半籽粒SDS-PAGE技术检测并分析亲本、Fl、F2、F3、BClF1、BC1F2、BC2Fl世代高分子量谷蛋白亚基(High molecularweight glutenin subunit,HMW-GS)的组成,研究由RNA干扰技术诱导的HMW-GS沉默效应在非转基因小麦品种中的遗传规律。结果表明:转基因小麦HMW-GS的沉默效应表现为显性遗传,在自交及回交后代中HMW-GS的沉默效应能够稳定遗传。HMW-GS的沉默效应在弱筋小麦培育工作中具有应用价值。     

利用RNAi技术沉默东方粘虫V-ATP酶H亚基研究

昆虫V-ATP酶(vacular-type ATPase)是以ATP为能量跨膜转运H+的质子泵,对其亚基进行干扰都会影响ATPase的活性,进而影响昆虫的生理生化指标。本研究利用特异性引物通过RT-PCR法扩增东方粘虫(Mythimna separata)V-ATPase H亚基的2个片段,合成相应dsRNA,通过显微注射导入3龄粘虫体内,观察试虫表型及存活情况,RT-PCR检测试虫体内H亚基的表达。结果表明,注射粘虫V-ATPase H亚基的dsRNA能够显著降低粘虫中肠V-ATPase H亚基的表达水平,直至导致目的基因沉默和粘虫死亡。本项研究成功实现东方粘虫体内V-ATPase H亚基基因沉默。     

NtSKP1基因的RNAi载体构建及对烟草的转化

根据枯斑三生烟草SKP1基因(NtSKP1)的序列,设计二对分别含有特定酶切位点的特异引物,以重组质粒pMD18-SKP1为模板,分别扩增目的基因的正反向片段(约473 bp)。将反向目的片段插入中间载体pHANNIBAL内含子右侧,正向目的片段插入该载体内含子左侧,再经NotⅠ酶切回收约3 916 bp目的片段,插入到双元载体质粒pART27中,成功构建了含NtSKP1基因片段正反向重复序列的植物表达载体pART27-skp1sa。将pART27-skp1sa质粒导人根癌农杆菌LBA4404中并转化烟草叶片细胞,经选择分化培养,获得转基因烟草。     

猪α1岩藻糖转移酶基因点突变的PCR-SSCP检测

猪α1岩藻糖转移酶基因(FUT 1)位于猪第6号染色体上,是猪肠毒素大肠杆菌F 18受体(ETEC F 18R)理想的候选基因。采用PCR-SSCP法共检测外来猪种、国内地方猪种和培育猪种3个类型9个猪种共计255个个体FUT 1基因M 857位点的多态性,所检测的3个外来猪种均存在GG和AG两种基因型,而国内地方猪种中除临高猪外均表现为极端的单态分布,只存在GG基因型。采用PCR-SSCP方法对FUT 1基因点突变进行检测,具有试验成本低、操作简便和灵敏度高等优点,可望在育种实践中得到更广泛的应用。     

基于α-半乳糖苷酶基因为筛选标记的酿酒酵母诱导型表达载体的构建及应用

以α-半乳糖苷酶基因为筛选标记,构建GAL1诱导型启动子介导的酿酒酵母表达载体YGM-α-gal质粒,将枯草芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆到此载体中,构建质粒YGMPA-α-gal,转化宿主酵母后,实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母中的分泌表达.结果表明:在2%半乳糖诱导下,摇瓶发酵24h后分泌表达的β-葡聚糖酶活性达到411.9U爛mL-1,而在培养60h后,发酵液中α-半乳糖苷酶活性可达64.2U爛mL-1.说明α-半乳糖苷酶基因可用作酿酒酵母表达载体转化的有效筛选标记,为食品级酿酒酵母表达系统的构建提供了新选择.     

小鼠Nr1d1基因生物信息学分析及其慢病毒干扰载体的构建

[目的]研究旨在分析小鼠Nr1d1基因序列信息及其所编码蛋白的结构和功能,构建并筛选出干扰效率最优的小鼠Nr1d1基因慢病毒干扰载体.[方法]对小鼠Nr1d1核苷酸序列和氨基酸序列进行生物信息学分析;设计合成4对小鼠Nr1d1基因的特异性shRNA序列和1对无义序列;分别将它们连接至pCD513B-U6慢病毒干扰载体上...     

天祝白牦牛αs1-酪蛋白基因和κ-酪蛋白基因的PCR-RFLP研究

利用PCR—RFLP技术熏检测了天祝白牦牛αS1-酪蛋白(αS1-casein,αS1-CN)基因和κ-酪蛋白(κ-casein,κ-CN)基因部分序列的遗传多态性熏结果表明:天祝白牦牛群体αS1-CN基因表现单态,κ-CN基因存在遗传多态性。κ-CN基因PCR-RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0.0745和0.9255。κ-CN基因PCR-RFLP位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定理(P>0.05)。天祝白牦牛群体内平均基因一致度、基因多样度和有效等位基因数分别为0.9311、0.0689和1.0739。