猪霍乱沙门菌C500运载猪瘟病毒新型基因疫苗在家兔体内的免疫应答

为研究猪霍乱沙门菌C500(S.C500)运载猪瘟病毒(CSFV)新型基因疫苗口服免疫家兔的体内免疫应答特点,采用电转化法将CSFV新型基因疫苗转化到S.C500,构建重组工程菌,口服免疫接种家兔,检测CSFV、S.C500特异性抗体;并用猪瘟兔化弱毒疫苗及猪伤寒沙门菌野毒株依次进行攻毒试验。结果显示,成功构建CSFV新型基因疫苗重组菌S.C500/pCB-ME2-IL-15,S.C500/pCC-ME2-IL-15。口服免疫家兔可以诱导产生抗CSFV和S.C500的特异性ELISA抗体,且S.C500/pCC-ME2-IL-15略显优势。经三免后免疫家兔能够部分抵抗猪瘟兔化弱毒疫苗与猪伤寒沙门菌野毒株的攻击。试验提示以S.C500为CSFV新型基因疫苗运载体的猪用重组活菌苗具有可行性。     

携带猪乙型脑炎DNA疫苗减毒沙门菌的构建及其免疫原性

将乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原片段基因串联,构建真核表达载体pCI-EAB.将重组质粒pCI-EAB转染Vero细胞,表达产物通过RT-PCR和间接免疫荧光试验可检测出目的基因的转录与表达.质粒pCI-EAB电转化入减毒猪霍乱沙门菌,观察重组菌的安全性、体内外的稳定性与免疫原性.动物试验表明,重组菌是相对安全和稳定的;重组菌S.C500/pCI-EAB体外培养时,D600值在0.8左右质粒是比较稳定的;以1×108CFU剂量的重组菌S.C500/pCI-EAB口服免疫小鼠,在二免后1周和三免后1周,重组菌抗体水平与S.C500/pCI-neo空载体组差异显著(P＜0.01);脾脏淋巴细胞增殖情况显示,重组菌对ConA有显著的反应性,且与对照组差异明显,同时CD3+、CD4+和CD8+T细胞的数量也显著高于对照组(P＜0.01).上述结果初步表明,以减毒沙门菌为载体的猪乙型脑炎DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性,为猪乙型脑炎口服活菌疫苗的研制奠定了基础.     

基于VP1重组蛋白的口蹄疫病毒O型间接ELISA检测技术

采用RT-PCR方法扩增O型口蹄疫病毒VP1基因片段,将其克隆于pET-32a.将重组质粒转化宿主菌Rosetta,经1.0 mmol/L IPTG诱导,外源基因获高效表达.通过Western-blot以及ELISA试验证明,重组VP1蛋白与标准阳性血清发生反应.以纯化的VP1蛋白作为检测抗原包被酶标板建立了检测口蹄疫病毒O型抗体的间接ELISA方法.对355份临床血清样品的检测结果显示,建立的方法与口蹄疫病毒O型液相阻断试剂盒符合率为98.87％.表明建立的方法能够用于口蹄疫病毒O型抗体的快速分型检测.     

O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与原核表达

根据已经公布的O型口蹄疫病毒VP1基因序列,设计合成了1对VP1基因特异性引物,应用RT-PCR技术从O型口蹄疫病毒标准毒株扩增得到VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组原核表达质粒pET-28a-VP1,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,O型口蹄疫病毒VP1基因在大肠埃希菌BL21中得到了正常表达,所表达的融和蛋白与标准O型口蹄疫病毒阳性血清具有特异性抗原/抗体反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性.     

表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

A型塞内卡病毒(SVA)是近年来新流行的一种传染性病原，与口蹄疫病毒(FMDV)具有相似的基因组结构，所致临床症状也十分相似。为了研发一种新型的基因工程活载体疫苗，用于预防塞内卡病毒感染和口蹄疫，以SVA全长感染性克隆pSVA-GX01为基础，在SVA 2A与2B基因之间插入O型FMDV的VP1基因，经双酶切及测序鉴定，成功获得了重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O。将重组质粒转染BHK-21细胞，拯救获得重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O,间接免疫荧光试验鉴定显示，该重组病毒可在细胞中表达O型FMDV的VP1蛋白。对该重组病毒进行体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析表明，重组毒株和亲本毒株在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性，插入的FMDV VP1基因可在细胞传代过程中稳定存在6代。研究结果为开发以塞内卡病毒为载体构建表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组基因工程活载体疫苗提供了参考。     

口蹄疫病毒VP2基因的原核表达及抗原性检测

将口蹄疫病毒VP2基因连接到原核表达载体pPROEX^TM HTb上，获得重组质粒pPR-VP2。将此质粒转化感受态菌DH5α中，经终浓度为1．0mmol／L的IPTG诱导，1h～6h依次收集菌液，SDS-PAGE电泳分析，在4h后表达量可达到高峰。经过软件分析，表达产物占总菌体蛋白的23．1％，大小为33Ku左右。根据Ni-NTA纯化系统说明操作，获得较纯的VP2融合蛋白。以牛抗O型口蹄疫病毒血清为第一抗体，通过Western blot和Dot ELISA鉴定，纯化后的VP2融合蛋白可以与牛抗O型口蹄疫病毒血清发生特异性反应。     

禽用减毒沙门菌活载体疫苗的研究进展

疫苗主要通过激发机体的免疫系统来达到防治疾病的目的。目前,疫苗主要有灭活疫苗、减毒疫苗及基因工程疫苗等。基因工程疫苗包括基因缺失苗、基因重组苗等。活载体疫苗是将胞内感染性的细菌直接用来运载目的基因进入体内,而产生相应的免疫应答反应。目前沙门菌的预防与治疗通常使用药物,但沙门疫苗研究正迅速发展,如减毒沙门菌活载体疫苗则是将减毒后的沙门菌作为载体,     

减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗载体研究进展

活载体疫苗技术的发展促使产生了更多的疫苗设计新思路.沙门菌是一种肠道细菌,目前已通过基因突变的方法构建了许多种减毒株,如GID101、GID105、X4064、ZJⅢ、Ty800、X4632、X4550、X4072和X3730等,这些减毒株被突变掉了两个或两个以上的基因,然而其基因型和血清型仍很稳定,所以人们常将其用作基因疫苗的表达载体或运送载体.现在已有许多种细菌、病毒和寄生虫的减毒沙门菌活载体疫苗被研制成功.文章对沙门菌的减毒方法,减毒沙门菌的免疫机理以及其用途和作为疫苗载体的优缺点做了简述.     

减毒沙门菌携带CWP2-S基因抗贾第虫口服疫苗的免疫原性

构建重组减毒沙门菌SL7207/p VAX1-CWP2-S,对其免疫效果进行检测。酶切连接法构建重组质粒p VAX1-CWP2-S,以电击转染的方式转入减毒沙门菌SL7207。体外连续培养检测重组减毒沙门菌SL7207/p VAX1-CWP2-S对质粒p VAX1-CWP2-S的携带稳定性;以重组减毒沙门菌SL7207/p VAX1作为对照,经口服喂饲的方式免疫清洁级雌性BALB/c小鼠,8周后处死,检测各组试验鼠血清中和小肠灌洗液中特异性Ig G和SIg A的水平。结果是重组减毒沙门菌SL7207/p VAX1-CWP2-S连续培养168 h后,质粒携带率为90%;口服免疫小鼠8周后,与对照组相比,重组减毒沙门菌SL7207/p VAX1-CWP2-S免疫组血清特异性Ig G抗体增高约4.4倍,小肠灌洗液中特异性SIg A抗体增高约6.67倍。表明重组CWP2-S减毒沙门菌株具有良好的免疫原性。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白,用于O型口蹄疫病毒的检测.以质粒T234/FMDV为模板,PCR扩增VP1基因片段,构建重组质粒pET-41b/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导,SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot进行分析检测,目的蛋白经镍离子亲和层析纯化,以纯化的目的蛋白包被,建立了间接...     

猪霍乱沙门菌菌蜕的制备及免疫保护力研究

为制备猪霍乱沙门菌菌蜕并研究其免疫保护力,本实验克隆噬菌体phiX174裂解基因E,与pBV220连接,构建温控溶菌表达载体,将该载体转入猪霍乱沙门菌TTB1中,制备菌蜕并对其裂解率、安全性以及对小鼠的免疫保护力进行了研究。结果显示：成果克隆了裂解基因E、片段大小274bp,构建了温控溶菌质粒载体pBVE,制备了猪霍乱沙门菌菌蜕,其裂解率最高为99.46%、经冻干灭活残余活菌,安全性试验检测证实其安全后,对小鼠进行了免疫保护试验,其保护率为70%、与弗氏佐剂灭活苗保护率相当、优于甲醛灭活苗。研究结果为猪霍乱沙门菌引发疾病的防治奠定了基础。     

表达NDV HN和IBDV VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌的构建及其生物学特性分析

为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌,并分析其生物学特性。本研究扩增了NDVHN和IBDVVP2主要抗原基因片段,通过重叠延伸PCR扩增获得HN-VP2融合基因,构建重组质粒pYA-HN-VP2,将该重组质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd中,获得表达HN-VP2融合蛋白的减毒重组菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2),并分析其生化特性、遗传稳定性和毒力等生物学特性。Westernblot结果显示,重组减毒沙门菌可分泌表达HN-VP2融合蛋白,大小为84ku,且该融合蛋白分别能与相应特异性阳性血清发生反应;生物学特性结果显示,重组菌株失去了利用麦芽糖、山梨醇及乳糖等碳源的能力,其生长速度显著慢于野生菌株SL1344;毒力较野生菌株至少下降5个对数单位,且能够稳定遗传重组质粒pYA-HN-VP2。本研究为鸡新城疫-传染性法氏囊病-沙门菌病的三联口服疫苗研制奠定重要基础。     

表达NDV HN蛋白重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasdC79-13的构建及生物学特性

利用平衡致死系统构建表达鸡新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)的减毒鸡白痢沙门菌活载体疫苗株。以p MD18-T-HN为模板,经PCR扩增出HN基因,定向插入原核表达载体p YA3493,构建重组质粒p YA-HN,再将其电转入减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasd C79-13中,获得重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasd C79-13(p YA-HN)。对重组菌的生化特性、生长特性、稳定性及安全性进行测定;并对重组菌表达的HN蛋白进行SDSPAGE和Western blot分析。结果显示,该重组菌保留了在DAP阴性环境中的生存能力;不能利用麦芽糖、蔗糖及乳糖等碳源,但保留了利用葡萄糖的能力;其生长速度明显低于强毒株C79-13,而与ΔcrpΔasd C79-13相比变化不明显;在体外连续传代能稳定遗传HN基因片段;经SDS-PAGE出现1条蛋白质量约为63 000的蛋白条带;Western blot证明重组菌表达的HN蛋白能与NDV阳性血清特异性结合;雏鸡口服接种试验表明ΔcrpΔasd C79-13(p YA-HN)的毒力较强毒株C79-13下降183倍。上述结果表明,成功构建了能稳定表达NDV HN蛋白的口服重组减毒鸡白痢沙门菌,为开发鸡白痢—新城疫的基因工程口服疫苗奠定了初步基础。     

猪霍乱沙门菌菌蜕的制备及免疫保护效力研究

为制备猪霍乱沙门菌菌蜕并研究其免疫保护效力,克隆噬菌体phi X174裂解基因E,与p BV220连接,构建温控溶菌表达载体,将该载体转入猪霍乱沙门菌TTB1中,制备菌蜕并对其裂解率、安全性以及对小鼠的免疫保护效力进行了研究。结果显示:成功克隆了裂解基因E、片段大小274 bp,构建了温控溶菌质粒载体p BVE,制备了猪霍乱沙门菌菌蜕,其裂解率最高为99.46%、经冻干灭活残余活菌,安全性试验检测证实其安全后,对小鼠进行了免疫保护试验,其保护率为70%、与弗氏佐剂灭活苗保护率相当、优于甲醛灭活苗。研究为猪霍乱沙门菌感染的防治奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒P1-2A3C基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进O型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取O型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法和间接血凝方法检测血淋巴中的表达产物:目的蛋白在感染病毒后120 h的蚕血淋巴中表达量最高,抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1∶128。结果显示O型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。     

重组减毒沙门菌对乳腺癌细胞的抑制作用

为研究融合表达肿瘤靶向肽(RGD)、细胞穿膜肽(TAT)和白树毒素(GEL)基因重组减毒沙门菌对乳腺癌细胞MDA-MB-231的体外抑制作用,将重组质粒载体pEGFP-RGD-TAT-GEL导入至减毒沙门菌LH430中,构建了重组减毒沙门菌LH430-RGD-TAT-GEL。经PCR、双酶切鉴定正确后,将重组菌转染MDA-MB-231细胞,提取总RNA后进行反转录,采用PCR技术检测目的基因的转录情况,细胞增殖毒性试验检测重组菌对MDA-MB-231细胞和HEK-293细胞的抑制率。结果显示:被重组菌转染后的MDA-MB-231细胞经RT-PCR检测,目的基因高效表达,对MDA-MB-231细胞最佳抑制条件为细菌浓度1×10~8 CFU/μL,转染时间为48 h,且半数抑制浓度为4.643×10~7CFU/μL。本试验为研究细胞穿膜肽、核糖体失活蛋白和细菌联合治疗肿瘤的后续动物试验提供试验支持。     

兔抗O型口蹄疫VLPs酶标抗体的制备及初步应用

为制备兔抗O型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)的酶标抗体,进一步建立O型口蹄疫病毒的ELISA检测方法,通过原核表达、体外纯化和组装O型口蹄疫VLPs,免疫家兔制备兔抗O型口蹄疫VLPs高免血清,并采用亲和层析法纯化IgG,改良过碘酸钠法制备兔抗O型口蹄疫VLPs的酶标抗体(rabbit anti-type O foot-and-mouth disease IgG-HRP)。结果显示,兔抗O型口蹄疫VLPs高免血清效价达1∶4 096,纯化后的IgG纯度达90%,效价达1∶512 000。表明获得了高纯度的兔抗O型口蹄疫VLP的酶标抗体,可用于O型口蹄疫的ELISA检测。     

表达乳铁蛋白肽的猪源罗伊氏乳酸杆菌对断乳仔猪抗霍乱沙门菌感染的效果分析

旨在分析表达牛乳铁蛋白肽的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA-E/LR-CO21作为饲用微生态制剂对仔猪促生长与抵抗猪霍乱沙门菌感染的作用。将该重组菌连续饲喂28日龄断乳仔猪21 d,并设立空菌组、对照组以及抗生素组。第21天时对断乳仔猪连续口服感染猪霍乱沙门菌3 d,并设置7 d的观察期;仔猪感染后采集试验组与对照组血清、肠黏液及肠组织。检测结果显示重组菌组仔猪平均日增重与免疫器官指数均显著提高（P<0.05）,料重比极显著降低（P<0.01）。感染猪霍乱沙门菌后,相对于对照组,重组菌组仔猪日增重提高,腹泻率降低;重组菌组仔猪血液中IgG以及肠黏液中IL-4、sIgA的量极显著提高（P<0.01）,IL-2、IL-12、IL-6的量显著降低（P<0.05）;重组菌组仔猪肠道紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1的基因转录水平和TLR4、Myd88和MLCK的基因转录水平极显著提高（P<0.01）,仔猪肠道内猪霍乱沙门菌的数量极显著降低（P<0.01）;重组菌组与抗生素组无明显差异（P>0.05）。以上结果表明,表达牛乳铁蛋白肽的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA-E/LR-CO21可以提高断乳仔猪的生长性能、促进肠道形态发育、增强肠道屏障功能,并且在一定程度上可以保护仔猪免受猪霍乱沙门菌的感染,表明重组菌作为微生态制剂替代断乳仔猪的饲用抗生素具有一定的应用前景。     

携带兔斯氏艾美耳球虫MIC-5基因减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗的安全性、稳定性与免疫原性

对携带兔斯氏艾美耳球虫微线蛋白-5基因(MIC-5)真核表达质粒asd-pBMIC-5-IL-15的减毒鼠伤寒沙门菌X4550(X4550/asd-pBMIC-5-IL-15)进行了安全性、稳定性与免疫原性试验.结果显示,重组菌在109CFU剂量以下对家兔安全;连续培养30代重组菌,重组表达质粒可稳定存在于X4550内,具有良好的遗传稳定性;用重组菌2次免疫动物后,既能诱导机体产生抗兔斯氏艾美耳球虫抗体,也能显著增强淋巴细胞增殖水平,抗球虫指数为164.4.试验表明,减毒沙门菌介导的兔球虫调节型DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性.     

正确使用家禽灭活疫苗

灭活疫苗常用来刺激蛋鸡和种鸡免疫系统反应。对有些病原菌，灭活疫苗是在使用活疫苗过后用，主要用来延长禽体抗体反应。对另一些病原菌，灭活疫苗常常单独用在没有用过活疫苗的禽群。　　灭活疫苗通常被用来诱导对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎和呼肠病毒等的免疫应答反应。灭活细菌疫苗，常常被用来诱导(火鸡)无毒多杀巴氏杆菌活菌苗(Pasteurellamultocida)，猪霍乱沙门菌(Salmonellasp.)和嗜血杆菌属(Haemophilusparagallinarum)。　　就象其它畜禽管理工具，灭活疫苗也需要正确管理和使用。要使禽体免疫系统反应最佳…