致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法的建立

[目的]建立一种基于PCR的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。[方法]采用平板划线法从患病鲫鱼病灶部位分离、纯化获得嗜水气单胞菌,采用CTAB法提取DNA,根据GenBank已经登录的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因保守序列设计引物P1和P2,并以P1、P2为引物对其进行PCR扩增,将测序结果在Blast上进行比对分析。[结果]PCR扩增得到一条约540 bp的条带,Blast分析表明该基因与GenBank登录的气溶素基因的同源性达95.67%。[结论]试验建立的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法简单、可行。     

林蛙嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆及原核表达

以长白山林蛙中分离的嗜水气单胞菌为材料,对嗜水气单胞菌气溶素基因进行克隆、序列分析及基因表达等研究,为嗜水气单胞菌的分子生物学研究提供依据。通过实验成功克隆了气溶素基因,大小为1163bp,对其进行同源性检测,与基因库中DQ186611基因序列的同源性高达99%;构建原核表达重组质粒pGEX-Aer,在大肠杆菌BL21中获得表达,蛋白分子量约为69ku,以包涵体形式存在。     

香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用

为筛选出抗嗜水气单胞菌感染的天然化合物,以嗜水气单胞菌和香叶木素为研究对象,通过最小抑菌浓度测定、生长曲线、溶血试验、免疫印迹、荧光定量PCR和细胞毒性试验研究了香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用。结果发现,对嗜水气单胞菌生长没有影响的香叶木素能在较低浓度下通过抑制气溶素的表达降低共培养物上清液的溶血活性;荧光定量PCR试验发现香叶木素能剂量依赖性地降低气溶素编码基因aerA 的表达。此外,通过活/死细胞染色发现香叶木素可减轻气溶素介导的细胞损伤。以上结果表明,香叶木素通过降低aerA的转录水平降低了嗜水气单胞菌的体外致病力,可作为一种抗嗜水气单胞菌感染的候选药物。     

嗜水气单胞菌气溶素的原核表达及其多克隆抗血清的制备

根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)气溶素(aerolysin,Aer)基因的序列设计引物,以来自湖北的鱼源A.hydrophila分离株为模板扩增出aer基因的ORF序列,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定。测序结果表明,A.hydrophila的aer基因的系统进化树中国内菌株聚为一支,国外菌株聚为一支。通过pET-32a(+)载体构建Ah15株aer基因的表达载体pET32a-15,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约72.2ku相吻合的融合蛋白带,且以包涵体形式存在。浓缩后的包涵体蛋白免疫新西兰大白兔获得了重组蛋白的抗血清,Western blot结果显示,兔抗血清可以识别A.hydrophila的重组毒素,说明该基因的重组蛋白具有很好的免疫原性,可作为A.hydrophila基因工程疫苗研制的候选基因。     

食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌毒性基因的多重PCR检测技术研究

本研究目的是建立检测食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌气溶素基因(aerA)和溶血素基因(ahh1)的技术。气溶素和溶血素是β-溶血性嗜水气单胞菌重要的毒力因子。多重PCR技术被应用于检测28个来源于食用鱼类产品的β-溶血性嗜水气单胞菌样本,包括鲤鱼片,水,鲫鱼片、鳟鱼片、鲢鱼片、鲑鱼片和带鱼片。该研究使用标准菌株嗜水气单胞菌ATCC7965和分离于死蟒蛇的带有β-溶血性毒素基因的嗜水气单胞菌作为对照。所有菌株样本(100%)被证实携带嗜水气单胞菌16srRNA基因(356个碱基对)。所有嗜水气单胞菌样本(100%)被证实携带ahh1毒性基因 (130个碱基对)。26个嗜水气单胞菌样本(93%)被证实携带aerA基因(309个碱基对)。本研究证实β-溶血性嗜水气单胞菌菌株广泛存在于供人类食用的鱼类产品中,对消费者产生了一定的健康风险。     

东北三省致病性嗜水气单胞菌快速检测

从东北三省养殖鱼类体内分离到21株嗜水气单胞菌,通过生理生化方法对该菌进行初步鉴定,然后根据已发表的嗜水气单胞菌16S rDNA基因和气溶素基因(Aer)的保守序列,设计2对引物,利用PCR方法对所分离到的21株嗜水气单胞菌以及参考株进行PCR扩增.结果表明,相对于常规的微生物生理生化检测,PCR对嗜水气单胞菌的检出率为90.48%.本方法的建立为常规理化检测方法提供辅助手段,从而更加有效、快捷的检测致病性嗜水气单胞菌,对东北三省地区水产养殖动物的疾病防治、流行病学调查等具有重要意义.     

大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断方法的建立

根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌气溶素基因（hlyA）序列,设计1对特异性引物,通过对PCR反应条件进行优化,建立了检测大鲵致病性嗜水气单胞菌的PCR诊断方法。结果表明,扩增的阳性条带约为600 bp,特异性、敏感性结果显示,该PCR方法对致病性嗜水气单胞菌DNA的最低检测量为0.4 ng/L,而非致病性嗜水气单胞菌、大肠杆菌、黄杆菌、弗氏柠檬酸杆菌的扩增结果均为阴性。对123份大鲵病料进行检测,结果建立的PCR方法检测结果与细菌学和生化检验结果符合率为97.6%,表明该PCR方法能够对大鲵致病性嗜水气单胞菌样品进行快捷、灵敏、准确的检测。     

欧鳗源嗜水气单胞菌β-溶血素基因序列分析

对克隆的欧鳗源嗜水气单胞菌β一溶血素基因AHL316HEM进行序列和结构分析表明，AHL316HEM基因读码框架全长为1482bp，编码长度为493个氨基酸的蛋白，分子量为54．2kD，等电点为5．625，读码框架内有一个EcoRI酶切位点。AHL316HEM从起始位点至第23个氨基酸残基形成一明显疏水区，可能构成信号肽，其抗原位点大部分都在亲水区，不具穿膜性。同源性分析表明，AHL316HEM基因编码的氨基酸序列与已报道的嗜水气单胞菌溶血素基因(accessionNo．BAA83088)的同源率为98％，与斑点气单胞菌溶血素基因(accessionNo．U40711)、温和气单胞菌溶血素基因(accessionNo．AF443393)的同源串分别为84％和72％，与霍乱弧菌溶血素基因(accessionNo．AF540655)、副溶血弧菌溶血素基因(accessionNo．VIBTRH2A)、金黄葡萄球菌β—溶血素基因(accessionNo．S72497)的同源性分别为7％、5％和4％。这一结果提示，气单胞菌属内各菌种的溶血素基因可能有共同的起源。     

多重PCR技术检测食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌毒性基因研究

气溶素和溶血素是β-溶血性嗜水气单胞菌的重要毒力因子。为建立检测食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌气溶素基因(aer A)和溶血素基因(ahh1)的技术,本文采用多重PCR技术检测28个来源于食用鱼类产品的β-溶血性嗜水气单胞菌样本(包括鲤鱼片、水、鲫鱼片、鳟鱼片、鲢鱼片、鲑鱼片和带鱼片),并用标准菌株嗜水气单胞菌ATCC7965和分离于死蟒蛇的带有β-溶血性毒素基因的嗜水气单胞菌作为对照。结果表明,所有菌株样本(100%)被证实携带嗜水气单胞菌16S rRNA基因(356个碱基对),所有嗜水气单胞菌样本(100%)被证实携带ahh1毒性基因(130个碱基对),26个嗜水气单胞菌样本(93%)被证实携带aerA基因(309个碱基对)。本研究证实β-溶血性嗜水气单胞菌菌株广泛存在于供人类食用的鱼类产品中,对消费者产生了一定的健康风险。     

鲢鳙鱼源致病性嗜水气单胞菌的分离、鉴定

从江西省南城县和广东省佛山市、韶关市患细菌性败血症病鲢鱼、鳙鱼体内分离到3株优势菌,人工感染鲢后证实为该病的病原菌,此3株菌对剑尾鱼的半致死量(LD50)分别为:2.64×105、9.24×104、4.45×105CFU/g。对3株病原菌进行形态特征、ATB细菌鉴定仪生理生化特性鉴定结果符合嗜水气单胞菌的特征;为进一步确定病原菌分类地位,对其16SrRNA序列扩增测序,并与相关细菌16SrRNA序列比对,构建系统发育树,在系统发育树中与嗜水气单胞菌聚类为一支。Aero气溶素基因PCR扩增出209bp条带,检测结果进一步表明此3株菌为含有毒力基因的致病性嗜水气单胞菌。     

嗜水气单胞菌asd-1基因功能研究

asd-1基因编码天冬氨酸半醛脱氢酶,该酶可影响革兰氏阴性菌的细胞壁正常合成。为了研究嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)asd-1基因的功能,采用Overlap PCR方法敲除该基因,结果显示asd-1基因的敲除明显降低了嗜水气单胞菌的生长速度,但是不会导致突变株对二氨基庚二酸(DAP)的强制需求,进一步对氨基酸序列分析表明asd-1蛋白质较迟缓爱德华氏菌、鲶爱德华氏菌的asd A蛋白质多出3个氨基酸,其中Asn-257导致asd A蛋白质中的关键活性位点Arg-267在asd-1蛋白质中改变为Val-267,该研究表明嗜水气单胞菌的asd-1基因突变显著降低其生长速度。     

气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR检测方法的建立

针对GenBank中登录的气单胞菌属(Aeromonas)的毒力基因甘油磷脂胆固醇酰基转移酶基因(GCA T)和嗜水气单胞菌(Aeromonash ydrophila)的16S rRNA基因的保守区设计2对特异性引物.通过进行双重PCR反应体系优化,PCR产物的测序鉴定和特异性试验,建立了一种能同时检测气单胞菌(Aer...     

嗜水气单胞菌的研究进展

为有效预防嗜水气单胞菌引起传染病的发生,以减少对人畜的损害,通过回顾嗜水气单胞菌的分类地位(嗜温性和运动性的气单胞菌属的模式菌)、生物学性质,对其主要毒力因子(外毒素及胞外蛋白酶)和鉴定技术(生化鉴定、免疫血清技术和分子生物学技术)的研究成果进行了综述。     

嗜水气单胞菌研究进展

介绍了嗜水气单胞菌的分类地位、生物学性状等,并概述了嗜水气单胞茵检测技术方面的研究进展。     

嗜水气单胞菌的致病性及其防治方法

现有研究结果表明,嗜水气单胞菌是一种致病力很强的水生常居细菌,能引起水产动物、水禽、家禽和人类等共患病。文章综合报道了嗜水气单胞菌的细菌学特征及其由该菌引起鱼、鳖、蛙、珍珠蚌、鸭及人类感染致病的情况和一般的防治方法,指出今后应对嗜水气单胞菌的发生、传播等做进一步研究,防范该菌对人类的生产、生活造成的危害。     

鲤鱼嗜水气单胞菌的分离与鉴定

[目的]分离、鉴定鲤鱼嗜水气单胞菌。[方法]从具有典型细菌性败血症症状的病鱼或濒死鱼中分离到2株优势菌,经分离培养、人工感染试验、毒力因子和16S rRNA基因序列的测定,研究分离菌的形态、生理生化特征及致病性。[结果]分离到的2株优势菌的菌落形态特征基本一致,经鉴定,确认为嗜水气单胞菌。无菌滤液试验表明,鲤鱼细菌性败血症不是由病毒引起的。腹腔注射分离菌菌悬液的鱼在7 d内全部死亡,人工感染试验的症状与自然发病相似,且再次感染后又可分离到该菌株。分离提纯的致病菌株产生了β-溶血环,经蛋白酶试验为阳性。16S rRNA基因序列同源性分析发现同源性为98%。[结论]嗜水气单胞菌是鲤鱼细菌性败血症的致病菌。     

七彩神仙鱼 BTN1A1 基因克隆及其在嗜水气单胞菌胁迫下的表达分析

【目的】克隆七彩神仙鱼（Symphysodon aequifasciatus）嗜乳脂蛋白 1A1（Butyrophilin 1A1, BTN1A1）基因,分析其在病原刺激下的表达模式,为了解七彩神仙鱼 BTN1A1 基因功能提供依据。【方法】利用生物信息学对七彩神仙鱼 2 个 BTN1A1 基因（BTN1A1-1 和 BTN1A1-2）进行结构和进化分析。根据前期获得的七彩神仙鱼皮肤转录组数据,选取 BTN1A1-1 和 BTN1A1-2 基因的 CDS 区设计引物进行克隆。采用 qRT-PCR 分析 BTN1A1 在各组织中的表达及嗜水气单胞菌刺激下的表达模式。【结果】BTN1A1-1 和 BTN1A1-2 的 ORF 序列长度为 894、1 275 bp,分别编码 298、424 个氨基酸。BTN1A1-1 和 BTN1A1-2 蛋白均具有 1 个信号肽、1 个 Ig 结构域、1 个 lg_like 结构域和 1个跨膜结构域的经典结构,BTN1A1-2 还具有 1 个胞质结构域。七彩神仙鱼 BTN1A1-1 与慈鲷科其他鱼类相似性较高,与尼加拉瓜湖始丽鱼（Archocentrus centrarchus）BTNIAI 对应氨基酸序列同源性最高、为 94.14%。但 BTN1A1-2 与其他鱼类发生分离,形成独特分支。BTN1A1-1 和 BTN1A1-2 在七彩神仙鱼各组织中均有表达,但在鳃、肠道、皮肤等与免疫相关的组织中表达量相对较高。七彩神仙鱼 BTN1A1-1 在嗜水气单胞菌胁迫后表达量先显著下降后上升,而 BTN1A1-2 表达量则先显著上升后下降。【结论】七彩神仙鱼 BTN1A1-1 基因相对保守,而 BTN1A1-2 基因在进化上较为特殊。二者在免疫刺激下的差异表达暗示其可能在七彩神仙鱼免疫防御中发生功能分化。     

嗜水气单胞菌的研究进展

简要回顾和总结了气单胞菌的分布、分类地位、分离鉴定和生长条件等方面的研究情况,并概述嗜水气单胞菌的外膜蛋白（OMP）、胞外分泌物（ECP）等致病因子、诊断技术及疫苗开发方面新的研究成果。