用反向遗传8质粒系统构建流感H1N1重组病毒

为了建立用于流感病毒拯救的反向遗传操作系统,用RT-PCR方法扩增得到A型流感病毒流行株A/shanghai/7/99的HA和NA基因,将其克隆到pGEM-T载体上并测序,挑选阳性克隆分别用BsmBⅠ、BsaⅠ酶切,连接到以BsmBⅠ酶切的双向转录/表达载体pAD3000上,获得重组质粒pAD-HA和pAD-NA,分别与含A/PR/8/34流感病毒7个基因的阳性质粒共转染COS-1细胞,拯救了重组病毒R-HA-PR8和R-NA-PR8,说明构建的重组质粒pAD-HA和pAD-NA是正确的,将pAD-HA和pAD-NA与含A/PR/8/34流感病毒6个基因的阳性质粒共转染COS-1细胞,培养48 h后吸取上清液及COS-1细胞,接种10日龄SPF鸡胚,孵育96 h后,收获鸡胚尿囊液进行血凝和血凝抑制试验。结果显示,鸡胚尿囊液中重组病毒H1N1的血凝效价和血凝抑制效价均为29,鸡胚半数感染剂量为10-8.5~10-9。病毒的成功拯救为进一步深入研究流感病毒的基因功能以及流感新型疫苗的研发奠定了基础。     

细胞内转录拯救Asia1型口蹄疫病毒

 【目的】建立口蹄疫病毒（FMDV）感染性分子克隆的体内拯救技术平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】将置于T7启动子下的FMDV Asia1/JS/China/2005株全长cDNA的真核重组质粒pFMDV-A经Not I线化后和表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,进行病毒体内拯救的研究。【结果】转染细胞盲传第3代48 h后出现致细胞病变（CPE）,第4代10 h出现典型的CPE。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的FMDV,而且存在分子标签,表明构建的FMDV全长cDNA分子克隆在BHK-21细胞内成功包装出FMDV。拯救毒与亲本毒对乳鼠的致病力（LD50）差异不显著,具有相似的生物学特征。共转染试验重复多次,均拯救到FMDV病毒。【结论】成功建立了基于质粒为基础的FMDV的体内拯救方法。     

新城疫病毒广西强毒株的分离与鉴定

从广西某规模化鸡场两个鸡群病死雏鸡中分离到2株有血凝性的病毒，这2株病毒的血凝性均能被新城疫标准阳性血清抑制和中和，经过血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验、血清中和试验和RT-PCR检测结果，确定为新城疫病毒。2株病毒的鸡胚平均死亡时间(MDT)分别为52和54h，脑内致病指数(ICPI)分别为1．975、1．875；鸡胚半数致死量(ELD50)分别为：10^-9.38／0.1mL、10^-9.68／0．1mL，实验结果证明该2株病毒为新城疫病毒强毒株。     

慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证

为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑, PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞, 48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在10~6 TU·mL~(-1)之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显, sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A。该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除。     

灰树花胞外多糖发酵液的抗病毒作用研究

以一株灰树花菌株发酵胞外多糖在鸡胚水平上进行了抗新城疫病毒作用研究。将新城疫病毒分别和灰树花发酵胞外多糖混合接种到9~11日龄鸡胚,继续孵化,记录鸡胚死亡时间并测定死亡鸡胚尿囊液血凝价。结果表明,与对照组相比,通过发酵制备的灰树花发酵胞外多糖对新城疫病毒有很好的抑制作用,减缓并降低了鸡胚的死亡,降低了血凝效价,对新城疫病毒有一定的杀灭作用。     

H1亚型猪流感病毒的分离鉴定

从山东、浙江、湖南、广西等地区各猪场采集30份疑似猪流感病猪的病料,通过鸡胚培养、血凝及血凝抑制试验、电镜观察、RT-PCR和测序分析进行了分离鉴定。结果从山东和湖南两地分离到4株有血凝活性的病毒,其中山东的2株病毒与新城疫病毒阳性血清的血凝抑制试验为阳性,通过电镜观察湖南的2株病毒具有猪流感病毒的特征,且与抗H1亚型猪流感病毒阳性血清的血凝抑制试验为阳性;根据H1亚型猪流感病毒HA基因设计引物,利用RT-PCR扩增出543bp片段,经序列分析证实该病毒为H1亚型猪流感病毒。     

对鸡、驼鸟新城疫毒株毒力与血凝素的测定

两株新城疫（ND）病毒分别分离自发病鸡群与鸵鸟群，本实验室对两株病毒的最小致死量致死鸡胚的平均死亡时间（MDT）、3日龄雏鸡脑内接种指数、6周龄鸡静脉接指数（IVPI）、血凝解脱速率和血凝素热稳定性进行了测定。结果表明，源于发病鸡群的分离物是一株中发型的ND病毒，属快速解脱型，血凝素对热的抵抗力较强；而源于鸵鸟的分离物是一株缓发型的ND病毒，属慢速解脱型，血凝素对热的抵抗力较差。本文还对新城疫病毒的毒力与血凝解脱速率和血凝素热稳定性的关系进行了讨论。     

新城疫野毒株的分离鉴定

2000年春从河南省不同地区的鸡群中分离到2株新城疫病毒，该二毒株经鸡胚传代培养，血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)，鸡胚平均死亡时间(MDT)试验，1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定，6周龄非免疫鸡静脉接种指数(IVPI)测定及空斑试验等生物学特性试验，结果表明该二毒株为新城疫强毒株。     

新城疫病毒地方株分离鉴定及部分生物学特性研究

从某养鸡场发病率为90％、病死率为80％的鸡群中分离到一株病毒。通过血凝(HA)试验、血凝抑制 (H1)试验、鸡胚中和试验及回归试验初步鉴定为鸡新城疫病毒。继而进行了鸡胚半数感染量(EID50)、最小致 死量致死鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)测定等生物学特性研究和对不同动物红 细胞的凝集试验,证明该分离株属新城疫强毒力毒株,命名为YL株。     

单抗夹心ELISA检测免疫鸡群新城疫病毒

用SPF鸡胚将送检的免疫鸡群泄殖腔棉拭样品盲传一代，再用新城疫单抗夹心ELISA对F1代尿囊液进行新城疫病毒(NDV)快速检测，同时用世界动物卫生组织(OIE)推荐的NDV分离及鉴定的方法加以验证。通过对3423份样品的检测，检出阳性样品453份，阴性样品2959份，可疑样品11份，两种方法的阳性符合率为99．3％，阴性符合率为99．7％。对全部阳性样品进行病毒分离，经血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验证明均含有新城疫病毒(NDV)，再将全部阳性样品分离物进一步作毒力鉴定，结果有强毒力株、中等毒力株及弱毒力株，因此用新城疫单抗夹心ELISA检测免疫鸡群泄殖腔棉拭样品F1代尿囊液新城疫病毒快速、准确率高，呈阳性者不全是NDV强毒力株感染，还有NDV中等毒力株或弱毒力株感染。     

表达传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建

 【目的】重组新城疫病毒（newcastle disease virus,NDV）作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景,本研究旨在探讨新城疫病毒作为防制传染性法氏囊病超强毒（very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV）及新城疫重组二联活病毒载体疫苗的可行性。【方法】采用单股负链RNA病毒反向遗传操作技术,救获野生型NDV LaSota疫苗株rLaSota及表达vvIBDV Gx株VP2基因的重组疫苗株rLaSota-VP2,分别经滴鼻点眼途径免疫SPF雏鸡,免疫后21 d分别以vvIBDV Gx超强毒和新城疫强毒进行攻击。【结果】rLaSota及表达vvIBDV－VP2基因平均鸡胚致死时间均大于120 h,脑内致病指数（ICPI）分别为0.4和0.36,静脉内致病指数（IVPI）均为0;接种后72～96 h每毫升尿囊液EID50则分别达到109.0以上。rLaSota-VP2以106.0 EID50一次免疫7日龄SPF鸡雏,免疫后3周对新城疫强毒致死攻击100％保护,对vvIBDV攻击免疫保护率达90％以上。 【结论】重组病毒rLaSota-VP2保持了LaSota亲本疫苗株高滴度的鸡胚生长特性和低致病性及遗传稳定性,免疫雏鸡对新城疫强毒和传染性法氏囊病毒超强毒株的致死均形成有效免疫保护。本研究为研制传染性法氏囊病－新城疫重组二联活载体疫苗奠定了基础。     

新城疫病毒V蛋白C端酵母双杂交诱饵质粒的构建与鉴定

为构建新城疫病毒(NDV)V蛋白C端酵母双杂交诱饵质粒,用RNA试剂盒提取NDV F48E9株的RNA,通过反转录试剂盒将抽提的RNA反转录,以反转录合成的eDNA为模板,通过PCR扩增,获得V蛋白C端基因(VCTD).通过酶切连接的方法将V蛋白C端基因克隆至pGBKT7载体上,命名为pGBKT7-VCTD.将pGBKT7-VCTD转化酵母Y2H Gold酵母感受态细胞,转化产物涂布营养缺陷型平板,观察平板上菌落生长情况,判定诱饵质粒有无自激活能力:同时挑取平板上的生长的菌落接种液体培养基培养,绘制生长曲线,判定pGBKT7-VCTD诱饵质粒有无毒性.酶切和测序结果表明,成功构建pGBKT7-VCTD诱饵质粒,且该诱饵质粒在酵母细胞中无毒性和自激活能力.本研究成功构建了pGBKT7-VCTD诱饵质粒,为筛选NDVV蛋白C端纳米抗体奠定基础.     

兔出血症病毒感染性克隆的优化

为避免细胞外转录步骤,使RHDV感染性克隆的转录和病毒拯救过程一步化,试验通过PCR反应在RHDV cDNA序列的5′端添加T7启动子核心序列,3′端添加具有自身切割功能的核酶核心序列.然后,将RHDV基因组的不同cDNA片段装配到pTVT转录载体中,构建了含有RHDV全长cDNA序列的重组质粒pTVT-RHDV.在转染能稳定表达T7RNA聚合酶的BHK细胞后,将收获的细胞培养物感染MA104细胞.分别用逆转录PCR、间接免疫荧光检测以及一步生长曲线等方法对拯救病毒进行了鉴定.结果表明,试验成功拯救出了RHDV,优化了RHDV感染性克隆的构建过程.     

新城疫病毒(NDV)HN基因真核表达重组质粒的构建

应用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得新城疫病毒(NDV)Lasota株的血凝素神经氨酸酶(HN)基因片段,其长度约为1.7 kb,与已报道的NDV-HN基因片段大小一致.再将该HN基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切和测序鉴定,表明构建的重组质粒含有NDV-HN基因片段.     

猪瘟病毒C株全长cDNA感染性克隆的构建及病毒拯救

 【目的】建立猪瘟病毒研究技术平台,为进一步研究猪瘟病毒C株在细胞中的增殖机制及猪瘟病毒标记疫苗奠定基础。【方法】本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经RT-PCR扩增获得涵盖全长的6个片段,用合适的酶切位点连接,成功构建了C株全长感染性克隆pAC-CS。体外转录得到RNA,然后将其分别转染BHK-21和SK6细胞。拯救的病毒通过上清传代(常规病毒传代)和带毒细胞传毒繁殖。【结果】通过RT-PCR、免疫过氧化酶单层细胞试验和兔体发热试验检测,表明病毒拯救成功。经比较以电转的方式转染SK6的效果较好。通过带毒细胞传代,至12代时病毒滴度稳定达104TCID50?mL-1,而上清传代至第3代时用免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)不能检测出病毒。【结论】成功构建了猪瘟病毒C株感染性克隆;拯救C株时以SK6细胞电转较好;带毒细胞传代培养C株有利于获得较高滴度的病毒。     

禽流感病毒4个亚型一步法多重RT-PCR检测方法研究

为了建立简便、快速的AIV检测方法,根据禽流感病毒H5、H7、H9亚型HA基因和N1亚型NA基因的保守序列,设计了4对RT-PCR引物,对H5、H7、H9、N1 4个亚型进行了多重RT-PCR扩增,通过多重RT-PCR敏感性和特异性试验,建立了多重RT-PCR检测方法;应用所建立的多重RT-PCR方法和病毒分离的经典方法对395份(4省20多个地区)口岸检样进行了平行检测,并对其检测结果进行了比较。结果表明,H5、H7、H9、N1 4个亚型的扩增产物大小分别为380,641,493和328 bp,对NDVI、BV、ARVI、BDV、MDV、FPV扩增均为阴性,平行检测结果完全吻合,说明所建立的多重RT-PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株JXA1反向遗传平台的构建

【目的】为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)的结构功能和致病机理的研究奠定基础。【方法】运用反向遗传技术将HP-PRRSV JXA1株的全基因组分段克隆至改造过的低拷贝载体pOKq上,并在病毒基因组两端分别添加CMV启动子和BGH终止信号肽以及在病毒全基因组第510位核苷酸突变引入Fse I酶切位点,作为遗传标记位点。采取基于DNA-launched途径进行病毒拯救,并对拯救的病毒进行生物学特性分析。【结果】构建的PRRSV JXA1毒株的全长cDNA克隆具有感染性;成功拯救了病毒,命名为rJXA1;成功引入了拯救病毒的遗传标记;拯救病毒与亲本病毒的生长曲线相似,二者达到最高滴度的时间均为感染后72 h。【结论】成功构建了JXA1株反向遗传平台,为进一步研究HP-PRRSV的致病机理、基因功能以及新型疫苗研发奠定了基础。     

一株H9(N2)型禽流感病毒HA基因的克隆与序列分析

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出禽流感病毒(H9亚型)血凝素的cDNA。通过T-A连接将已加A尾的PCR产物连接到线状克隆载体pGEM-Teasy vector,转化J M109感受态细胞,在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆。经PCR扩增,进一步确证为目的片段。对目的片段进行测序,结果获得该毒株的HA基因全长。与已知序列进行同源性比较,同源性最高的可达98%,表明这些分离株的亲缘关系较近;系统发育分析表明,该毒株属欧亚种系;通过血凝素裂解位点的氨基酸序列分析可知,该分离株的HA切割位点上未见到典型的高致病力毒株H5、H7所具有的一系列碱性氨基酸,其排列顺序为-PARSSRGLF-。所克隆的基因为禽流感病毒HA基因芯片的研究奠定了基础,同时为诊断和预防AI提供了理论依据。     

NSP4基因突变的重组牛轮状病毒的拯救及其鉴定

【目的】 通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法,拯救出毒力减弱的轮状病毒(rotavirus, RV)。 【方法】 以野生型轮状病毒CHLY基因组RNA为模板,通过重叠PCR方法在NSP4基因93-104 nt引入5个沉默突变核苷酸,并将毒力位点区135aa、136aa和138aa对应的核苷酸进行定向突变,构建了含有突变位点的转录质粒△pT7-NSP4/89/M。将该质粒与携带RNA聚合酶基因的重组质粒pcDNA3.1/T7-RNAP共转染已接种野生型RV病毒的MA104细胞单层,继续培养24 h,获得了携带NSP4变异基因的RV病毒粒子和野生型RV病毒粒子的混合病毒。将获得的混合病毒接种MA104细胞,通过RNA干扰和蚀斑克隆方法逐步筛选纯化以获得拯救RV。 【结果】 成功拯救出了NSP4基因变异的RV,该病毒在MA104细胞上的病变和致乳鼠腹泻效果较野生型RV明显减弱。【结论】 通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法成功拯救出毒力减弱的RV;NSP4毒力位点135aa、136aa和138aa的变异对RV毒力改变和腹泻严重程度有影响。