转基因油菜TOPAS 19/2质粒分子多家协同实验及不确定度评定

质粒分子是转基因产品核酸定量检测的一类新型标准物质,具有易制备、周期短、成本低等特点。采用实时荧光定量PCR技术,并协同7家实验室对转基因油菜TOPAS 19/2质粒分子进行了基因组的可替代性研究、协同实验研究及不确定度评定。T检验表明,质粒和基因组所产生的内源和外源基因标准曲线的斜率和线性相关系数没有显著性差异。对多家定值的数据进行了统计分析得出,TOPAS19/2质粒分子的量值结果0.910,扩展标准不确定度（K=2）为0.013。     

实时荧光定量PCR检测转基因玉米Bt176测量不确定度分析

应用实时定量PCR方法测定样品中转基因玉米Bt176的含量,并从多个方面来分析测量的不确定度。结果显示,A类不确定度为0.0003,B类不确定度为0.0007,合成不确定度为0.001,有效自由度veff为272,包含概率P为95%,扩展不确定度U=0.002,测量结果为(0.8±0.2)%。不确定度评估结果表明,测量不确定度的主要来源是微量液体转移量的偏差。     

耐除草剂转基因大豆质粒标准分子的构建

以A2704-12、A5547-127、MON89788和GTS-40-3-2等4种商品化耐除草剂转基因大豆为材料,构建质粒标准分子用于解决转基因作物检测时标准物质缺乏现状。采用双酶切技术,将扩增的大豆内参基因和耐除草剂转基因大豆转化体特异性片段克隆至pMD18-T载体上。结果显示,质粒标准分子定性PCR特异性序列片段的LOD均为20copies/μL,定量检测体系Bias最大值≤9.89%,CV最大值≤5.96%,SD最大值≤0.06,实验得到的所有偏差值均在允许范围之内,构建的质粒标准分子适用于4种耐除草剂转基因大豆特异性检测。     

转基因油菜 W-4 fad2基因沉默的种子特异性分析

目的：]研究转基因油菜 W鄄4的种子fad2基因受 RNAi干扰的效果及其器官特异性。[方法]采用实时荧光定量 PCR法分析比较了转基因油菜 W鄄4与非转基因对照 Westar开花后第7、14、21、28天的种子以及越冬期油菜根、茎、叶器官中的 fad2基因的相对表达量。[结果]对照 Westsr种子中 fad2基因的相对表达量随开花后的天数呈逐渐增加的趋势,但W鄄4种子中 fad2基因的相对表达量在开花后第21、28 d较对照 westar显著下降,降幅达到60%。说明转基因油菜 W鄄4在种子发育过程中表达的 fad2基因的 dsRNA干扰了 fad2基因表达。W鄄4与westar在越冬期根、茎、叶器官中fad2基因的相对表达量基本一致,无显著性差异。脂肪酸组成分析结果显示：W鄄4种子中油酸脱饱和指数（ODP）平均为0.07较 Westar的0.24下降了75%;但越冬期根、茎、叶中的油酸脱饱和指数两者无显著差异。研究还发现转基因油菜 fad2基因表达下降的时期与 napin基因表达时期同步,均始于开花后21 d左右。[结论]结果表明转基因油菜中 RNAi干扰 fad2基因表达具有种子特异性,不干扰其它器官的fad2基因表达。表明目标基因的表达受 napin启动子的准确控制。     

转基因油菜 W-4 fad_2基因沉默的种子特异性分析（英文）

目的]研究转基因油菜W-4的种子fad2基因受RNAi干扰的效果及其器官特异性。[方法]采用实时荧光定量PCR法分析比较了转基因油菜W-4与非转基因对照Westar开花后第7、14、21、28天的种子以及越冬期油菜根、茎、叶器官中的fad2基因的相对表达量。[结果]对照Westsr种子中fad2基因的相对表达量随开花后的天数呈逐渐增加的趋势,但W-4种子中fad2基因的相对表达量在开花后第21、28 d较对照westar显著下降,降幅达到60%。说明转基因油菜W-4在种子发育过程中表达的fad2基因的dsRNA干扰了fad2基因表达。W-4与westar在越冬期根、茎、叶器官中fad2基因的相对表达量基本一致,无显著性差异。脂肪酸组成分析结果显示:W-4种子中油酸脱饱和指数(ODP)平均为0.07较Westar的0.24下降了75%;但越冬期根、茎、叶中的油酸脱饱和指数两者无显著差异。研究还发现转基因油菜fad2基因表达下降的时期与napin基因表达时期同步,均始于开花后21 d左右。[结论]结果表明转基因油菜中RNAi干扰fad2基因表达具有种子特异性,不干扰其它器官的fad2基因表达。表明目标基因的表达受napin启动子的准确控制。     

转基因定量检测结果测量不确定度的自上而下评定方法研究及应用

【目的】定量检测标准体系是实施转基因定量标识的基础,而不确定度评定是定量检测标准体系的重要组成部分。急需建立适合一般实验室采用的标准化转基因定量检测结果不确定度的自上而下评定方法,以便检测实验室自行评定定量检测结果的测量不确定度。【方法】测量方法精密度不确定度评定有2种方法,一种是根据“不确定度函数”的一般概念,利用15个不同浓度的常规样品,建立测量方法精密度引入的不确定度评定公式;另一种是重复测量有证标准物质,根据检测数据的中间精密度,计算方法精密度引入的不确定度。用有证标准物质或实验室配制样品作阳性定量质控品进行偏倚不确定度评定,实验室配制样品标称值的不确定度由实验室根据制备过程采用简易程序自行评定。将测量方法精密度引入的不确定度和测量过程的偏倚不确定度合成,评定试样定量结果的标准不确定度,然后乘以包含因子k,获得扩展不确定度。【结果】以转基因玉米DBN9936定量检测方法为例,分别用模拟的DBN9936常规样品和有证基体标准物质（GBW(E)100901）评定测量方法精密度引入的不确定度,分别为0.76%和0.33%,与常规样品相比,用有证标准物质评定的测量方法精密度不确定度显著...     

转基因大豆GTS40-3-2定量测定的不确定度分析

为了迅速在转基因生物检测实验室推广测量不确定度评定工作,对转基因大豆定量检测结果的不确定度进行了初步评定。结果表明,A类不确定度(uA)为0.000 8,B类不确定度(uB)为0.002,合成不确定度(uC)为0.002;在置信水准为95%时,包含因子(k)取1.96,扩展不确定度(U)为0.02。不确定度评估结果表明,微量液体转移量的偏差是本次测量不确定度的主要来源,在以后的转基因生物检测中,应尽量减小微量液体转移的偏差。     

LC-MS/MS法测定动物源食品中呋喃西林代谢物不确定度的评定

利用LC-MS/MS法对动物源性食品中呋喃西林代谢物SEM残留量的不确定度进行分析评定,结果表明:测定添加水平0.50μg/kg的硝基呋喃类代谢物残留量的结果可表示为:X(SEM)=(0.51±0.06)μg/kg,包含因子k=2。     

采用蒙特卡洛法评定转基因玉米DAS-4-40278-9的测量不确定度

不确定度传播律(GUM法)是分析测量领域里常用的测量不确定度评定方法,但该法存在输出量为正态分布假设等诸多局限。为了在转基因成分检测试验中提供一种更优和更适合的测量不确定度评定方法,采用蒙特卡洛法(MCM)评定混合样品中转基因玉米DAS-4-40278-9的测量不确定度。结果表明,转基因玉米DAS-4-40278-9的相对含量平均值为1%,不确定非常小(3.07×10^-4)。在95%的包含概率下,转基因玉米DAS-4-40278-9的相对含量检测值落在较窄的包含区间0.94%~1.06%。结果显示,混合样品中转基因玉米DAS-4-40278-9的相对含量的概率密度分布呈正态分布,与用GUM法关于“输出量概率密度函数为正态分布”的假设一致。由于MCM法可避免传统GUM法的局限性,建议在开展转基因成分测量不确定度评定时可采用MCM法。     

转基因油菜筛查阳性质粒分子的研制及应用

【目的】转基因油菜是四大转基因作物之一,是中国转基因生物安全监管的重要对象,转基因检测为转基因安全监管提供技术支撑。转基因筛查是转基因检测的第一步,筛查靶标设置不合理会导致漏检部分转基因成分。建立转基因油菜筛查策略,并研制与筛查策略配套的阳性质粒分子,将为中国的转基因油菜安全监管提供强有力的技术支撑。【方法】通过收集数据库中登记的转基因油菜品种的外源基因元件信息,分析转基因油菜品种中常用的调控元件和标记基因,基于最大筛查覆盖率原则,确定转基因油菜的筛查靶标。通过检索数据库或查询专利,收集筛查元件的核苷酸序列。一个筛查元件通常有多个标准方法,查阅各筛查元件的检测标准,分析各标准中普通PCR引物对和实时荧光PCR引物/探针组合在筛查元件核苷酸序列中的位置,根据引物探针的结合位点,确定拟构建到质粒上的各筛查元件的核苷酸序列。人工合成各筛查元件和油菜内标基因的融合序列,克隆到常用质粒pUC18,构建阳性质粒分子。采用各筛查元件的普通PCR和实时荧光PCR方法,评估阳性质粒分子的适用性。【结果】建立了转基因油菜的筛查策略,通过检测CaMV 35S启动子、FMV 35S启动子、Bar、PAT、CP...     

PCV2套式PCR检测方法的建立及应用

根据猪圆环病毒2型GD株及已发表的PCV2的全基因组序列,设计1对PCV2型特异性引物,对可疑病料进行PCR扩增。将扩增产物连接到pMD 18-T载体上并克隆到大肠杆菌DH5α中,提取质粒进行套式PCR、酶切、测序鉴定,结果扩增出了PCV2的目的片段。将测序结果与GenBank收录的PCV2序列进行比较,发现同源性均在90%以上。用该PCR方法对287个猪场的1 560份样品进行了检测,其中983份为PCV2阳性,阳性率为63%。     

辽宁省猪源弓形虫虫株分离与鉴定

以采自辽宁省某屠宰场2 063头猪的血清和心脏组织为试验材料,采用改良凝集试验(MAT)对血清进行定量检测和弓形虫虫株分离,结果显示:2 063份猪血清中阳性血清(滴度≥25)共计233份,阳性检出率为11.3%;选取阳性抗体滴度≥100所对应的67份猪心脏组织进行弓形虫虫株分离,结果从猪心脏组织中共分离出23株弓形虫虫体,分离率为34.3%。此结果提示,辽宁地区猪弓形虫感染率较高,对该地区人们的健康存在潜在威胁。     

甘蔗Cu/Zn-SOD的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）基因,并分析其序列特征、组织特异性表达及在不同逆境胁迫下的表达模式。【方法】以甘蔗桂糖28号为材料,利用RT-PCR技术克隆获得Cu/Zn-SOD,采用生物信息学方法分析所推测的氨基酸序列,通过实时荧光定量PCR研究Cu/Zn-SOD在不同组织及逆境条件下的表达情况。【结果】克隆获得甘蔗Cu/Zn-SOD,NCBI登录号为JQ958328,其开放阅读框为456 bp,编码151个氨基酸,与禾本科植物聚于同一进化分支。实时荧光定量PCR分析表明Cu/Zn-SOD在根、茎、叶中均有表达,为组成型表达,在叶中表达量最高;Cu/Zn-SOD在聚乙二醇（PEG）、NaCl、低温（4℃）和H2O2四种非生物胁迫下均诱导表达,表达模式因调控机制的不同而异。【结论】克隆获得Cu/Zn-SOD,其主要在甘蔗绿色组织中表达,其在铜/锌SOD超氧化物歧化酶的功能区域保守型很高,可能与甘蔗抵御渗透胁迫相关。     

柱型苹果MdCoLBD1/2基因生物信息学及SNP分析

柱型苹果(Columnar apple)是苹果株型育种的珍贵资源.利用同源基因克隆方法,以柱型苹果"威塞克旭"一年生枝上休眠期芽cDNA为模板,克隆得到了LOB DOMAIN家族(LBD)的2个同源基因,命名为MdCoLBD1/2,分别编码195和240个氨基酸.该基因有LBD家族的典型结构域,如C盒、GAS盒、亮氨酸拉链(Leu zipper)结构以及LOB Domain区域等.MdCoLBD1/2分别定位于第10条染色体Chr10:18985568..19005801和MdCoLBD2 Chr10:18985594..19005850区间.MdCoLBD1/2与白梨、葡萄、草莓、椰子、梅、核桃的氨基酸的相似性均在60%以上.聚类分析表明MdCoLBD1和白梨、梅、草莓亲缘关系较近,MdCoLBD2与葡萄、核桃亲缘关系较近,MdCoLBD1/2与亚洲棉、陆地棉的聚类关系均较远.通过测序分析了MdCoLBD1/2基因在30个不同类型材料中的碱基序列差异,得到MdCoLBD1有8个碱基差异位点,MdCoLBD2有5个碱基差异位点.