小麦大龄幼胚再生性能改进与农杆菌转化

 【目的】小麦幼胚再生率与幼胚大小关系密切,改进小麦大龄幼胚再生性能促进小麦转基因研究。【方法】以18个普通小麦基因型和5个硬粒小麦基因型为材料,对其开花授粉后15—17 d的大龄幼胚进行破碎处理、组织培养和农杆菌转化,对转化后的幼胚组织和获得的抗性再生植株分别进行组织化学染色检测和PCR检测。【结果】大龄幼胚培养2 d后破碎处理的再生率为18.2%,显著高于完整胚对照(.7%),培养2 d后进行破碎处理的再生效果高于4和6 d后破碎处理;不同基因型小麦大龄幼胚破碎处理后再生率为16.9%—46.7%,其中,Bobwhite和中8423大龄幼胚再生率达到了40%以上;大龄幼胚破碎后在弱光条件下培养,再生率进一步提高,较对照(完整胚黑暗培养)提高5.4%—47.4%;农杆菌侵染后GUS瞬时表达率为0—76.7%,其中科农199高达76.7%,其次为Verry(64.4%)和Alondra(47.2%);经PCR检测,农杆菌转化小麦大龄破碎幼胚获得了候选转基因植株。【结论】破碎处理和弱光培养显著提高了小麦大龄幼胚再生率,比对照提高5—10倍;科农199、Verry和Alondra大龄幼胚对农杆菌侵染比较敏感,适宜作为农杆菌转化的受体材料;农杆菌转化小麦大龄幼胚可以获得转基因植株。     

农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化的几个影响因素研究

为研究农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素,以2个小麦品种石4185、科麦一号的成熟胚为转化受体材料,分别以GV3101、EHA105、LBA4404等3种农杆菌菌株(含有p CAMBIA1380双元载体)为供体材料进行转化,主要检测成熟胚愈伤组织β-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因的表达情况。结果表明,不同小麦品种对转化体系的反应各不相同,菌株、受体的基因型以及外植体的继代时间和生理状态等均对转化效率有很大的影响。GV3101的侵染转化效果优于另外2个菌株,石4185成熟胚愈伤对农杆菌侵染的敏感性比科麦一号要高。继代培养时间的延长会不同程度地影响小麦成熟胚愈伤的转化效果。通过对转化体系几个影响因素的研究,有助于提高农杆菌介导成熟胚转化体系的效率。     

农杆菌介导小麦成熟胚体系的优化

针对转基因小麦成熟胚转化体系转化效率低,从提高成熟胚愈伤组织质量入手,调节小麦的基因型、成熟胚的培养时间、菌液浓度、侵染时间以及愈伤组织大小几个因素,提高成熟胚转化体系的转化效率;通过农杆菌介导,将目的基因转入到受体小麦成熟胚诱导的愈伤中,利用gus检测的方法检验转化效率;继代360d、自然生长5mm大小的受体小麦品种扬麦10,在菌液浓度OD600为0.8,侵染40min下,gus基因表达率达50%左右,接近幼胚的gus基因表达率。通过对体系的几个因素的调节,提高了农杆菌介导成熟胚转化体系的效率。     

抗氧化剂对橡胶树胚状体农杆菌侵染效果的影响

以体细胞胚为侵染受体,通过在共培养基添加抗氧化剂来研究抗氧化剂对橡胶树农杆菌侵染效率的影响。结果表明,参试的4种抗氧化剂中,GUS基因瞬时表达效率高低顺序为硝酸银二硫苏糖醇L-半胱氨酸硫代硫酸钠,共培养基中添加20 mg/L硝酸银的GUS瞬时表达率最高,染色总胚数最高达96.7%,显著高于对照76.7%。因此,抗氧化剂的应用有助于提高体细胞胚的农杆菌侵染效率。     

不同大豆品种对农杆菌EHA105和GV3101敏感性及共培养条件的优化

不同的大豆品种对于农杆菌的敏感性不同,易感型的品种更有利于转化的进行。为了进一步优化大豆转化体系,实验利用农杆菌菌株EHA105、GV3101对东农50等10个大豆栽培品种进行敏感性测定。同时对2个易感性品种,东农50、中豆32共培养中添加光照处理,统计GUS染色率。结果表明,农杆菌GV3101的侵染能力较强,10个品种的平均GUS染色率达到66.7%,远远高于EHA105的平均值(38.4%);2个菌株对中豆32和东农50进行侵染,GUS染色率平均达到69.93%和73.62%,其他品种的GUS平均染色率显著低于东农50和中豆32;但个别品种对2个菌株的敏感性差异显著,在大豆遗传转化中对于品种和菌株的选择具有重要的意义。农杆菌的侵染时间为30~60min时效果较好;在共培养阶段进行光照处理有利于提高转化率。     

小麦成熟胚再生体系优化效果评价及高再生率基因型筛选

为了对小麦成熟胚的再生优化体系进行培养效果评价及筛选高再生率基因型,以7个小麦品种成熟胚为材料,采用常规和优化2种培养基体系,研究3种胚处理方式对成熟胚出愈率、分化率及再生率的影响。结果表明:优化培养基体系组织培养效果显著优于常规培养基体系;胚处理方式与基因型之间可能存在一定的互作关系,特定基因型品种采用不同胚处理方法,其组织培养效果差异明显,且不同品种的最适胚处理方式可能不同。在供试的7个品种中,矮抗58、济麦22、百农419、百农160和周麦22在经完整胚法处理,分化率均达到50%以上,再生率均达到25%以上,其中以矮抗58和百农160最优,再生率分别达到51.74%、43.84%。而采用纵半切略带胚乳法时,宝丰7228和中麦175的分化率和再生率均较完整胚法有了较大提升,分别达到62.89%、56.79%和26.88%、36.75%。说明特定基因型品种须要找到最适合的胚处理方法,以充分挖掘其再生能力,获得的高再生率小麦品种可用于遗传转化研究。     

具有高再生性且对农杆菌C58敏感玉米自交系材料的筛选

以70个优良高代玉米自交系的幼胚为材料进行离体培养,从中筛选出胚性愈伤组织诱导率高、克隆力强的10个自交系,将其一部分胚性愈伤组织用作分化,研究其再生能力;另一部分用农杆菌C58转化,利用植物载体中携带的GUS报告基因的瞬时表达研究玉米基因型对农杆菌的敏感性.结果表明,10个自交系都具有再生能力,自交系6010、6060、6038、6051和6015的分化力相对较高.玉米基因型对农杆菌的敏感性存在极显著差异,其中自交系6051最敏感,而6034、6038对农杆菌不敏感.因此认为自交系6051、6015、6010和6060是再生能力强且对农杆菌C58敏感的自交系材料.     

基因型对橡胶树胚状体遗传转化瞬时表达影响的研究

侵染后抗性胚状体诱导频率低是影响橡胶树遗传转化发展的主要原因,而橡胶树次生体胚发生体系具有体胚增殖效率及植株再生率高的优点。以3个综合性状优良的橡胶树无性系次生体细胞胚状体为受体,研究其对根癌农杆菌的耐侵染能力、GUS基因的瞬时表达情况,探讨不同无性系胚状体对农杆菌转化的反应。结果表明:3个无性系农杆菌污染情况无显著差异,长菌的外植体经无菌水和抗生素水洗涤3 d后即可恢复生长;侵染后每30个胚褐化了1.2～5个胚,占侵染总胚数的4.00%～16.67%,品种间褐化面积无显著差异;热研87-6-62的总蓝斑数显著高于其它2个无性系,平均每个胚染上14.29个蓝斑,热研7-33-97和PR107稍差,但每个胚也能分别染上8.14和8.72个蓝斑。因此3个无性系均可以胚状体作为遗传转化的受体。此结果对利用胚状体为受体改良橡胶树优良无性系奠定良好基础。     

具有高再生性且对农杆菌C58敏感的玉米自交系材料的筛选

以70个优良高代玉米自交系的幼胚为材料进行离体培养，从中筛选出胚性愈伤组织诱导率高、克隆力强的10个自交系，将其一部分胚性愈伤组织用作分化，研究其再生能力；另一部分用农杆菌C58转化，利用植物载体中携带的GUS报告基因的瞬时表达研究玉米基因型对农杆菌的敏感性。结果表明，10个自交系都具有再生能力。自交系6010、6060、6038、6051和6015的分化力相对较高。玉米基因型对农杆菌的敏感性存在极显著差异，其中自交系6051最敏感，而6034、6038对农杆菌不敏感。因此认为自交系6051、6015、6010和6060是再生能力强且对农杆菌C58敏感的自交系材料。     

优良小麦转基因受体品种的筛选及成熟胚半胚培养的研究

为了筛选具有良好组织培养特性的优良小麦品种作为转基因受体,使转基因小麦能尽快得到应用,对4个小麦品种的幼胚和成熟胚以及7个小麦品系的成熟胚进行离体培养,考察其组织培养特性.结果表明,11个品种(系)的成熟胚成愈率都达90%以上,但不同成熟胚来源的愈伤组织的植株再生率存在很大差异:7个小麦品系的植株再生率都低于20%,而4个小麦品种的植株再生率都达35%以上,幼胚成愈率及植株再生率都分别达90%和62%以上.该研究为小麦的遗传转化提供了几个新的优良受体品种.该研究进行成熟胚培养时,采用半胚培养的方式,一方面有效地克服了成熟胚在诱导培养基上直接萌发的现象,另一方面提高了成熟胚来源的愈伤组织分化为多苗的能力.该再生体系可作为小麦胚培养的参考.     

Dicamba and Sugar Effects on Callus Induction and Plant Regeneration from Mature Embryo Culture of Wheat

To establish a highly efficient plant regeneration system for wheat genetic transformation, the effects of three different concentrations of dicamba and two different sugar types on callus induction and plant regeneration from mature embryo cultures were evaluated. Callus induction and plant regeneration were obtained from mature embryos of two commercial cultivars Zhoumai 18 and Yumai 34 （Triticum aestivum L.） cultured on L3 basal medium. The results showed that the efficiency of mature embryo culture was significantly influenced by the genotypes, sugar types and dicamba concentrations. 4 mg L^-1 dicamba proved the best effective for inducing embryogenic callus and also gave the highest proportion of plants regenerated across the two cultivars. Substitution of maltose by sucrose significantly improved the plant regeneration efficiency in both cultivars. There was a significant interaction between genotype-by-sugar types, and sugar types-bydicamba concentrations. Overall, Zhoumai 18 gave the highest frequency of plant regeneration （82.65%） when dicamba concentration was 4.0 mg L^-1 and with sucrose in initial callus induction. These results will facilitate genetic transformation work with elite wheat.     

Establishment of a Highly Efficient Regeneration System for the Mature Embryo Culture of Wheat

Establishment of a highly efficient regeneration system for the mature embryo of wheat will provide a convenient tool for wheat tissue culture and transformation,thereby facilitating the transformation of foreign genes into wheat.By using the mature embryos derived from 20 different wheat lines including Shi 4185,Yumai 66,Lunxuan 987,CB037,Yangmai 6,Xinchun 9,Bobwhite,Han 6172,Zheng 9023,Jimai 20,Ningchun 4,and Jing 411,the effects of some factors including inoculation methods,initiating culture media,organic additives,antioxidants,and auxins on the regeneration from the explants were evaluated.The results indicated that the scraping embryo culture was better than the whole embryo culture,the Aa medium was better than the SD2 medium and dicamba was better than 2,4-D in increasing the regeneration frequency.An Adi medium was established in this study by adding silver nitrate,cysteine,ascorbic acid,dicamba,glutamine into the Aa medium at the concentration of 4,40,100,2,and 5 mg L-1,respectively.By using the Adi medium and the scraping technique,the regeneration frequencies of the mature embryos of CB037,Lunxuan 987,Han 6172,Yangmai 6,Bobwhite,Zheng 9023,Shi 4185,and Jimai 20 became 85.6,60.1,46.0,42.1,42.0,34.0,33.0,and 32.0%,respectively,which were about 5-8 times higher than that obtained from the conventional culture mediums and techniques.This novel regeneration system could be helpful in wheat transformation.     

不同培养基及激素配比对小麦成熟胚离体培养的影响

[目的]建立适于优良小麦品种遗传转化的高效组织培养再生体系。[方法]以小麦品种豫麦18和豫麦70成熟胚为外植体,探讨了2种培养基和4种激素配比对小麦成熟胚离体培养的影响。[结果]L3培养基的平均愈伤组织诱导率和分化率都明显高于MS培养基,供试2个品种平均出愈率达91.0%以上,平均分化率达46.4%。不同激素及其配比均可诱导小麦成熟胚愈伤组织分化,但不同处理分化率差别很大(10.5%~50.0%);以L3为分化培养基,同时添加2,4-D 0.1mg/L,6-BA 1.5 mg/L的激素配比更有利于愈伤组织的分化,平均分化率达到50.0%。[结论]MS、L3两种基本培养基对小麦成熟胚愈伤组织诱导率均比较高,且差别不大。不同激素配比对小麦成熟胚愈伤组织分化率影响很大。     

小麦成熟胚高频再生基因型筛选及再生体系研究

以目前生产上主栽或主推的、具有优良农艺性状的18个黄淮麦区冬小麦品种(系)和2个西北春麦区春小麦品种为材料,对它们成熟胚再生能力进行比较,从中筛选出再生频率高的基因型,并探讨不同接种方法、麦草畏质量浓度、细胞分裂素和干燥处理等对小麦成熟胚愈伤组织诱导和分化频率的影响。结果表明,小麦成熟胚愈伤组织诱导率普遍较高,为66.7%～100.0%,而分化率普遍较低,为3.6%～35.8%。基因型间差异显著,其中愈伤组织分化率较高的基因型有泛麦8号、周麦27和邢麦6号,绿苗分化率超过30%;采用胚十字形切割法接种小麦成熟胚愈伤组织分化率较高,达到54.5%～73.3%;诱导培养基中麦草畏的诱导效果显著优于2,4-D。在麦草畏质量浓度为2～4mg/L时有利于愈伤组织诱导和分化;成熟胚愈伤组织转入不含激素或含有2mg/L 6-BA或KT的分化培养基中时,分化率分别达到38.5%,45.8%和37.0%,较其他细胞分裂素和质量浓度处理分化率高,而愈伤组织分化前干燥处理6h和未干燥处理的差异不显著,干燥12h分化率明显降低。     

不同预处理对小麦成熟胚愈伤组织形成的影响

研究了低温、CaCl2 、PEG 3种预处理对 18个小麦品种成熟胚愈伤组织形成的影响 ,结果表明 :不同预处理对小麦成熟胚愈伤组织的形成有显著影响。PEG处理对小麦成熟胚愈伤组织的形成具有显著促进作用 ;低温和CaCl2 溶液处理对小麦成熟胚愈伤组织的影响和小麦品种关系密切 ,品种间差别较大。     

小麦成熟胚再生体系及基因枪转化的初步研究

以小麦品种晋麦2148的成熟胚为外植体,消毒后用解剖刀刨碎,接种于MS+VB5+11.2g·L-1葡萄糖+2mg·L-12,4D+8g·L-1琼脂糖的培养基中诱导愈伤组织,将诱导3周的成熟胚愈伤组织接种到胚状体成熟培养基(MS+VB5+11.2g·L-1葡萄糖+0.2mg·L-1IAA+8g·L-1琼脂糖)中培养4-8周,然后转接到再生培养基(1/2MS+VB5+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂糖)中进行再生成苗.接种1200块成熟胚,得到1123块愈伤组织,最终形成258株再生苗,再生率为21.5%.在建立了再生体系的基础上,用基因枪介导法将GUS基因导入成熟胚愈伤组织,Xgluc染色表明,GUS基因已经在小麦成熟胚愈伤组织中表达.将100块愈伤组织用Xgluc染色,29块愈伤组织出现肉眼可见的蓝色小点.     

小麦成熟胚组织培养体系优化及优良转化受体基因型的筛选

为建立适于优良品种遗传转化的高效组织培养体系,本研究以3种山东省推广小麦品种（济麦19、良星99、鲁麦14）和模式品种Bobwhite为材料,以成熟胚为外植体对其愈伤组织进行诱导和分化,探讨了2,4-D不同浓度下的3种诱导培养基（MS、N6、MSB5）和4种激素配比的分化培养基对小麦成熟胚离体培养的影响。结果表明,N6培养基的诱导效果最好,平均诱导率超过了80%,且当2,4-D的浓度为4 mg/L时诱导效果最佳。4种激素配比均可诱导小麦成熟胚愈伤组织分化,但分化率较低且处理之间差别较大,添加0.5mg/L IAA和2 mg/L ZT的MS培养基的平均分化率最高,为22.58%。小麦基因型的差别主要影响其分化率的高低而对诱导率的影响不大,3个品种中用于转化的最佳品种为鲁麦14。     

不同小麦品种成熟胚愈伤组织诱导及分化的研究

以长江流域及华中地区推广的24个小麦品种为材料，分析、比较其成熟胚在3种诱导培养基和1种分化培养基上的愈伤诱导和分化频率。结果表明：不同诱导培养基在愈伤诱导率上存在显著差异，添加ABA的MB5培养基诱导效果最佳；不同小麦品种对培养条件的反应不同，华9943、华9914等4个品种在3种培养基上的诱导频率相同，而其余品种在3种培养基上的愈伤诱导率差异极显著。在分化绿点和成苗率上，品种间差异十分明显，农大146、苏麦6号、扬麦158、华麦12号和华麦8号的再生力强。因此，在小麦成熟胚培养中，筛选优良的基因型培养基组合是必要的。