谷氨酸棒杆菌中苯酚羟化酶的鉴定及功能研究

【目的】鉴定谷氨酸棒状杆菌中ncgl 2588基因编码的苯酚羟化酶,并验证其在苯酚降解中的作用。【方法】构建谷氨酸棒状杆菌ncgl 2588基因缺失突变株,比较突变株和野生型菌株利用苯酚能力的差异;同时将ncgl 2588基因克隆到表达质粒pET28a中并转化入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导重组菌株原核表达,纯化并测定重组蛋白对苯酚的羟化作用。【结果】成功构建了谷氨酸棒状杆菌ncgl 2588基因缺失突变株,其在以苯酚为惟一碳源和能源的培养基中不能生长,而野生型谷氨酸棒状杆菌能正常生长;pET28a-ncgl 2588重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达分子质量为73ku的目的蛋白,此蛋白酶活为0.37mmol/(min·mg);在以苯酚为惟一碳源和能源培养谷氨酸棒状杆菌时,苯酚羟化酶得到最高表达,用其他芳香族化合物培养则苯酚羟化酶表达较少;进化树分析发现,谷氨酸棒状杆菌中的苯酚羟化酶与酵母Trichosporon cutaneum中的苯酚羟化酶序列同源性高达43%,远远高于与细菌中苯酚羟化酶的同源性。【结论】谷氨酸棒状杆菌中的ncgl 2588基因编码苯酚羟化酶,且该酶为可诱导酶,在苯酚降解中发挥着重要作用。     

拟南芥MPK3、MPK4、MPK6在酵母hog1?中的渗透调节作用

【目的】研究拟南芥MAPK信号转导途径的关键基因MPK3、MPK4、MPK6的功能,明确其在渗透调节中的作用。【方法】构建拟南芥MPK3、MPK4、MPK6的酿酒酵母表达载体,遗传转化酿酒酵母渗透调节功能丧失的hog1?突变体,筛选得到阳性转化子,并分析其在渗透胁迫下的表型特征。【结果】扩增得到了拟南芥MPK3、MPK4、MPK6的全长cDNA序列,构建了上述3个基因的表达载体,并筛选得到了3个基因的阳性转化子。在1 mol•L-1 KCl、0.3 mol•L-1 LiCl、1 mol•L-1 NaCl、1 mol•L-1 Sorbitol的盐胁迫处理下,阳性转化子生长状态良好,与野生型的表型基本一致,均恢复了hog1?对盐胁迫的抗性。在盐胁迫处理下,hog1?细胞形态异常且体内甘油含量较野生型低,而转化子的形态和体内甘油含量均恢复到正常的表型。【结论】MPK3、MPK4、MPK6均能够使酿酒酵母渗透调节功能丧失突变体hog1?恢复对盐胁迫的抗性,具有渗透调节的功能。     

小麦条锈菌GMPP基因克隆及其产物糖转运功能分析

【目的】探讨条形柄锈菌小麦专化型真菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici,Pst）中预测编码甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶（mannose-1-phosphate guanylyltransferase,GMPP）基因产物的糖转运功能。【方法】基于Pst转录组数据与NCBI中17个Pst基因组比对结果设计引物，筛选和克隆Pst的GMPP基因，命名为PsMT1，构建表达载体并导入酵母己糖转运缺失突变体EBY.VW4000，对获得的pDR196-PsMT1-EBY.VW4000重组酵母菌进行糖吸收功能互补测定。【结果】PsMT1基因的编码区为1 245 bp，编码414个氨基酸，等电点为6.05。构建的无根进化树显示PsMT1与小麦秆锈菌的GMPP单独聚为一个分支。在酵母己糖转运功能缺失突变体中表达PsMT1能恢复EBY.VW4000菌体在D-甘露糖为唯一碳源的固体培养基上生长。【结论】克隆了Pst的PsMT1基因，其异源表达产物具有转运甘露糖的功能，为研究糖转运蛋白介导Pst-小麦互作的机制奠定基础。     

mleA基因在酿酒酵母中的整合型表达

 【目的】进行中国自行筛选的专利菌种酒酒球菌 SD-2a（Oenococcus oeni SD-2a）的苹果酸－乳酸酶基因在酿酒酵母中的整合型表达,使葡萄酒生产过程中的酒精发酵和苹果酸－乳酸发酵（malolactic fermentation,MLF）同时进行。【方法】克隆Oenococcus oeni SD-2a的苹果酸－乳酸酶基因mleA,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以酵母整合型质粒YIp5为载体,构建重组表达质粒pYILmleA,并转化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YS59,经筛选鉴定获得酵母转化子YS59/pYILmleA。进行转化子的营养缺陷型和交配型鉴定、菌落PCR鉴定、SDS-PAGE检测及斑点杂交检测,并对酵母转化子培养上清液进行L-苹果酸及L-乳酸含量的HPLC分析,检测目的基因的功能性表达。【结果】转化子的营养缺陷型和交配型鉴定、菌落PCR鉴定表明获得了阳性转化子;SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了目标蛋白,斑点杂交检测表明目的基因整合到受体菌中。模拟发酵表明mleA基因整合到受体菌中后进行了功能性表达,将培养基中的L-苹果酸转化成L-乳酸,使得培养液中的L-苹果酸含量极显著降低。转化子YS59/pYILmleA在添加5 648 mg?L-1 L-苹果酸和10%葡萄糖的SD/-Ura培养基中培养4 d,培养液上清中L-苹果酸的剩余含量与空载体转化子YS59/YIp5（对照）差异极显著,苹果酸的相对降低率为20.18%～20.85%。供试的转化子L-乳酸生成量为1 278～1 312 mg?L-1,对照未检出乳酸的生成。【结论】中国自主筛选的专利菌种O.oeni SD-2a的mleA基因的整合型表达质粒构建成功并在酿酒酵母中进行了功能性表达。     

FaGST基因过量表达获得拟南芥转基因植株

【目的】探明FaGST基因的功能和分子调控机制,为其后期的抗性利用与研究提供科学依据。【方法】利用前期构建的pCAMBIA1300-35S空载体和pCAMBIA1300-35S-FaGST过表达载体,将其转化感受态(DH5α)细胞后导入农杆菌GV3101,利用花序侵染法转化拟南芥,通过潮霉素(Hyp)进行筛选、PCR鉴定,并利用实时荧光定量PCR检测其表达量。【结果】FaGST基因成功导入拟南芥中,获得6株空载体转基因拟南芥植株和8株转FaGST基因拟南芥植株;8株转基因拟南芥植株的FaGST基因表达量为1.31～2.06,较野生型拟南芥植株表达量（1.00）显著或极显著提高。【结论】成功获得拟南芥转基因纯合植株,FaGST基因在拟南芥植株中已过量表达。     

利用 CRIS PR/Cas9 技术创制水稻中花 11 号 dwarf1 突变体

【目的】水稻异源三聚体 G 蛋白 α 亚基在植物生长与逆境应答中具有重要的生物学功能,在 水 稻中花 11 号品种中创制 Gα 蛋白编码基因 DWARF1（D1）的突变体,为水稻功能基因组学研究提供材料。 【方法】在中花 11 号的 D1 基因座位上设计靶向其外显子的 sgRNA 序列,构建 CRISPR/Cas9 载体,转化中花 11 号胚愈伤组织,经过抗性愈伤组织筛选和诱导分化后,对再生植株进行鉴定。【结果】筛选到 3 个含有不同编 辑形式的 d1 突变株系,实时荧光定量 PCR 分析发现,D1 mRNA 水平显著降低,表明无义突变介导的 D1 mRNA 降解过程亦被触发。在 3 个 d1 突变株中进一步鉴定到不含潮霉素抗性基因、不含载体骨架的植株,繁育后可以 得到无转基因痕迹、稳定遗传的 d1 敲除植株。对 d1 突变株的生长、发育情况进行观察发现,中花 11 号背景下 d1 突变株显著变矮、穗明显变小,株高和穗长为中花 11 号野生型的 50%~60%。种子变小及变圆,同时,种子 长宽比和千粒重降低约 40%。【结论】获得有效移码突变的中花 11 号背景 d1 突变株系,为进一步研究 G 蛋白 及其相关基因的功能创制遗传材料。     

水稻qPC1基因启动子功能性变异位点的鉴定及其转运功能

【目的】鉴定水稻种子中蛋白质含量的正调控基因qPC1启动子的功能性变异位点,开发qPC1基因分子标记,并解析其转运功能,为阐明qPC1基因的生物学功能及其利用qPC1基因进行分子育种提供理论依据。【方法】采用基因定点突变、水稻原生质体瞬时转化技术和双荧光素酶报告法鉴定qPC1基因启动子功能性变异位点,利用缺陷型酵母互补试验以及水稻根部氨基酸的吸收试验解析qPC1的转运功能。【结果】相对于南洋占qPC1序列,珍汕97 qPC1启动子-7～-12 bp位置处6个碱基(CACAGA)的缺失将导致其启动子活性显著增加。对此设计对应的功能性分子标记PB13,并利用PCR技术在珍汕97与南洋占的重组自交系群体中进行验证。在缺陷型酵母互补试验中发现qPC1蛋白能够转运γ-氨基丁酸、瓜氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸和谷氨酸等多种氨基酸,且发现qPC1能促进水稻根对多种氨基酸的吸收,并对苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸和酸性氨基酸具有较快的吸收与转运速率。【结论】水稻qPC1基因启动子区-7～-12 bp位置为其功能性变异位点,qPC1在酵母中能够参与多种氨基酸转运,且在水稻根中能促进氨基...     

小麦酰脲通透酶基因TaUPS2.1-D的克隆及等位变异分析

【目的】明确小麦酰脲转运蛋白TaUPS2.1-D的亚细胞定位及其在不同小麦品种中的等位变异。【方法】克隆了小麦TaUPS2.1-D基因,构建了TaUPS2.1-D与绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达载体,通过转化烟草叶片阐明了TaUPS2.1-D的亚细胞定位。对TaUPS2.1-D基因在几千个小麦品种中的变异位点及其变异频率进行分析。【结果】TaUPS2.1-D基因在细胞质膜和内质网上均有明显表达。TaUPS2.1-D基因的等位变异位点变异频率均较低,可见该基因在不同小麦品种中功能相对保守。【结论】小麦酰脲转运蛋白TaUPS2.1-D是一种跨膜转运蛋白,且功能较为保守。     

野生巨大口蘑1株新菌株ITS鉴定及菌丝培养基优化

【目的】鉴定1株巨大口蘑Tricholoma giganteum新的野生菌株,并优化其菌丝的最适培养基.【方法】以1株野生巨大口蘑为研究对象,采用组织分离法,从野生巨大口蘑子实体中分离纯化得到纯菌丝,利用分子生物学方法进行鉴定,通过测定菌丝生长速度、菌丝长势等指标对其进行培养条件研究,并运用均匀设计法对培养基进行优化,采用二次多项式逐步回归方法对试验结果进行分析.【结果和结论】该野生菌株经鉴定为巨大口蘑,Gene Bank编号为JX193694,命名为SCAU3,其菌丝生长的最适温度为30~32℃,最适p H为7~8,最佳碳源为麦芽糖,最佳氮源为酵母膏.经均匀设计法优化得到最适培养基组合:麦芽糖26 g·L-1,酵母膏2 g·L-1,Mg SO42.7 g·L-1,KH2PO41.8 g·L-1,维生素B1 16 mg·L-1,p H7.7.     

STK1基因对山梨醇高渗胁迫下玉米大斑病菌菌丝生长和发育的调控

【目的】明确STK1基因在山梨醇高渗胁迫条件下对玉米大斑病菌菌丝生长和发育的调控作用。【方法】将野生型菌株(WT)与STK1基因敲除突变体(KO)分别接种在不同山梨醇浓度的葡萄糖-蛋白胨(DPA)培养基上,对比其生长速度、菌落形态、菌丝形态的差异变化;并通过油红O染液进行菌丝细胞脂肪染色,观察脂类物质沉积的形态学变化。【结果】山梨醇高渗胁迫显著抑制了野生型菌株(WT)的菌落生长速度,但1.0 mol/L山梨醇对STK1基因敲除KO菌株的生长有显著的促进作用,这种促进作用随着山梨醇浓度的增加而迅速降低,山梨醇浓度增加至1.5~2.0mol/L时,菌落生长速度受到显著抑制,并且抑制程度显著高于WT菌株。显微观察菌丝细胞内容物,发现山梨醇高渗胁迫后,KO菌株的颗粒状物明显少于WT菌株。利用油红O染色观察菌丝细胞的脂类物质沉积情况,发现在山梨醇高渗胁迫条件下,KO菌株的脂滴数量远远少于WT菌株。【结论】山梨醇胁迫具有与盐胁迫不同的渗透调节机制,STK1基因可能通过调节脂类物质的合成及分布调控对山梨醇高渗透胁迫的调节。     

水培条件下硫素营养对粳稻米质的影响

 【目的】探讨水培条件下,硫素营养对粳稻稻米品质的改善作用,明确其品质指标随硫素浓度改变而变化的规律,以期提高人们对硫肥的重视,为硫肥的精确合理施用奠定理论基础。【方法】以粳稻武粳15和武育粳3号为材料,采用水培法,研究硫素营养对粳稻稻米品质指标的影响。【结果】在适宜营养液硫浓度下,武粳15和武育粳3号的稻米品质得到显著改善。武粳15和武育粳3号分别在200 μmol?L-1和260 μmol?L-1硫浓度处理下,加工品质、外观品质指标得到显著改善,与对照相比,胶稠度分别增加了12.1 mm和8.4 mm。在米粉糊化特性上,武粳15在200 μmol?L-1硫处理的米粉峰值粘度较对照增加143 cP,消减值降低290 cP。武育粳3号在260 μmol?L-1硫浓度处理下,米粉的峰值粘度较对照增长158 cP,消减值降低34 cP。两个品种籽粒蛋白质含量及总游离氨基酸含量随硫浓度的升高呈增加的趋势,4种蛋白组分含量与硫浓度总体上呈正相关关系。【结论】200 μmol?L-1硫处理的武粳15和260 μmol?L-1硫浓度处理的武育粳3号,其品质相关理化指标得到较好的改善。     

吡啶甲酸铬对新生仔猪原代肝细胞氧化作用的影响

 【目的】研究不同剂量吡啶甲酸铬（CrPic）对新生仔猪原代肝细胞氧化作用的影响。【方法】选用3日龄新生仔猪作为细胞供体,用剪切消化法分离肝细胞,分别用0、8、200、400 μmol?L-1的吡啶甲酸铬处理细胞48 h,研究吡啶甲酸铬对细胞内活性氧（ROS）水平、丙二醛（MDA）的含量、培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性以及对细胞DNA单链断裂(彗星试验)的影响。【结果】与对照组相比,各处理组ROS水平、LDH活力和彗星试验指标无显著差异（P＞0.05）,8 μmol?L-1组MDA含量显著降低（P＜0.05）;与8 μmol?L-1组相比,400 μmol?L-1处理组ROS、MDA、LDH和DNA损伤程度均显著升高(P＜0.05),随着吡啶甲酸铬添加水平的升高,ROS、LDH分别呈先下降后上升的二次曲线型变化趋势（P＜0.05）。【结论】体外条件下适量的吡啶甲酸铬能抑制肝细胞内脂质过氧化物的生成,增强猪肝细胞的抗氧化能力;400 μmol?L-1吡啶甲酸铬对猪肝细胞无抗氧化作用,也不会引起肝细胞的氧化损伤。     

三重PCR检测草莓灰霉病菌、炭疽病菌和黄萎病菌

【目的】探索和优化检测条件,建立同时检测草莓灰霉病菌Botrytiscinerea,炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides和黄萎病菌Verticillium dahliae的三重PCR检测体系,为3种病害的早期快速诊断和鉴定提供技术和方法。【方法】选择可以组合的3种病原菌特异引物,研究多重PCR的影响因素,优化PCR退火温度,采用正交试验方法,以3个引物组、TaqDNA聚合酶、dNTP和Mg2+六因素三水平优化多重PCR体系。【结果】建立并验证适合上述草莓主要病原菌的三重PCR最佳检测体系,可分别扩增出729、539和450bp的特异条带,最适退火温度为50℃,25μL的反应体系中含有0.32μmol·L-1C729+/-、0.032μmol·L-1DB19/DB22、0.32μmol·L-1CgInt/ITS4、1.5UTaq聚合酶、0.15mmol·L-1dNTP、1.6mmol·L-1MgCl2。【结论】利用上述引物组合和反应体系进行三重PCR检测,能够快速从田间发病植株和土壤中将草莓灰霉病菌、草莓炭疽病菌和草莓黄萎病菌检测出来,灵敏度可以达到10pg菌丝DNA。     

转柠檬酸合成酶基因苜蓿耐铝性研究

【目的】通过对渝苜1号转柠檬酸合成酶(CS)基因和对照株的根尖进行耐铝性试验,旨在找到转基因苜蓿耐铝性的适宜条件,明确转基因株较对照株表现出来的耐铝效果。【方法】以对照株和转CS基因4号苜蓿为材料,设计0、5、15、30和50μmol·L-15个氯化铝浓度梯度,每个处理3个重复,测量前3d根尖的伸长情况。【结果】在5个氯化铝浓度下,对照株和转基因株在第1天的根尖伸长都显著的高于第2天和第3天;转基因株第2天在15、30和50μmol·L-13个氯化铝浓度下的根尖伸长显著高于第3天,而对照株的根尖在第2天和第3天基本停止伸长。随着铝浓度升高,根尖伸长受阻越严重。对照株在15μmol·L-1铝处理的第1天根尖还能基本正常伸长,但在第2天即使5μmol·L-1铝处理,根尖伸长已严重受阻,这说明对照株耐铝浓度低于15μmol·L-1。而转基因株当氯化铝浓度达到30μmol·L-1时,根尖伸长才开始明显受阻(P0.05)。【结论】渝苜1号CS转基因苜蓿的耐铝条件为氯化铝浓度15-30μmol·L-1,处理2d;转基因苜蓿相对于对照株表现出明显的耐铝性。     

一氧化氮对采后李果实线粒体膜氧化损伤的影响

【目的】研究一氧化氮(NO)对采后李果实线粒体膜氧化伤害的影响。【方法】分别用0、10、15、30μL.L-1NO处理李果实,测定25℃贮藏13d内果实呼吸速率、活性氧(ROS)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性、线粒体通透性转换孔开放程度、膜电位、膜流动性、细胞色素(Cyt)c/a的变化。【结果】与对照和其它NO处理相比,15μL.L-1NO提高了果实中SOD、CAT和POD活性,有效减少了果实中氢过氧化物和超氧阴离子自由基等ROS的含量,抑制了线粒体通透性转换孔的开放,延缓了线粒体膜通透性的升高和Cytc的释放,维持了较高的膜电位。随着浓度升高,30μL.L-1NO对线粒体膜的保护作用降低。【结论】15μL.L-1NO有效减轻了ROS对李果实线粒体膜的氧化伤害,保护线粒体膜的完整性。     

外源一氧化氮对苯丙烯酸胁迫下黄瓜幼苗生长及活性氧代谢的影响

【目的】苯丙烯酸是黄瓜根系分泌的毒性较大的酚酸类物质之一,与黄瓜的连作障碍有密切关系。研究外源一氧化氮对苯丙烯酸胁迫下黄瓜幼苗生长及活性氧代谢的缓解作用,初步探讨NO缓解黄瓜幼苗苯丙烯酸胁迫的生理机制。【方法】采用营养钵土培的方法,研究外源一氧化氮(nitric oxide,NO)对200μmol·L-1苯丙烯酸胁迫下黄瓜(Cucumis sativus L.)幼苗生长、抗氧化酶系统和活性氧代谢的影响。【结果】100μmol·L-1NO供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)能显著缓解苯丙烯酸胁迫对黄瓜植株造成的伤害,可明显提高幼苗的生长量,增强叶片的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性,提高叶片叶绿素和脯氨酸(Pro)含量,降低了叶片丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)含量和超氧阴离子(产生速率。与100μmol·L-1SNP处理相比,50、200和400μmol·L-1SNP处理促进黄瓜幼苗生长、缓解叶片氧化损伤和提高抗氧化酶的活性的作用明显降低。【结论】外源NO能明显促进了苯丙烯酸胁迫下黄瓜幼苗的生长,提高了抗氧化酶活性,降低了活性氧代谢,其中以100μmol·L-1SNP缓解效果最好。因此认为,外源NO的确能缓解苯丙烯酸胁迫对黄瓜植株的伤害,提高黄瓜幼苗对苯丙烯酸胁迫的耐性,减缓因自毒作用引起的连作障碍。     

5-Aza诱导BMSC分化为心肌细胞的分子生物学检测

 【目的】利用分子生物学方法探讨5-氮杂胞苷（5-azacytidine,5-Aza）体外诱导牛骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSC）向心肌细胞的分化,为转基因良种肉牛培育提供种子细胞,提高转基因效率。【方法】利用获取的纯化稳定的P4、P8、P12代BMSC各经5、10、15μmol?L-1的5-Aza进行体外诱导分化,统计并计算心肌细胞的转化率,对诱导出现的心肌样细胞进行形态学观察和RT-PCR 鉴定。【结果】诱导后细胞大多呈现梭形,排列方向渐趋一致,有肌管样结构形成。相同代数的BMSC在10μmol?L-1的5-Aza作用下诱导效果最佳;在相同浓度的5-Aza作用下,BMSC向心肌细胞的转化率随着传代次数的增加逐渐降低。RT-PCR显示诱导分化后的细胞明显表达心肌细胞的4种特异性基因,分别是α-心脏肌动蛋白(378bp)、结蛋白（601 bp）、心脏肌钙蛋白T (331 bp)、β-肌球蛋白重链（β-MHC）(273 bp)。【结论】5-Aza体外可诱导牛骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞;利用P4代BMSC在10μmol?L-1的5-Aza的作用,诱导效果明显。     

氯化钙对甘薯蛋白乳化特性的影响

【目的】研究不同氯化钙浓度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol?L-1,pH 7.0）对甘薯蛋白乳化特性的影响。【方法】分别对甘薯蛋白乳化液的乳化颗粒平均粒径（d4,3）、乳化活性指数、乳析指数、界面性质（界面吸附蛋白浓度及组成）和流变性质进行测定。【结果】添加0.05 mol?L-1氯化钙后甘薯蛋白乳化活性指数由未添加氯化钙的30.3 m2?g-1显著降低为27.6 m2?g-1,d4,3从4.2 μm增大至4.42 μm（P＜0.05）。然而,随着氯化钙浓度进一步升高（0.10—0.25 mol?L-1）,d4,3显著增大（P＜0.05）而甘薯蛋白乳化活性指数变化不显著（P＞0.05）。此外,添加较高浓度的氯化钙能显著地增加乳化液的乳析指数和初始表观黏度,且界面吸附蛋白的浓度也显著提高（P＜0.05）。SDS-PAGE分析发现,Sporamin A不易被甘薯蛋白乳化界面吸附,且乳化界面和乳化液中均存在＞66 kD的S-S键高分子聚合物。【结论】 钙离子与甘薯蛋白结合能改变其结构,进而影响甘薯蛋白的乳化特性。     

Kisspeptin-10对无血清培养鸡F1级卵泡颗粒细胞孕酮分泌的影响及机制研究

【目的】研究kisspeptin-10对无血清培养的鸡卵泡颗粒细胞孕酮分泌的作用及可能机制。【方法】选取200日龄处于产蛋高峰期的伊莎蛋鸡,于排卵前剖腹收集F1卵泡,分离纯化颗粒细胞,于含胎牛血清培养基中培养24 h,换成无血清培养基稳定培养24 h后,用不同浓度的Kp-10、U73122、EGTA等单独或共同处理细胞,收集细胞上清,放射免疫学方法检测培养基中孕酮含量。【结果】（1）通过免疫细胞化学方法,显示颗粒细胞上有Kp-10免疫活性样物质的阳性表达;（2）Kp-10处理可显著增加无血清培养的颗粒细胞的活力,100 nmol•L-1时可显著促进孕酮的分泌（P＜0.05）;（3）与对照组相比,2 μmol•L-1 U73122（磷脂酶C抑制剂）对孕酮的分泌无显著影响（P＞0.05）,而0.5、2 μmol•L-1 U73122能显著降低Kp-10对孕酮分泌的促进作用（P＜0.05）;（4）钙离子阻断剂Verapamil（1-100 μmol•L-1 ）呈剂量依赖性降低孕酮的分泌,于100 μmol•L-1时达显著降低水平（P＜0.05）;与1 μmol•L-1 Verapamil单独处理组相比,100 nmol•L-1 Kp-10与1 μmol•L-1 Verapamil同时处理可显著增加孕酮的分泌,而与10、100 μmol•L-1 Verapamil共同处理不能逆转其对孕酮分泌的抑制作用（P＞0.05）,且胞内钙离子含量与上清液中孕酮分泌水平相一致;（5）与100 nmol•L-1 Kp-10处理组相比,1和5 mmol•L-1 EGTA共同处理时孕酮分泌显著降低,当再加入1.5 mmol•L-1 Ca2+时孕酮分泌量显著增加。【结论】Kp-10促进体外培养的鸡卵泡颗粒细胞孕酮的分泌,其机制可能与胞内Ca2+信号通路有关。