苹果树腐烂病菌T-DNA插入突变体表型及致病突变体研究

【目的】筛选苹果树腐烂病菌T-DNA插入表型或致病突变体,为研究该病菌的表型及致病相关基因提供起始材料。【方法】从建立的T-DNA插入突变体库中,随机挑选230株突变体菌株进行表型观察及致病性测定,并对部分致病突变体进行TAIL-PCR侧翼扩增。【结果】大部分的突变体与野生型菌株03-8在表型及致病性方面无明显差异,仅30.87%的突变体表现出了明显的变化;其中16株突变体(占突变体总数的6.95%)致病性发生了明显的增强,而表型与03-8相比无明显的变化;20株突变体(占突变体总数的8.69%)致病性与03-8无显著性差异,但是表型发生了明显的变化;16.1%的突变体则同时表现出表型及致病性的显著差异,其中28株表现为致病性显著降低,7株致病性丧失。通过对15株致病突变体侧翼序列的扩增,获得了7条T-DNA侧翼序列,其中突变体X912的侧翼序列被注释为黄曲霉(Aspergillus flavus)阿魏酸酯酶B前体。【结论】获得了多个不同的苹果树腐烂病菌表型或致病突变体,为研究该病菌的生长发育及致病相关基因奠定了良好的基础。     

苹果树腐烂病菌GTP-环化水解酶II基因敲除载体构建及其突变体的表型分析

【目的】利用反向遗传学方法构建苹果树腐烂病菌（Valsa mali）中表达GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1的敲除载体,通过同源重组的方法进行基因敲除分析目标基因的功能,为全面解析苹果树腐烂病菌致病的分子机制奠定基础,并为有效控制苹果树腐烂病的方法技术和药剂研制提供理论依据。【方法】通过对笔者实验室苹果树腐烂病菌转录组数据的分析比对得到GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1（暂命名）,该基因在接种5 d后,在病组织中表现出一定的上调表达,推测该基因可能与苹果树腐烂病菌致病相关。采用Double-joint PCR方法,将目标基因Vmgtp1的上游片段UP、下游片段DOWN及筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因（hph）进行片段融合。对得到的PCR产物及质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS进行双酶切,通过T4连接酶,将片段UP-HPH-DOWN连接到质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS上,转化到JM109菌株中,挑取阳性克隆,提取质粒,得到含有hph的Vmgtp1敲除载体,再利用PEG介导的遗传转化获得抗潮霉素的突变体,然后用4对引物对突变体进行PCR检测及Southern Blot验证得到敲除突变体,最后对敲除突变体及野生型菌株03-8进行菌落颜色、菌落大小、繁殖体产生情况等表型分析和接种在离体苹果烫伤枝条上观察病斑大小的致病性检测,对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。【结果】通过上述方法成功构建了表达GTP-环化水解酶II基因的Vmgtp1敲除载体,并利用PEG介导的遗传转化方法在苹果树腐烂病菌中进行了转化,共获得101个能够在含潮霉素PDA培养基上生长的突变菌株,经过PCR及Southern Blot对101个突变菌株进行分析验证,得到1个敲除突变体,编号为ΔVmgtp1-90。在PDA培养基上,敲除突变体ΔVmgtp1-90与野生型菌株03-8相比,ΔVmgtp1-90菌落平均生长速率为11.33 mm?d-1,03-8平均生长速率为24.67 mm?d-1,突变体菌落生长速率明显变慢,颜色变浅,气生菌丝稀疏;ΔVmgtp1-90光照培养40 d仍无繁殖体的产生,而03-8光照条件下培养15 d后就能产生繁殖体,30 d后有分生孢子从繁殖体上溢出。致病性检测试验发现,接种ΔVmgtp1-90菌株7 d后,富士苹果枝条上病斑的平均直径为9.3 mm,与之相比,接种03-8的苹果枝条病斑平均直径为24.8 mm,ΔVmgtp1-90致病性显著减弱。【结论】通过基因敲除和遗传转化获得苹果树腐烂病菌中表达GTP环化水解酶II Vmgtp1的敲除突变体ΔVmgtp1-90,比较Vmgtp1突变体与野生型菌株的表型及致病性差异,发现Vmgtp1可能参与调控苹果树腐烂病菌菌丝生长和繁殖体的产生过程,并且可能在苹果树腐烂病菌致病过程中起作用,但是是否起主要作用还有待进一步研究。     

苹果树腐烂病菌生长发育相关突变体筛选及侧翼序列分析

由弱寄生菌苹果黑腐皮壳属真菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)引起的苹果树腐烂病是苹果枝干上的重大病害。探究病菌生长发育的分子机制对于新农药靶标位点的开发具有重要理论意义。在前期建立的苹果树腐烂病菌ATMT突变体库的基础上,利用PDA培养基常规培养法,对野生型菌株03-8及230株供试突变体菌株的菌落形态、大小以及繁殖体产生情况进行观察分析,筛选得到表型发生变化的突变体共67株(占突变体总数的29.13%)。其中11株突变体的菌落大小异常(4.78%);25株突变体的菌落颜色发生变化(10.87%);18株突变体的菌落边缘变为不规则(7.83%);9株突变体的繁殖体最初形成时间推迟至50d左右(3.91%);17株(7.39%)突变体的繁殖体产生数量发生显著变化。利用TAIL-PCR对10株表型变化的突变体进行侧翼序列扩增,获得3条T-DNA侧翼序列,序列分析发现1个为细胞色素氧化酶1(cytochrome oxidase 1),其他2个均为含有核糖体L34(Ribosomal L34)的假想蛋白。筛选获得67个生长发育受到影响的突变体,并鉴定得到2个候选的调控病菌生长发育的相关基因,为揭示苹果树腐烂病菌生长发育的分子机理奠定基础。     

落叶型大丽轮枝菌T-DNA插入突变体库的构建

采用ATMT技术建立大丽轮枝菌落叶型菌株XJ2008菌株的T-DNA插入突变体文库,共获得6 043个突变体。从中随机挑选104个突变体,以野生型XJ2008菌株为参照,评价其致病性、菌落生长速率、分生孢子及微菌核的产生能力等。结果表明,有12.5%的突变体丧失产孢能力,4.8%的突变体的生长速率显著减慢,8.7%的突变体的生长速率显著加快,12.5%的突变体丧失产生微菌核的能力,47.1%的突变体的致病性显著低于野生型菌株XJ2008,且突变体2-736、2-740、2-745的病情指数分别约为野生型菌株XJ2008的0.184、0.168和0.197倍。该突变体库突变体遗传稳定性好,性状多样性丰富。     

香蕉枯萎病4号小种T-DNA 插入突变体 Focr4-1453表型特征及致病性分析

尖孢镰刀菌古巴转化型是引起香蕉枯萎病的主要病原菌,呈世界多态性分布,其致病机理尚不清楚。 Focr4-1453 为T-DNA 插入突变体库中筛选出的一株与致病性相关的突变体。在克隆出其失活基因之后,将“生型 菌株中的相同基因进行敲除和互补,得到敲除突变体驻Foc4-1453 和互补突变体驻Foc4-1453-cp-1。对获得的3 株 突变体进行生物学表型研究发现,这些菌株的菌落生长速度、产孢能力以及孢子萌发率较“生型菌株明显降低,且 无法透过玻璃纸进行生长。致病性测定试验表明,该基因失活会导致病原菌侵染能力显著减弱。     

玉米大斑病菌ATMT突变体库的构建及其分析

【目的】利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化技术,对玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）进行转化,构建ATMT突变体库,为从分子水平上揭示病菌的致病机理奠定基础。【方法】以带有重组双元载体的农杆菌对玉米大斑病菌进行转化,利用潮霉素B进行筛选,对抗性稳定的转化子进行PCR检测,构建玉米大斑病菌ATMT突变体库;从突变体库中随机选取一定数量的突变体,对其菌落形态、菌丝及分生孢子发育、致病性等进行分析。【结果】获得了1 265株玉米大斑病菌T-DNA插入突变体;从中随机选取36株突变菌株,对其进行抗性筛选和PCR检测,发现潮霉素磷酸转移酶基因已整合进入野生型菌株的基因组中,且能够稳定遗传;与野生型菌株相比,在供试的菌株中,大部分菌株菌落形态和生长速率没有发生明显改变。生长速率明显减慢的菌株占总数的13.8%,明显加快的菌株占16.7%;发现了2株分生孢子形态发生明显改变的菌株,占菌株总数的5.6%;产孢量明显增大的菌株占5.6%,产孢量减少的菌株占13.5%;分生孢子萌发率发生明显改变的菌株占16.6%;发现了1株致病性明显增强的菌株,占菌株总数的2.8%。【结论】构建了玉米大斑病菌ATMT突变体库,并对突变体库进行了初步分析,将为克隆玉米大斑病菌生长发育和致病性相关基因奠定基础。     

河北省苹果树腐烂病菌不同分离株生物学性状及致病性研究

为了明确河北省苹果树腐烂病病原菌的类型及致病性分化情况,从河北省8个苹果产区采集罹病样本,分离得到153株苹果树腐烂病菌,并根据菌落颜色、菌丝生长速率和疏密程度选取其中具有明显特征差异的12个代表性菌株进行了致病性测定.结果表明,河北省各地区苹果树腐烂病菌的菌落颜色分为7个类群,主要为浅黄色和黄色;不同分离株在菌丝生长速率和菌丝疏密程度上也存在较大差异,其中70.59％的菌株生长速率为中等,57.52％的菌株气生菌丝发达.不同颜色菌株的致病力有显著差异,在菌丝生长速率接近的情况下,浅黄色和黄白色菌株致病力较强;菌落颜色相同而菌丝生长速率不同的菌株间致病力也有显著差异,且致病力强弱与生长速率呈正相关;菌丝疏密程度对菌株致病力的影响不明显.以上试验结果均表明,河北省苹果树腐烂病病原菌具有多样性和致病性分化现象.     

梨黑斑病病原菌的生物学特性及其致病性观察

采用室内离体接种和室外孢子喷雾接种方法,对3株梨黑斑病病原菌的生物学特性和致病性进行了观察.结果表明:供试各菌株在PSA培养基上培养,平均日生长速率、产孢量、菌落颜色及菌落厚度差异显著;各病原菌菌株在光照、黑暗和12 h光暗交替培养时,日生长速率和产孢量有明显差异;黑斑病病原菌最适生长和产孢培养基为PSA;孢子萌发最适pH值8～10;菌株A和菌株H的致病力显著强于菌株C,但这2个菌株间的致病性无显著差异;A、C、H 3种菌株混合接种时,可使梨叶片表现自然发病时的典型病斑.     

稻瘟病菌REMI突变体的筛选和鉴定

利用构建的含潮霉素(HygB)抗性标记的质粒pUCATPH在稻瘟病菌菌株M 131中建立一个转化体系,通过限制酶介导整合(REM I)插入诱变技术,以HygB抗性作为突变体筛选标记,获得639个转化子。对其中200个转化子进行表型和致病性测定后,通过点杂交鉴定分别获得6个致病性突变菌株和部分表型突变菌株。对2个表型突变菌株和rep-PCR图谱差异性较大的2个致病性突变菌株进行RFLP分析,结果表明:突变体中均已插入质粒,但转化质粒在M 131中整合具有一定的随机性。     

新月弯孢菌nit突变体的诱导与鉴定

采用硝酸盐缺陷型(nit)突变体互补测试法,对来自不同地区的5株新月弯孢菌[Curvularialunata(wakker)Boed]菌株进行诱导与鉴定。通过对菌落生长量的测定表明,WAC培养基比KPS培养基更能抑制菌落的生长。将从两种诱变培养基中获得的抗氯酸盐突变体,同时接种到查彼克(Czapek)、CDA和MM培养基上进行鉴定。结果表明,经KPS诱变获得的nit突变体频率为15.40%,而经WAC诱变获得的nit突变体频率为24.73%。在获得的602个nit突变体中,由CDA、Czapek和MM分别鉴定出363个、184个和55个。用WAC-CDA组合筛选获得48.47%的NitM突变体,而其他组合的NitM突变体获得率均小于7.00%。表明WAC-CDA组合适合用于新月弯孢菌nit突变体的诱导与鉴定。     

浅谈饲料中有效能的测定技术

饲料中有效能是供动物生长发育的基础.不同动物所用的有效能体系不同,目前大多数动物采用消化能、代谢能体系,但随着研究的发展与深入,发现最能反映饲料有效能的是净能体系.无论哪种体系,采用合理的测定技术准确测定饲料中的有效能值显得尤其重要,通过对饲料有效能值的准确测定可以实现动物所需能量的精确供给,减少养殖成本,使经济效益最大化.文章综述了几种有效能评价体系的测定技术.     

山茱萸多糖提取工艺优化及马钱苷含量测定

采用L（934）正交设计试验,对山茱萸浸提液中山茱萸多糖的酶水解法提取工艺进行了优化研究,并对浸提液的中有效成分马钱苷含量进行了HPLC法分析。结果表明,山茱萸多糖浸提的最佳工艺为：液料比1∶5,浸提时间4 h,浸提温度80℃,果胶酶添加量0.55 g/L。用HPLC法测定出的山茱萸浸提液中马钱苷平均含量为0.512 ...     

探究板栗的科学贮藏方法

板栗属壳斗科栗属(Castanea mollisima Blume),其种子属于顽拗型种子,不耐贮藏。基于近年来板栗贮藏保鲜技术研究成果,从合理采收、贮前处理、贮藏方法等方面进行论述。     

切花菊耐热性鉴定方法研究

以8个切花菊品种为材料,通过对离体叶片进行50℃高温胁迫后,采用电导法、电阻抗图谱法测定电导率、电阻,并对大田栽培植株进行田间高温胁迫试验,比较品种间的耐热性。结果表明:电导法测得的50℃直接相对电导率、修正相对电导率和电阻抗图谱法测得的胞外电阻在品种间有明显差异,但与田间高温胁迫法测定的热害指数不完全一致。电导法和电阻抗图谱法都可以作为测定切花菊耐热性的方法,但需要结合田间耐热性观察。     

生态旅游潜在客源市场特征的调查研究--以湖南永州金洞森林旅游开发为例

为探明客源市场生态旅游消费的潜在特征,采用问卷调查的形式,就长沙市居民对湖南金洞生态旅游开发的意向等问题进行抽样调查．结果显示,生态旅游符合人们“回归自然”的旅游新时尚,有着极大的开发空间,指出生态旅游的开发要注重环境保护和可持续发展．开发的产品要以休闲度假类的大众产品为主,开发生态旅游都市客源市场还要多种渠道并用,尤其是要注重媒体的宣传．     

啤特果多糖提取工艺的研究

［目的］寻找开发啤特果产业的新途径,提高其附加值。［方法］采用水提醇沉法提取啤特果中的多糖,通过单因素试验和正交试验,以多糖的提取率为评价指标,对影响啤特果多糖提取工艺的因素进行研究。［结果］确定了提取啤特果多糖的最佳工艺参数为温度95℃,料液比1∶2,乙醇浓度67%。在该工艺条件下,啤特果多糖的得率为1.05%。［结论］该研究为开发利用啤特果提供理论依据。     

GEF7基因过表达拟南芥植株幼苗表型分析

利用已构建的过表达拟南芥(Arabidopsis)GEF7基因植株,在光照培养箱中进行培养,并与野生型植株进行对比分析,对GEF7基因过表达植株的幼苗表型进行了观察分析。结果表明,GEF7基因过表达植株幼苗的根长比野生型对照明显增加;其子叶形态、数目和幼苗形态等方面均有异常表型,表明GEF7基因的功能与根的发育有关,并参与调控植物的发育过程。     

《河北农业大学学报》创刊年代考

清光绪二十八年(1902)河北农业大学前身—直隶农务学堂诞生,经几易其名,于1958年更名为河北农业大学至今。清光绪三十一年(1905)直隶高等农业学堂时期创办了《北直农话报》,清光绪三十四年(1908)更名为《直隶农务官报》,中华民国七年(1918)改出《农学月刊》,中华民国十七年(1928)易名为《河大农刊》,中华民国二十三年(1934)更名为《河北通俗农刊》,中华民国二十四年(1935)易名为《河北农林学刊》,1948年更名为《河北农学院研究专刊》,1959年更名为《河北农业大学学报》至今。《河北农业大学学报》前身诸刊都与现时的《河北农业大学学报》有着一脉相承的历史渊源,各刊之间联系紧密,连续性、继承性强。因此,《河北农业大学学报》的创刊时间应追溯至1905年创办的《北直农话报》。     

姬松茸碳源利用规律的研究

试验采用麦秸培养基,系统研究了姬松茸在生长期间对碳源的利用规律。结果表明,姬松茸降解的有机物质绝大部分被菌体的呼吸过程消耗掉,绝对生物学效率较低;在菌丝生长阶段,木质素的降解速率大于纤维素和半纤维素,这对纤维素和半纤维素的降解十分有利;非木质纤维素组分在菌丝生长阶段被主要利用,而木质纤维素则是子实体生长阶段的主要碳源。且就整个栽培过程而言,姬松茸生长发育所需要的79.86%的碳源来自木质纤维素。     

水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的纯化技术

应用萄聚糖凝胶柱层析对水牛梭形住肉孢子虫包囊包溶性抗原进行了纯化。结果表明：纯化水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的最适条件为：选用萄聚糖凝胶Ｇ—１００柱层析系统；洗脱液为０３ＭＰＢＳ（ｐＨ７２），床体积为１０ｃｍ×１６５ｃｍ，上样体积为５００ＨＬ；流速为１２ｍＬ／ｈ。纯化抗原可使琼脂凝胶双扩散试验的阳性检出率提高３０％。