木瓜凝乳蛋白酶基因的克隆及在原核细胞中的表达

以青番木瓜总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出木瓜凝乳蛋白酶基因CHY(chymopapain),构建带有His-tag的原核表达载体p EASY-E1-CHY。将该重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,重组菌株用IPTG诱导表达,在诱导6 h,IPTG浓度为0.05 mmol/L时重组蛋白表达量最高。SDS-PAGE凝胶电泳和West-ern-Blot杂交分析结果表明蛋白大小为45 k Da。用脱脂奶粉进行凝乳分析,证明此木瓜凝乳蛋白酶具有凝乳活性,此结果为今后利用生物技术进行木瓜凝乳蛋白酶工程化生产奠定了基础。     

大肠杆菌外膜蛋白酶基因OmpT的克隆及表达

OmpT(Outer-membrane proteases T)是革兰氏阴性细菌分泌到细胞表面具有丝氨酸蛋白酶活性的一种重要蛋白。利用大肠杆菌OmpT降解抗菌肽特性来筛选和改造新型抗菌肽,可以为开发抗OmpT蛋白酶水解新抗菌肽序列提供新的思路和创造条件。根据大肠杆菌外膜蛋白酶OmpT的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从大肠杆菌K12基因组中扩增获得一段为954 bp的序列,测序结果显示此序列与已公布序列同源性达99.99%。将其序列定向克隆到原核表达载体pET28a上构建重组表达质粒pET28a-OmpT。经IPTG诱导后,在表达宿主菌中特异性的表达出分子量约为36 kDa且具有生物活性的OmpT蛋白。生长曲线试验显示,抗菌肽LL37对带重组表达质粒pET28a-OmpT的大肠杆菌生长没有影响,而对照组的生长明显受到抗菌肽的抑制作用。     

高温中性蛋白酶基因的克隆及毕赤酵母表达研究

对地衣芽孢杆菌XJT9503高温中性蛋白酶进行了克隆,并在毕赤酵母中进行了表达.以高温中性蛋白酶产生菌地衣芽孢杆菌XJT9503基因组DNA为模板,通过PCR扩增,获得高温中性蛋白酶(Tnp)基因的特异性片段,大小约为1 kb.通过EcoRI、NotI 双酶切后,将该基因连入毕赤表达载体pPIC9K,并整合到毕赤酵母SMD1168基因组中,构建的基因工程菌,进行甲醇诱导表达.结果表明,基因工程菌发酵72 h,有最大酶活,为19 U/mL;酶的最适作用温度为65℃,与原始酶的最适作用温度相符.证明研究成功克隆了高温中性蛋白酶基因,并在毕赤酵母中正确表达.     

含有α-胰凝乳蛋白酶作用位点的Cry3A突变体的构建、表达、纯化以及杀虫活性分析

[目的]构建含有α-胰凝乳蛋白酶作用位点的Cry3A的突变体Cry3Am,以期提高Cry3A的活化效率,增强杀虫活性.[方法]利用重叠PCR技术,构建Cry3A杀虫蛋白的突变体Cry3Am,使之在原核细胞中表达纯化突变体蛋白;将Cry3Am与饲料混合后饲喂黄粉虫,用以评价Cry3Am的杀虫活性.[结果]成功地在Cry3h杀虫蛋白结构域I的α3和α4之间加上1个α-胰凝乳蛋白酶的作用位点,并提取Cry3Am到杀虫蛋白.体外酶切试验结果表明,Cry3Am很容易地被降解为55 kD的杀虫蛋白.生测分析结果表明,Cry3Am对黄粉虫的毒力是Cry3A的2倍以上.[结论]向Cry3A中插入α-胰凝乳蛋白酶作用位点可以使突变体Cry3Am很容易地被α-胰凝乳蛋白酶降解成55 kD的片段,并能提高Cry3A的杀虫活性.     

毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI的克隆及真核表达

利用PCR技术从毛果杨(Populus trichocarpa)中分离得到1条丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI,该基因cDNA编码区全长为1176 bp,可编码391个氨基酸。BlastP预测结果显示,该丝氨酸蛋白酶抑制剂属于SERPIN超家族。多序列比对结果表明,毛果杨PtrSPI基因的氨基酸序列与已报道的胡杨(P.euphratica)丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸序列XP_011030699同源性最高,相似性为92%,且蛋白的C端氨基酸序列都含有高度保守的反应中心环(RCL)。在此基础上,成功构建了PtrSPI基因的重组真核表达载体pPICK-PtrSPI并获得了重组毕赤酵母菌株GS115-PtrSPI。利用终质量分数为0.5%甲醇诱导重组真核蛋白表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在42648.45处出现了重组蛋白,与预期值一致。     

曲霉来源植酸酶基因phyA的克隆及原核表达

在饲料中添加植酸酶可以提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收,并减轻动物排泄物中磷对环境的污染,具有广泛的应用前景。本试验以自行分离得到的黑曲霉菌株基因组DNA为模板,克隆得到植酸酶phyA基因,并将其连接到原核表达载体pET21b、pET30a上,利用热激转化的方法将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建植酸酶大肠杆菌工程菌株。工程菌株在经诱导后可以产生大量的植酸酶蛋白。     

家蚕胰脂肪酶相关蛋白1基因(BmPLRP1)的克隆及表达分析

胰脂肪酶相关蛋白1(Pancreatic lipase-related protein 1, PLRP1)是由PLRP1基因编码的一种脂肪酶,在通常状态下无活性。PLRP1的分泌与生物的生长发育有着密切的联系,但该基因在家蚕中的功能尚未清楚。本研究克隆获得家蚕PLRP1基因(BmPLRP1)的核苷酸序列,并对其序列特征进行生物信息学分析,进一步采用半定量RT-PCR和荧光定量PCR检测BmPLRP1基因的表达水平。结果表明,该基因位于家蚕第12号染色体的nscaf2993位点,编码331个氨基酸,等电点为8.72,预测的BmPLRP1蛋白无信号肽、分子质量为37.1 kD,没有跨膜结构域,具有一个Pancreat_lipase_like结构域,存在活性位点、磷酸化位点、O-糖基化位点,不存在N-糖基化位点。系统进化分析表明BmPLRP1与野桑蚕的PLRP1的进化关系较近;RT-PCR检测表明,BmPLRP1基因在家蚕5龄3天幼虫的头部、表皮、丝腺、生殖器、气管丛、中肠中有明显表达,而在血液和脂肪体中的表达量相对较低;对家蚕品种‘733xin’喂食经100 mg/kg NaF溶液浸泡过的桑叶后,实时定量PCR检测BmPLRP1基因在中肠、血液、丝腺、脂肪体中的相对表达量,结果表明均有所上调,推测该基因可能参与了氟化物侵染家蚕后的应答反应过程。     

弓形虫MAPK1基因的克隆与原核表达

为获取具有生物学活性的弓形虫MAPK1蛋白,根据Gen Bank中编码MAPK1的已知序列设计并合成1对引物,用NCoⅠ和HindⅢ双酶切后,连接到同样双酶切的原核表达载体PET-28a上,构建重组表达质粒PET-28a-MAPK1并转化至E.coli BL21感受态,用IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,纯化后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明:表达质粒在E.coli BL21中得到表达,克隆的MAPK1基因与Gen Bank中收录的基因序列同源性为99.9%。对重组质粒进行酶切鉴定,获得1 599 bp大小的目的基因片段,与预期结果相符,成功地构建了重组质粒PET-28a-MAPK1。Ni2+螯合柱纯化后蛋白浓度为0.26 mg/m L,可用作免疫原,经SDS-PAGE电泳显示PET-28a-MAPK1融合蛋白的分子量约为58 ku。Western blotting显示融合蛋白具有良好的抗原性。     

毛白杨巯基蛋白酶抑制剂基因cDNA的克隆及序列分析

为了发掘我国乡土树种毛白杨巯基蛋白酶抑制剂(CPI)基因资源,该研究在对已知植物巯基蛋白酶抑制剂氨基酸序列保守性和杨树表达序列标签(EST)序列分析的基础上,设计了1对简并引物和1对杨树特异性CPI引物,应用RT-PCR技术在毛白杨形成层中扩增出了一个696 bp的cDNA片段,将此片段连接到pGEM-T Easy载体上并测序.结果表明,该片段含有一个417 bp的开放阅读框,编码138个氨基酸残基.进一步对氨基酸序列分析表明,该氨基酸具有典型植物巯基蛋白酶抑制剂的保守区段,即靠近氨基端具有甘氨酸（G）残基和［LVI］-［AGT］-［RKE］-［FY］-［AS］-［VI］-［EDQV］-［HYFQ］序列,羧基端具有与酶活性有关的QXVXG结构和PW残基,说明毛白杨形成层中存在CPI基因并能够有效表达.氨基酸序列同源性分析表明,该基因与其他林木CPI的同源性在47%～68%之间.      

月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的克隆及表达分析

【目的】克隆月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的全长cDNA序列,分析其序列及表达特征,并对该基因编码的蛋白进行原核表达分析,为深入探讨丁香酚合成酶的生化特性奠定基础。【方法】根据已发表的其它植物EGS基因序列的保守结构域设计简并引物,结合RACE技术,获得RhEGS1的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR对不同组织及不同花发育时期RhEGS1进行表达分析。采用Gateway克隆技术,构建原核表达载体,并进行原核蛋白表达。【结果】月季RhEGS1 的cDNA全长为1 207 bp,包含一个927 bp的ORF,编码309个氨基酸。同源序列比对发现RhEGS1与仙女扇的CbEGS2有83.87%的同源性,与矮牵牛PhEGS1具有81.55%同源性。表达谱分析表明,RhEGS1主要在雄蕊中表达, 且在花盛开期表达最强,而在花蕾期及凋谢期表达较弱。原核表达分析发现,在37℃、0.5 mmol•L-1 IPTG 诱导4 h 后,携带RhEGS1 ORF 的原核表达载体在大肠杆菌中生成了大量的分子量约为35 kD 的蛋白质,其分子量大小与预测的理论值相一致。【结论】从月季雄蕊中克隆到丁香酚合成酶基因RhEGS1,具有EGS基因的结构特征和完整的编码框,且在盛开期雄蕊中表达量最高。     

野生茄托鲁巴姆蛋白酶抑制剂基因StPI1的克隆与特征分析

以野生茄托鲁巴姆为材料,在利用SSH文库获得基因片段的基础上,采用RACE方法克隆了1个蛋白酶抑制剂Ⅱ型基因的全长cDNA序列,命名为StPI1。StPI1 cDNA序列全长790bp,含有29bp的5′-UTR和201bp的3′-UTR,编码包含202个氨基酸的前体蛋白。StPI1前体蛋白N末端1~27位为信号肽,成熟蛋白含有3个保守的蛋白酶抑制剂Ⅱ结构域。预测StPI1蛋白含有1个磷酸化位点、1个糖基化位点和3个N端酰基化位点。表达模式分析表明,在黄萎病菌侵染后,StPI1在托鲁巴姆根中呈上调表达。     

一个植物半胱氨酸蛋白酶多克隆抗体的制备及其应用

半胱氨酸蛋白酶 (cysteine proteinase,CysP)是一类重要的蛋白酶家族,广泛参与植物多种生理过程。为了分析植物CysP的特性,本实验首先通过RT-PCR技术从本氏烟中扩增获得了一个编码CysP的基因(NbCysP)序列并连接至pEASYTM-T5 Zero载体,测序验证后亚克隆至原核表达载体pGEX-6P1,命名为pGEX-NbCysP;将其导入大肠埃希菌BL21plysS中诱导表达;重组表达的NbCysP融合蛋白经过亲和层析纯化,免疫兔子制备多克隆抗体,Western印迹分析显示,该抗体能和重组NbCysP蛋白发生强烈的免疫学反应且条带单一,表明所获得的CysP抗体具有良好的特异性。上述结果为进一步鉴定植物CysP的功能特性奠定了基础。     

高温中性蛋白酶基因的克隆、表达及验证研究

对地衣芽孢杆菌XJT9503高温中性蛋白酶基因进行了克隆、测序及表达研究.以高温中性蛋白酶产生菌地衣芽孢杆菌XJT9503基因组DNA为模板,通过PCR扩增,获得特异性片段.经测序分析,其具有一个942 bp的蛋白酶完整阅读框.通过表达载体构建,获得质粒pPL-tnp,并转化至蛋白酶缺失受体菌枯草芽孢杆菌AB97013,经表达验证其蛋白酶最适作用温度和pH与出发菌相符.证明研究获得了高温中性蛋白酶基因及表达质粒pPL-tnp,并正确表达.     

猪带绦虫组织蛋白酶B基因的克隆表达及抗血清的制备

[目的]探索猪带绦虫组织蛋白酶B基因克隆、原核表达及抗血清制备的方法。[方法]根据从Gene DB获得的猪带绦虫组织蛋白酶B的基因序列设计特异性引物,以猪带绦虫的c DNA为模板,扩增出猪带绦虫组织蛋白酶B基因的开放阅读框。将去掉信号肽的部分进行了原核表达,用重组蛋白免疫青紫蓝灰兔,并制备高效价抗血清。[结果]成功克隆了猪带绦虫组织蛋白酶B基因的开放阅读框序列,将其命名为Tscp B,长度为1 074 bp,编码357个氨基酸,理论蛋白分子质量约为39.71 ku,具有组织蛋白酶B的特征结构域。采用大肠杆菌原核表达系统对目的蛋白进行大量表达,成功获得了大小约38 ku的猪带绦虫组织蛋白酶B的重组蛋白,此目的蛋白以包涵体的形式存在。Western blotting表明,猪囊尾蚴病阳性血清可以与纯化的重组蛋白发生特异性结合,说明被猪囊尾蚴感染过的猪血清中存在组织蛋白酶B的抗体。[结论]猪带绦虫组织蛋白酶B重组质粒能在大肠杆菌系统中高效表达,且该蛋白具有较高的免疫活性。     

卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因的克隆及其表达分析

[目的]明确卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因(TroCatL)的遗传进化规律及其组织表达水平,为研究CatL生物学功能及其对病原的抗病机理提供理论依据.[方法]应用RT-PCR和RACE技术克隆TroCatL基因全长cDNA,采用生物信息学方法对其序列特征进行分析;并以实时荧光定量PCR(qPCR)检测TroCatL基因在健康组织中的表达情况及其表达与溶藻弧菌感染的关联性.[结果]TroCatL基因全长cDNA为1492 bp(GenBank登录号MH036350),包括开放阅读框(ORF)1011 bp、5'端非翻译区(5'-UTR)120 bp和3'端非翻译区(3'-UTR)361 bp. TroCatL基因编码336个氨基酸残基,其理论等电点(pI)5.7,预测分子质量37.93 kD,且存在CatL特有的保守结构域(ERFNIN、GNFD和GCXGG基序)及由139Cys、279His和303Asn组成的半胱氨酸蛋白酶保守活性位点.TroCatL氨基酸序列与其他鱼类CatL氨基酸序列的同源性高达83.9%~95.2%,尤其与鲈形目鰤鱼的亲缘关系最近. TroCatL基因mRNA在健康卵形鲳鲹组织中均有表达,以在肝脏中的表达最高,在脑组织中的表达最低.经溶藻弧菌感染后,TroCatL基因mRNA在肝脏、脾脏和血液中的表达水平均上调,肝脏和脾脏中的TroCatL基因mRNA在攻毒后24 h达峰值,血液中的TroCatL基因mRNA在感染后12 h达最高值.[结论]TroCatL蛋白结构域及其催化活性位点在遗传进化过程中较保守,通过参与机体的免疫应答反应,在卵形鲳鲹抵御细菌或病毒侵染的过程中扮演重要角色.     

耐盐基因HAL1的克隆及在原核细胞中的表达

以酵母基因组DNA为模板,采用PCR方法得到耐盐基因HAL1,插入原核表达载体pGEX-4T-1的XhoI和EcoRI酶切位点之间,构建原核表达载体pGEX-HAL1;将该载体转化到大肠杆菌中,重组菌株用IPTG诱导表达,其耐盐性比空白菌株提高50%;SDS-PAGE凝胶电泳结果显示有明显表达的蛋白质条带。     

柞蚕真菌蛋白酶抑制剂基因CP8的克隆与表达分析

蛋白酶抑制剂在昆虫免疫中发挥着重要的作用。首次克隆获得了一个柞蚕真菌蛋白酶抑制剂基因ApCP8的开放阅读框(ORF)序列。该基因的ORF序列全长318 bp,编码了一个由106个氨基酸组成的蛋白(包括19个氨基酸的信号肽)。预测蛋白的等电点和分子量大小分别为9.05和11.3 kD。序列分析和进化树构建结果表明,ApCP8与已知的几种昆虫相应蛋白具有很高的同源性,且与印度柞蚕的CP8聚在同一进化分支上。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)结果表明,ApCP8主要在柞蚕脂肪体中高表达;且ApCP8在被白僵菌诱导的初期高表达,推测其可能参与了柞蚕抗真菌的免疫反应。同时,利用pET-32a(+)载体对ApCP8进行了原核表达,并对重组表达蛋白进行了纯化和抗体制备。本研究将为进一步探索ApCP8的抗真菌功能奠定前期基础。     

PRRSV新疆株N基因的克隆及原核表达

根据GenBank上已发表的毒株,设计了一对引物扩增PRRSV新疆株N基因片段;将N基因克隆到pMD18-T,在亚克隆到pGEX-6p-1原核表达载体上,构建重组质粒pGEX-6p-N;在37℃条件下,经终浓度为1mmol／L的IPTG诱导表达4h后,获得了可溶性融合蛋白;经SDS-PAGE电泳检测和Western blotting分析,该融合蛋白分子量约为39kDa,与预期结果一致,并能与PRRSV阳性血清发生特异性反应,且非特异性背景很低。     

鸡Ii基因的克隆、鉴定及其原核表达

从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中提取总RNA,用自行设计的一对引物通过RT—PCR方法扩增出鸡恒定链(invariant chain,Ii)基因片段。经酶切鉴定后,再将该片段克隆到pcDNA3载体中,测定其DNA序列,结果表明该片段长度为669bp,其DNA序列与GenBank登录的基本一致。再将该片段插入原核表达载体PGEX-4T-1,并导入菌株BL21,经诱导培养、蛋白提取和SDS—PAGE,获得分子量约为50kD的特定蛋白条带,表明所克隆的鸡Ii基因在原核细胞中得到表达。     

人促凋亡蛋白基因bax的克隆与原核表达

以人促凋亡蛋白基因bax全长转录本eDNA为模板,经PCR扩增得到bax基因,将其克隆到pMD18-T,并构建原核表达质粒栽体pGEX-4T-1-Bax,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达.PCR扩增、双酶切鉴定他测序结果均显示bax基因已被成功克隆到表达载体中,表这产物经SDS-PAGE检测,证实为GST-Bax融合蛋白.