广西地区甘蔗黄叶病病毒分子鉴定

[目的]为广西甘蔗黄叶综合征（YLS）的分子检测和抗病育种提供参考。[方法]采集显症甘蔗叶样本,通过提取总RNA,利用引物P1／P2对样本递行反转录RCR（RT-PCR）扩增,对广西地区甘蔗黄叶病的病原体进行分子鉴定。[结果]经引物P1／P2扩增出630 bp的目的片段。氨基酸和核苷酸序列分析结果表明,该片段是甘蔗黄叶病毒（SCYLV）外壳蛋白基因的一部分,与其他国家SCYLV分离物同源性达95％-99％。[结论]广西甘蔗黄叶病病原确是SCYLV,该病毒可能是近年从区外或境外传入的。     

华南地区甘蔗黄叶病发生及甘蔗绵蚜传毒特性研究

近年华南多个蔗区发生由甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV)引起的甘蔗黄叶病。田间调查显示，华南地区果蔗和糖蔗均已受到该病毒的侵染，被侵染的品种有黑皮果蔗、黄皮果蔗、ROC16、ROC22、ROC25、粤糖93-159、127Q、Q174、粤糖8388和HOCP91-555等。大多田块病株零星分布，病株率0.5%～10%，但少数田块病株率超过80%。RT-PCR扩增及扩增产物序列分析揭示，华南地区大多数SCYLV分离物 CP基因核苷酸序列(591bp)与SCYLV巴西分离物(SCYLV-B1)相应基因同一率为100%，仅少数分离物与SCBV-B1存在1至3个核苷酸的差异。本文还首次证实华南地区甘蔗上普遍发生的甘蔗绵蚜为SCYLV传毒媒介。建立了能够检出单头蚜虫及侵染早期未现症植株体内SCYLV的巢式RT-PCR技术，在超过80%的饲毒2周以上的甘蔗绵蚜无翅成虫体内检测到病毒的存在。甘蔗绵蚜除能在甘蔗植株间高效地传播SCYLV外，还可将SCYLV传至高粱、水稻及玉米幼苗，每株接种15头饲毒甘蔗绵蚜，传毒成功率分别为100%（9/9）、75%（6/8）和50%（4/8）；本试验中，甘蔗绵蚜未能将SCYLV传至小麦和香蕉。     

甘蔗黄叶病毒的RT-PCR检测技术

以甘蔗黄叶病毒(ScYLV)特异性引物YLSF111和YLSR462为引物,对福建蔗区8个罹病品种的疑似病株进行RT-PCR检测,扩增出352 bp特异性片段.将PCR产物克隆后测序,序列分析表明,该片段是ScYLV外壳蛋白(CP)基因的一部分,核苷酸和氨基酸序列同源性达95%以上,与美国、印度、巴西等国家ScYLV分离物(GeneBank登录号分别为AF157029、AY236971、AF141385)CP基因同源性达100%,证实我国福建地区甘蔗黄叶综合症的病原体为ScYLV.本研究同时建立了ScYLV的RT-PCR检测技术.     

葡萄扇叶病毒外壳蛋白基因克隆和植物表达载体的构建

用RT-PCR法从葡萄扇叶病毒杭州分离物(GFLV-H)基因组RNA中扩增了该病毒分离物的外壳蛋白基因cDNA片段,并克隆到质粒pGEM-T-easy Vector.序列分析结果表明,该基因含有1515个核苷酸,编码504个氨基酸,其核苷酸和推导的氨基酸与GFLV法国分离物F13的同源性分别为88%和95%.目前该基因已成功地克隆到植物表达载体pBI121,经三亲交配导入到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中.     

菜豆黄花叶病毒外壳蛋白(CP)序列分析

以菜豆黄花叶病毒分离物、蚕豆、豌豆为试验材料,进行了菜豆黄花叶病毒外壳蛋白(CP)序列分析。结果显示,目标片段中包含819 bp的外壳蛋白序列,编码273个氨基酸。分离物的外壳蛋白基因核苷酸和推导编码蛋白质的氨基酸序列的同源性分别为98.7%~99.9%和98.9%~100.0%。与65个菜豆黄花叶病毒外壳蛋白进行序列同源性和系统进化树分析的结果表明,菜豆黄花叶病毒青海蚕豌豆分离物与云南蚕豆分离物同源性最高。外壳蛋白的序列特征揭示,NAG为菜豆黄花叶病毒中病毒的蚜传相关基序。     

甘蔗花叶病毒南城分离物外壳蛋白基因序列测定及分析

从江西南城甘蔗病株中获得1个甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)分离物,命名为SCMV-NCH。根据SCMV外壳蛋白(CP)基因N-端和C-端保守序列设计引物,对SCMV-NCH的CP基因进行RT-PCR扩增、克隆和测序,获得924个核苷酸(nt),推断编码308个氨基酸(aa)的近全长CP基因序列。与SCMV亚组SCMV、高粱花叶病毒(SrMV)、玉米矮花叶病毒(MDMV)、约翰逊草花叶病毒(JGMV)、玉米花叶病毒(ZeMV)、白草花叶病毒(PenMV)等6种病毒代表性株系外壳蛋白氨基酸序列同源性比较结果显示,SCMV-NCH与SCMV的同源性最高(86.2%),与其他5种病毒同源性相对较低(56.4%~72.2%)。与SCMV13个分离物外壳蛋白氨基酸序列进行同源性比较并构建关系树,结果显示SCMV-NCH与我国浙江2个分离物(Yuhang和Xiaosh)具有最近的亲缘发生关系。     

保定地区一种新辣椒病毒病的鉴定

从保定东郊温室大棚中典型花叶症状的甜椒病株上得到1个病毒分离物(BD),经枯斑三生烟分离纯化3次后,并保存在茄门甜椒上。通过酶联免疫方法、鉴别寄主反应、电镜观察测定等,确定保定分离物是辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)。用Trizol提取病叶总RNA,反转录为cDNA,通过2对特异性引物,分别扩增出病毒外壳蛋白基因片段和与病毒复制相关蛋白基因片段。保定分离物的病毒外壳蛋白基因,与5个PMMoV分离物核甘酸同源性为94.5%~100%,而与3个TMV分离物核苷酸同源性为65.4%~67.7%,从而进一步验证了保定分离物为PMMoV。     

葡萄扇叶病毒外蛋白基因克隆和植物表达载体的构建

用RT－PCR法从葡萄扇叶病毒杭州分离物（GFLV－H）基因组RNA中扩增了该病毒分离物的外壳蛋白基因cDNA片段，并克隆到质粒pGEM-T-easy Vector。序列分析结果表明，该基因含有1515个核苷酸，编码504个氨基酸，其核苷酸和推导的氨基酸与GFLV法国分离物F13的同源性分别为88％和95％。目前该基因已成功地克隆到植物表达载体pBI121，经三亲交配导入到根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404中。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒广东分离物的分子鉴定

采用RT-PCR方法,扩增并测定了黄瓜绿斑驳花叶病毒广东分离物(CGMMV-GD-GZ,CGMMV-GD-LZ,CGMMV-GD-LF)的外壳蛋白(coat protein,CP)和运动蛋白(movement protein,MP)基因序列。结果显示,CP基因序列全长486 bp,编码161个氨基酸;MP基因全长795 bp,编码264个氨基酸。CGMMV广东分离物与其他15个CGMMV分离物之间外壳蛋白基因核苷酸的同源性在90.9%～100%之间,运动蛋白核苷酸同源性为92.7%～100%;与同属其他13种病毒基因组核苷酸序列同源性分别仅为29.5%～56.2%和38.8%～61.8%。基于外壳蛋白和运动蛋白基因序列构建系统发育树显示,CGMMV不同分离物进化为亚洲和欧洲两大群体,3种CGMMV广东分离物与韩国、日本等亚洲分离物同源性极高,可能具有共同的侵染源。