稀有鮈鲫芳香化酶基因的表达及内分泌干扰物（EDCs）暴露对其表达的影响

克隆稀有鮈鲫芳香化酶基因(cyp19a和cyp19b)片段,半定量方法检测其组织表达特异性,实时定量PCR检测2基因在孵化后18~50 d幼鱼的发育阶段表达情况,对成鱼进行3 d的乙炔基雌二醇(EE2,1 nmol/L)和壬基酚(NP,1μmol/L)药物暴露试验,实时定量PCR检测它们对2个基因表达的影响。结果显示,克隆获得759 bp的cyp19a和407 bp的cyp19b片段,cyp19a主要在卵巢中表达,cyp19b主要在脑中表达。在幼鱼发育阶段,cyp19a的表达没有显著差异,cyp19b在38 d后出现明显的下降;成体稀有鮈鲫cyp19a受到EE2极显著抑制(0.23倍,P<0.01),但NP抑制效果不显著(0.59倍),cyp19b在EE2和NP暴露后都有上调的趋势(1.83、1.02倍)。说明cyp19基因可以作为EDCs的作用靶分子,有助于对高等脊椎动物包括人类进行预测和风险评估。     

双酚A对稀有鮈鲫胚胎及仔鱼的急性毒性

为探讨双酚A(bisphenol A,BPA)对稀有鮈鲫胚胎和仔鱼的毒性,利用静水暴露染毒法对稀有鮈鲫胚胎及仔鱼进行急性暴露。结果表明,在试验浓度范围内,BPA对稀有鮈鲫胚胎和仔鱼成活率均有显著影响(P<0.05)。胚胎暴露96 h后的半致死浓度(LC₅₀)为10.096 mg·L^-1;仔鱼暴露96 h后LC₅₀为4.237 mg·L^-1。BPA对稀有鮈鲫胚胎的毒性效应表现为孵化延迟、死亡率增加、心率下降,对仔鱼的毒性效应表现死亡率升高、心包囊水肿、心率下降、鱼鳔充气率下降。稀有鮈鲫胚胎和仔鱼对BPA毒性的敏感度存在差异,仔鱼对BPA暴露更为敏感。本研究旨在为BPA对鱼类早期发育阶段的毒性效应提供基础资料。     

氨氮对稀有鮈鲫胚胎和幼鱼的急性毒性研究

选取我国特有种稀有鮈鲫Gobiocyprisrarus 的胚胎和幼鱼作为试验材料,采用半静态生物毒性试验方法, 测定了水体中的氨氮对胚胎和幼鱼的毒性.结果表明:氨氮对胚胎和幼鱼96h的LC50(非离子氨表示)分别为 5.473mg/L和2.059mg/L,安全体积质量分数(SC)(非离子氨表示)分别为1.770mg/L和0.724mg/L,水环境 中高体积质量分数的氨氮对稀有鮈鲫的胚胎和幼鱼均有较大伤害,稀有鮈鲫幼鱼对氨氮的敏感度高于胚胎,在水 质检测方面可能更具有优势.     

纳米二氧化钛对稀有鮈鲫幼体生长的影响

通过纳米二氧化钛(nTiO_2)对稀有鮈鲫幼体生长试验,研究nTiO_228 d暴露对鱼类幼体生长的影响。结果表明,nTiO_2浓度未对稀有鮈鲫幼体生长产生致死效应,但对稀有鮈鲫生长率有影响,最低可观察效应浓度(LOEC)为4.00 mg·L~(-1),无可观察效应浓度(NOEC)为2.00 mg·L~(-1)。     

25％噻嗪酮可湿性粉剂对稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)的急性毒性及生物富集性

为评价杀虫剂噻嗪酮对我国特有物种稀有鮈鲫的影响,采用了静态法测定了25%噻嗪酮可湿性粉剂对稀有鮈鲫的急性毒性和生物富集性。结果表明,25%噻嗪酮可湿性粉剂对稀有鮈鲫的96 h-LC₅₀大于有效成分浓度100 mg·L^-1;选择有效成分浓度1和10 mg·L^-1进行生物富集试验,连续暴露8 d的富集系数（BCF_8d）分别为470.6和53.7。根据化学农药环境安全评价试验准则,噻嗪酮（25%可湿性粉剂）对稀有鮈鲫的毒性为低毒,富集等级为中等富集性。研究表明,噻嗪酮低浓度暴露的富集系数远大于高浓度暴露,并且在低浓度的水体暴露下,稀有鮈鲫体内的噻嗪酮浓度接近于高浓度的水体暴露。在使用噻嗪酮时应注意其使用范围和施用量,避免通过食物链富集对人体健康造成危害。     

苯并(a)芘、多氯联苯和滴滴涕暴露对剑尾鱼肝组织块CYP1A、P-gp mRNA表达的影响

以体外培养剑尾鱼肝组织块为试验材料,研究苯并(a)芘[B(a)P]、多氯联苯(PCB)和滴滴涕(DDT)及其混合物对CYP1A、P-gp mRNA表达的影响.试验设6个处理,分别为B(a)P、PCB单独处理组:接受不同剂量B(a)P或PCB(0.5、1、5、10 μmol/L)处理6 h;DDT单独处理组:接受不同剂量DDT(0.1、1、10、20tμmol/L)处理6 h;B(a)P+PCB、B(a)P+DDT混合暴露组:PCB(1μmol/L)或DDT(1μmol/L)与不同剂量B(a)P(0.5、1、5、10 μmol/L)联合染毒6h;同时设立1％二甲基亚砜(DMSO)组为溶剂对照组.结果显示,B (a)P单独暴露各组均显著诱导CYP1A mRNA表达,5 μmol/L组P-gp mRNA水平与各组差异显著.PCB单独暴露各组CYP1A、P-gp mRNA水平均差异不显著.DDT暴露组10、20 μmol/l高剂量组可显著诱导P-gp mRNA表达,各组CYP1A mRNA水平差异不显著.与单独暴露组明显不同的是:B(a)P 10 μmol/L +PCB 1μmol/L混合暴露组CYP1A mRNA水平与各组差异显著.混合暴露组P-gp mRNA水平与对照均差异不显著.表明剑尾鱼肝组织块CYP1A、P-gp mRNA水平在单独暴露与混合暴露中呈现不同的表达规律.     

DHP及其核受体诱导斑马鱼促性腺激素释放激素mRNA表达

为了明确17α,20β双羟孕酮(DHP)及其核受体调控促性腺激素释放激素mRNA在雄性斑马鱼脑组织中的表达机制,采用实时荧光定量PCR方法、类固醇激素活体和离体暴露方法进行试验。结果表明,野生型雄性斑马鱼活体暴露于100 nmol/L DHP水溶液,伴随暴露时间的延长,gnrh2和gnrh3 mRNA表达量呈逐渐升高趋势,24 h出现表达最高峰;野生型雄性斑马鱼活体分别暴露于10和100 nmol/L DHP水溶液24 h。与对照组相比,100 nmol/L DHP试验组gnrh2和gnrh3 mRNA表达量升高,差异显著(P<0.05),而10 nmol/L DHP试验组无显著变化(P>0.05);野生型雄性斑马鱼活体暴露于100 nmol/L DHP与100 nmol/L RU486混合水溶液24 h,试验组gnrh2和gnrh3 mRNA表达量与对照组相比无显著变化(P>0.05);野生型和孕酮核受体敲除型(pgr~(-/-))雄性斑马鱼活体分别暴露于100 nmol/L DHP水溶液24 h,与野生型试验组相比pgr~(-/-)型试验组gnrh2和gnrh3 mRNA表达量显著降低(P<0.05);野生型和pgr~(-/-)型雄性斑马鱼脑组织离体暴露于含100 nmol/L DHP的L-15培养液24 h,与野生型试验组相比pgr~(-/-)型试验组gnrh2和gnrh3 mRNA表达量显著降低(P<0.05)。由此可见,DHP与核受体结合可直接调控雄性斑马鱼脑组织中促性腺激素释放激素gnrh2和gnrh3 mRNA表达。     

雄激素和氢化可的松对山羊附睾头上皮细胞增殖的影响

为研究雄激素和氢化可的松对山羊附睾上皮细胞生长的作用模式,本研究利用酶标仪检测附睾头部上皮细胞增殖情况,实时荧光定量PCR及ELISA检测雄激素受体(AR)的表达,检测睾酮与氢化可的松对山羊附睾上皮细胞体外增殖的作用以及对AR表达的影响。结果表明:100nmol/L睾酮对附睾头上皮细胞增殖的促进效应最高且与对照组差异极显著(P0.01),200nmol/L氢化可的松促进附睾头上皮细胞增殖效应最佳并与对照组差异显著(P0.05),前者的效应明显且可以被AR阻断剂阻断;睾酮和氢化可的松对附睾头上皮细胞增殖表现为协同作用;100nmol/L睾酮与200nmol/L氢化可的松均使附睾头上皮细胞的AR mRNA和蛋白表达量上调,与对照组差异显著(P0.05),且二者共存时附睾头上皮细胞的AR mRNA和蛋白表达量极显著高于对照组(P0.01)。本研究表明睾酮和氢化可的松对附睾头上皮细胞体外增殖均有促进作用,呈明显的浓度依赖性,且二者之间存在协同作用,这为进一步研究附睾上皮细胞增殖及功能的调节机理提供了基础。     

基因组步移技术克隆稀有鮈鲫角蛋白18基因序列及序列分析

角蛋白18是角蛋白的一种,属于S型角蛋白,是在哺乳动物和两栖类动物胚胎发育中第一个表达的中间纤维蛋白。根据已发表的人、爪蟾及斑马鱼角蛋白18 DNA序列,通过DNAman同源性比较获得保守序列,并从中设计二对引物。从稀有鮈鲫基因组中PCR扩增得到2 779 bp的角蛋白18的DNA序列片段;通过基因组步移,分别获得该基因的上游和下游序列片段;最后将获得的全基因片段克隆至质粒载体pMD19T进行序列测定检验。结果显示所克隆的稀有鮈鲫角蛋白18基因全长3 765 bp。对该基因进行NCBI的Blastn同源性比较分析,表明稀有鲫同斑马鱼比较角蛋白18 DNA序列存在73.6%同源相似性;同时对该基因进行生物学分析,开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）预测表明稀有鮈鲫角蛋白18是含有7个外显子和6个内含子,共编码367个氨基酸的蛋白质。     

雄激素受体及共调节因子在睾酮调节绵羊附睾GPX5表达中的作用分析

为探究雄激素受体(Androgen receptor,AR)及共调节因子对绵羊附睾上皮细胞(Epididymal epithelial cells,EECs)谷胱甘肽过氧化物酶5(Glutathione peroxidase 5,GPX5)的调节机制,本研究采用CCK-8检测睾酮对EECs增殖的影响;利用qRT-PCR、免疫荧光法和 Western Blot法分别检测AR、GPX5、甾体激素受体共激活子 1(Steroid receptor coactivator 1,SRC-1)、CREB结合蛋白(cAMP-response element-binding protein,CBP)、p300和核受体共抑制因子2(Nuclear receptor corepressor 2,NCOR2)的mRNA水平和蛋白表达情况,采用双荧光素酶报告基因测定干扰SRC-1或p300后EECs的荧光素酶活性。结果表明:1)与对照组相比,100 nmol/L睾酮组细胞中的GPX5 mRNA和蛋白表达量极显著升高(P<0.01),1 000 nmol/L睾酮组细胞中的GPX5 mRNA和蛋白表达量差异不显著(P>0.05),但分别极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)低于100 nmol/L睾酮组;100 nmol/L睾酮组细胞中的AR mRNA和蛋白表达量分别呈极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)高于对照组,然而1 000 nmol/L睾酮组细胞中的AR mRNA和蛋白的表达量显著低于对照组(P<0.05);1 000 nmol/L睾酮组细胞中的CBP、p300、SRC-1蛋白表达极显著高于对照组(P<0.01),特别是核内的表达量明显增高。2)与对照组相比,siRNA-AR组细胞中的GPX5 mRNA和蛋白的表达量差异不显著(P>0.05),而SRC-1和p300蛋白表达量极显著升高(P<0.01)。pcDNA3.1-AR组GPX5 mRNA和蛋白表达量较对照组呈极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)升高。3)siRNA-SRC-1 和siRNA-p300组细胞中的GPX5 mRNA和蛋白表达量较对照组均显著降低(P<0.05),而AR的蛋白表达量与对照组差异不显著(P>0.05),AR的转录活性显著降低(P<0.05)。综上,睾酮对绵羊EECs GPX5、AR及其共调节因子的表达具有浓度依赖性的调节效应,睾酮通过AR及其共调节因子SRC-1和p300/CBP的协同调节GPX5表达。本研究为探究GPX5在绵羊附睾中的调节机制提供理论依据。     

狮头鹅AR基因克隆和组织表达

本研究旨在克隆鹅雄激素受体基因（Androgen receptor，AR），并了解其在不同组织中的表达情况.以狮头鹅为试验材料，采集下丘脑和睾丸组织样品，提取RNA逆转录后进行AR基因克隆，并用RACE扩增其cDNA全长序列，其它同采用实时荧光定量PCR的方法检测AR基因在各个组织中的表达情况.结果克隆获得AR基因全长cDNA序列，共得到4个转录本.通过氨基酸序列同源进行分析，发现狮头鹅AR基因在禽类和哺乳类动物中同源性较高，说明该基因在禽类和哺乳类进化保守.荧光定量PCR结果显示AR基因在狮头鹅12个组织中均有表达量，其中在腿肌、胸肌和睾丸表达量较高，表明AR基因可能参与调控狮头鹅公鹅的肌肉生长与繁殖.     

小麦TaLTR基因的克隆及初步表达分析

以小麦山融3号为试验材料,克隆了TaLTR cDNA序列(Low temperature-responsive RNA-bind-ing protein)。序列分析表明,TaLTR序列包含完整的ORF区,编码蛋白含有162个氨基酸,其氨基端包含一个RRM(RNA recognition domain)超家族保守的结构域,羧基端则富含甘氨酸;经半定量RT-PCR分析,表明TaLTR参与低温、干旱、盐胁迫逆境反应。     

多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的克隆及分析

以盐胁迫处理的多枝赖草(Leymus multicaulis)植株新鲜叶片为材料,根据其他植物谷胱甘肽还原酶(GR)氨基酸保守区序列设计简并引物,通过RT—PCR扩增到1个408 bp的cDNA片段(Genbank注册号为 AY781786);利用DNAMAN软件将5’和3’RACE获得的5’和3’端序列,拼接成1个全长1 580 bp的cDNA序列,其包含1个1 140 bp的开放阅读框架,该阅读框架编码380个氨基酸;多枝赖草谷胱甘肽还原酶氨基酸序列与其他植物的同源性为77％～92％,定量PCR结果表明,GR基因的表达随着盐胁迫时间和盐浓度的增加而加强。     

SD-大白鼠催乳素受体基因的克隆与表达

应用RACE—PCR技术,克隆了全长2743bp的SD-大白鼠催乳素受体基因（gPRLR）cDNA。序列分析表明,cDNA含421bp 5′UTR、1357bp编码区和218bp3′U,UTR。比对奶牛催乳素受体基因并将前217bp看作第1外显子,则gem基因可划分为13个外显子。推导的蛋白序列含763个氨基酸,与奶牛、鸽及猪PRLR的同源性较高,其N末端含23个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含789个氨基酸。gPRLRmRNA在成年鼠睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达。     

野桑蚕酚氧化酶原基因PPO1的克隆及其特征(英文)

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆野桑蚕(Bombyx mandarina)酚氧化酶原基因PPO1,获得其cDNA序列;该序列长2 086bp,含有一个2 058bp的完整开放阅读框,编码一个由685个氨基酸残基组成的蛋白质;该基因推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO1基因相应的氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的PPO基因所共有的典型特征。RT-PCR检测分析表明该基因仅在野桑蚕的头部和血液中表达,而Northern杂交检测表明该基因仅在血液中有表达。这些结果为进一步研究该基因的功能提供了分子基础。     

水稻L-半乳糖脱氢酶基因的克隆与序列分析

[目的]对水稻L-半乳糖脱氢酶（L-GalDH）基因进行克隆与序列分析。[方法]通过RT-PCR从水稻中克隆了L-GalDH基因,采用GenBank的BLAST程序进行序列分析。[结果]水稻L-GalDH基因的cDNA全长1 340 bp,包含一个长为951 bp的完整开放读码框,推导的氨基酸序列与其他植物的L-半乳糖脱氢酶基因的同源性较高,其中与大麦的同源性最高,序列一致率为92%,与菠菜的序列同源性稍低,一致率为71%。系统进化分析结果表明不同来源的L-GalDH基因聚为3类。[结论]该研究为L-GalDH基因的功能研究打下了基础。     

2个甜菜夜蛾信息素结合蛋白cDNA片段的克隆和序列分析

 通过比较几种已发表夜蛾科昆虫的信息素结合蛋白（PBP）氨基酸序列，设计合成一对简并性引物, 利用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）技术从甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hübner)雄虫触角扩增得到2个分别为275 bp和281 bp的cDNA片段SexigPBP1和SexigPBP2，其分别由92个氨基酸残基和94个氨基酸残基组成。通过在GenBank中进行序列的同源性比较，表明这2个序列与已知几种昆虫的PBP氨基酸序列具较高同源性。     

Aspergillus niger 乳糖酶基因的克隆及序列分析

利用PCR及RT-PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)菌株DL116中克隆到了乳糖酶基因组DNA,cDNA序列(GENBANK ACCESSION No.EF103141)。序列分析表明,乳糖酶基因组DNA序列长3368bp,其中含有8个内含子,cDNA编码区长2967bp,共编码988个氨基酸,氨基酸序列中共含有12个潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行了同源性比较。     

不结球白菜晚抽薹BcFLC1基因克隆及表达分析

采用RT-PCR、5'RACE和3'RACE方法,克隆得到了不结球白菜NJ074晚抽薹基因(BcFLC1)的cDNA全长序列。对BcFLC1基因所编码氨基酸序列的理化性质进行分析推测得到:该基因cDNA全长909bp,包含576bp的开放阅读框,编码191个氨基酸。不结球白菜BcFLC1蛋白功能域预测分析结果表明:该基因为MADS盒基因,其编码蛋白的1～60氨基酸属于MADS盒基因蛋白。荧光定量PCR分析表明:BcFLC1基因在不同生长发育阶段叶片中的表达情况不同,抽薹前高于抽薹后叶片中的表达量。BcFLC1基因在不同部位表达也存在差异,表达量从高到低依次为:叶、茎、花蕾、花和根。