棉花种子特异表达的LEA启动子克隆及功能验证

以棉花品种新陆早33号为材料,克隆获得其胚胎发育晚期丰富蛋白LEA基因的种子特异性启动子。启动子序列全长为1228bp;作用元件分析表明该区域除了具有启动子核心调控序列外,还含有多个与组织特异性、激素、逆境等表达相关的顺式作用元件,如E-box、ABRE元件、A-box等。与已报道的棉花品种Coker 201的LEA基因D34的5'端上游调控序列1212bp相比,两者具有97%的一致性。拟南芥遗传转化的功能分析结果表明,所克隆的序列能驱动GUS基因在种子中特异表达,且GUS主要在转基因植物的种子发育后期表达;其表达强度要弱于组成型的CaMV35S启动子。研究结果不仅有助于进一步深入认识棉花LEA基因功能及其表达调控规律,也为植物遗传转化提供组织特异性的启动子。     

棉花GaLMI1-like基因功能及其启动子表达分析

LMI1基因是叶片锯齿状结构发育调控的关键基因。为了研究棉花鸡脚叶发育的机理,通过PCR扩增技术从A基因组棉花亚洲棉石溪亚1号中克隆出GaLMI1-like基因及其启动子序列,大小分别为681,1 439 bp。结构域分析发现,GaLMI1-like蛋白含有与陆地棉中同源基因一样的homeobox结构域,进一步构建了GaLMI1-like基因过表达载体p6MYC-GaLMI1-like,转化拟南芥后验证了GaLMI1-like基因具有调控叶片缺刻表型发育的功能。对启动子序列进行顺式作用元件分析,发现其除了具有CACA-box和TATA-box等基本作用元件外,还具有光响应及根、茎和叶肉特异性表达相关元件。构建了GaLMI1-like启动子的GUS融合表达载体并转化拟南芥,GUS染色结果显示,该启动子能够驱动GUS基因在根中柱、茎和叶片中表达,其中在叶片中染色较深。上述结果表明,GaLMI1-like基因具有调控缺刻叶形成的功能,且此调控棉花叶形发育的功能是通过GaLMI1-like启动子调控其在叶片中强表达实现的。     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

大豆球蛋白G1启动子的克隆及表达活性分析

利用PCR的方法从大豆品种"吉豆2号"基因组DNA中克隆得到大豆球蛋白启动子G1p,长度约为686 bp,PLACE在线启动子预测工具分析表明:序列中含有多种典型的种子特异性表达元件。将克隆得到的G1p取代pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建于G1p与GUS基因融合表达的载体pCAM-G1p,通过农杆菌介导的方法在大豆根、茎、叶和种子中进行瞬时表达分析结果显示,仅能在种子中检测到GUS活性,而在根、茎和叶其他组织中基本检测不到GUS活性。说明G1基因上游686 bp片段具有种子特异性启动子的功能,G1p是一个比较高效的种子特异性启动子。     

甘蓝型油菜A7-FT启动子的功能分析

为了利用PCR技术得到甘蓝型油菜A7-FT基因启动子序列,根据甘蓝型油菜全基因组序列,利用启动子在线预测软件预测其功能与结构,根据其预测的顺式元件的分布,从5′端开始缺失的方式获得5个不同片段长度的启动子序列。构建含不同片段长度启动子的GUS基因表达载体,利用农杆菌介导拟南芥,得到T_2幼苗,经过GUS染色与脱色,探讨A7-FT基因启动子的功能,为研究甘蓝型油菜开花调控机制提供理论基础。通过PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因DNA中获得A7-FT基因启动子序列。利用PLACE和PlantCARE在线工具对该段序列进行预测,发现A7-FT基因启动子除了存在启动子核心元件CAATbox和TATAbox,还有光应答元件、激素应答元件、胚乳表达应答元件、抗逆性应答元件、生理控制相关的顺式作用元件。基于预测的顺式作用元件的分布情况,设计特异性引物,克隆不同片段长度启动子,与pCAMBIA1303载体构建5′端缺失载体,分别命名为M1、M2、M3、M4、M5。通过农杆菌介导拟南芥,GUS染色与脱色结果显示,在-1 549～-238可能存在一些负调控元件的结合位点,而-238～+1区域是该启动子的核心区段。     

玉米PLATZ基因GRMZM2G006585启动子的克隆及表达分析

高转录活性籽粒特异性启动子可调控目的基因在植物籽粒中特异性、高水平表达。为发掘玉米籽粒特异性启动子，以公开发表的玉米表达谱芯片数据为切入点，筛选出籽粒优势表达基因GRMZM2G006585,克隆其编码区上游约2 000 bp的DNA序列，命名为PZm2G006585。利用在线网站New PLACE和PlantCARE对其进行启动子顺式作用元件分析，发现其含有E-box、P-box等多个籽粒特异性相关元件，初步认为所克隆编码区上游序列为玉米来源的籽粒特异性启动子。为验证其功能，构建该启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的表达载体并进行植物遗传转化。转基因水稻的GUS组织化学染色结果表明，该启动子驱动外源基因表达模式为籽粒特异、胚优势表达；转基因拟南芥单拷贝株系T₃种子中GUS活性检测结果显示，PZm2G006585驱动的GUS活性为909.52 nmol/(min·mg)。籽粒特异性启动子PZm2G006585的发掘和功能验证为驱动目标基因在玉米、水稻等单子叶植物籽粒中特异性表达提供了候选启动子资源。     

文心兰生物钟基因OnELF3启动子克隆与表达分析

为了解文心兰生物钟基因OnELF3的转录调控,本研究采用TAIL-PCR技术从文心兰基因组中克隆到OnELF3基因起始密码子上游2 204 bp的启动子序列。使用BDGP、PlantCARE和PLACE在线软件对OnELF3基因启动子的转录起始位点与顺式作用元件进行预测。结果表明启动子序列除包含TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件外,还包含组织特异性元件、光调控元件、植物激素响应元件、胁迫反应响应元件和昼夜节律调控元件等。为探究OnELF3启动子的表达活性,构建pCAMBIA1301-p OnELF3p:GUS载体,利用农杆菌介导法,转化烟草与拟南芥。烟草叶片瞬时转化表明克隆的OnELF3启动子序列具有启动子活性。转化拟南芥结果表明,OnELF3启动子能够驱动下游的GUS基因在T2代拟南芥中稳定表达,GUS组织染色显示该启动子呈现发育与组织特异性表达。这些结果为进一步研究文心兰OnELF3基因的转录表达调控与相关功能分析提供基础。     

杨树ProWOX11启动子克隆及组织特异表达分析

作为拟南芥At WOX11的同源基因,杨树Pe WOX11a和Pe WOX11b基因在不定根发生及形态建成过程中发挥重要重要。过表达的Pe WOX11a和Pe WOX11b转基因杨树不仅不定根数量显著增加,而且在茎和叶上产生大量异位根;同时,两者的过表达也影响转基因杨树腋芽和叶片的发育。为了深入探究两者之间的时空表达调控模式及其生物学功能,本研究克隆和鉴定了Pe WOX11a和Pe WO11b基因的启动子序列,1 953 bp长度的Pro WOX11a和1 772 bp长度的Pro WOX11b。两个基因的启动子序列均含有多个植物激素的应答元件或结合位点。启动子GUS表达载体构建及遗传转化分析表明,Pro WOX11a启动子驱动GUS基因在根原基启动及随后发育早期的分生组织中特异表达,而Pro WOX11b启动子驱动GUS基因在不定根发生的重要区域下胚轴特异表达。     

大豆二酰甘油酰基转移酶基因GmDGAT1A启动子的克隆与功能分析

二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是催化三酰甘油生物合成的关键酶,在三酰甘油的合成和积累过程中具有重要调控作用。为了研究大豆DGAT基因表达调控的分子机制,以大豆品种科丰1号为材料,通过PCR方法对GmDGAT1A的启动子(promoter-GmDGAT1A,pGmDGATIA)进行克隆,并通过转化拟南芥和GUS组织定位研究其功能。结果表明:以大豆叶片DNA为模板,成功克隆到GmDGAT1A基因ATG上游2 192 bp启动子序列。序列分析表明,pGmDGAT1A除具有启动子所必需的TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有多个响应于光、赤霉素和脱落酸等顺式作用元件。以GUS为报告基因,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A,并转化野生型拟南芥获得转基因植株。对转基因拟南芥植株进行PCR检测,能扩增到2 192 bp目标条带,表明已获得含有pGmDGAT1A的转基因拟南芥阳性植株。GUS组织化学染色结果显示,转基因拟南芥幼苗的叶脉和根染色较深,但是主根和侧根的根尖部分未染色;成熟期转基因拟南芥植株的根、叶脉以及角果内的隔膜和珠柄染色较深,茎和发育的种子未染色,表明pGmDGAT1A驱动的GUS主要在转基因拟南芥的根、叶脉以及角果内的隔膜和珠柄中表达。综上,克隆的大豆GmDGAT1A启动子具有活性,能够驱动下游目标基因的表达,有望应用于转基因育种。     

甘蓝型油菜BnLPAT4启动子的克隆及表达分析

植物溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophospholipid acid acyltansferase,LPAT)是在植物不同组织中调控溶血磷脂酸生成各种磷脂酸的代谢流的关键酶。本研究采用同源克隆的方法,从甘蓝型油菜湘油15中克隆BnLPAT4基因翻译起始位点上游的调控序列,长度为1 326 bp。Plantcare在线分析表明:该序列含有CAAT-box和TATA-box等核心启动子原件,同时还有多个光响应元件、逆境胁迫响应元件、激素应答元件等。将该启动子与GUS基因融合,构建pBnLPAT4:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导法获得拟南芥T3代转基因株系。GUS组织化学染色显示,幼苗期的转基因拟南芥在叶和根部均具有GUS活性,成熟期在莲座叶、花瓣、花萼、花托及果荚中表达,而花药及种子中未检测到GUS活性。     

拟南芥中花特异表达启动子PCHS的分离及其功能初探

根据已发表的拟南芥启动子序列（AF248988）设计合成一对引物,以拟南芥（Arabidopsis）基因组DNA为模板,通过PCR技术获得了约含500 bp大小的DNA片段,经纯化后测序得到531 bp的目的片段。通过DNAman进行序列分析表明,与文献报道的PCHS启动子序列有99％的同源,含有四个花特异表达的调控元件。将此启动子替换pBI121上的CaMV35S启动子构建植物表达载体,农杆菌介导法浸染矮牵牛花、茎、叶、根。GUS瞬时表达结果表明,在花上出现较深的蓝色,而在茎上的蓝色很浅,在根和叶中不显蓝色,初步确定该启动子具有较强的花特异表达特性。     

蓝莓VcMYB启动子克隆及其功能初步分析

为探究VcMYB启动子在转录过程中如何发挥调控作用,利用FPNI-PCR法从蓝莓中克隆到调控原花青素合成相关的转录因子VcMYB的768 bp启动子序列。用PLACE和Plant CARE在线启动子预测工具分析了该启动子,结果表明其序列中存在启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box,还包含一系列的响应元件,如光响应元件、低温响应元件、防御与胁迫响应元件和茉莉酸甲酯响应元件等。为进一步分析该启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体VcMYBpro::GUS,并用农杆菌转化拟南芥。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色分析,结果表明该VcMYB启动子能驱动GUS基因在转基因拟南芥中表达,并且经脱落酸(ABA)、4℃低温、LED光照和持续光照处理后,转基因拟南芥中GUS的表达活性增强,推测该基因受ABA、低温和光的调控。     

棉花器官特异病原相关启动子的克隆与分析

通过Tail PCR分离了GHNBS基因的5'侧翼序列,PLACE分析表明其含有CAAT-box、TATA-box及乙烯、茉莉酸甲酯、脱落酸应答元件,病原菌诱发子反应元件W boxes、GT-1、MYB、MYBST1和MYB1LEPR等。同时,在这段序列上还存在一些根特异表达元件。包括2个as-1和1个EECCRCAH1在内的3个增强子元件也存在于这段序列的上游区域,它们可能增强GUS基因在转基因植物中的表达。将GHNBS基因的5′调控序列以不同缺失与GUS基因融合转化拟南芥,发现GUS基因主要在根、茎的韧皮部和叶脉中表达。PGN-1559和PGN-1117表现为器官特异性表达。而PGN-476不能特异表达,同时也不能在根部表达。SA,ABA,MeJA,Eth-ylene,枯萎病菌和细菌DC3000处理后GUS活性均有显著上升,说明GHNBS基因的5′调控序列含有相应的应答反应因子,是一个器官特异以及与病原相关的启动子。     

大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析

GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰8号基因组中分离到大豆抗逆基因GmDREB3启动子片段, 长度1 648 bp。该片段富含A/T碱基, 还含有TATA-box、低温响应元件MYC及其他顺式元件MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和GUS荧光定量测定分析各区段调控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。     

大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析

GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰8号基因组中分离到大豆抗逆基因GmDREB3启动子片段, 长度1 648 bp。该片段富含A/T碱基, 还含有TATA-box、低温响应元件MYC及其他顺式元件MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和GUS荧光定量测定分析各区段调控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。     

花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子的克隆及功能分析

Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)是决定植物体内饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比值的关键酶。以花生品种豫花9326基因组DNA为模板,通过基因组步移技术,克隆到花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因(Ah SAD)起始密码子ATG上游720 bp片段,利用5'RACE方法获得了该基因的5'UTR序列,通过序列比对确定720 bp片段为Ah SAD启动子区域。PLACE在线启动子预测分析表明,该序列具有真核生物启动子必需的核心元件TATA-box和CAAT-box,含有多个与光诱导和激素响应相关顺式序列元件。将Ah SAD启动子片段替换pBI121质粒中的CaMV35S启动子驱动下游GUS基因表达,构建植物表达载体pBI-PAh SAD。通过农杆菌介导法转化拟南芥和在花生不同组织中瞬时表达,利用GUS组织化学染色研究其表达特性。表明在拟南芥和花生受体中,AhSAD启动子主要调控下游基因在根、茎、叶片和子叶中表达,在花生的果针中也检测到GUS活性;拟南芥的茎生叶只有叶脉中具有GUS活性,而花生整个叶片中都具有GUS活性。     

水稻rTGA4转录因子的启动子特征分析

TGA转录因子通过与NPR1基因协同作用参与植物对病害的防御作用。从水稻突变体HX-3基因组中分离到一个TGA转录因子rTGA4的5’非翻译区1 995 bp的序列(pTGA),该序列与日本晴基因组序列仅有94%的相似性。经PLACE和PlantCARE序列分析表明:该片段含有典型的TATA-box、CAAT-box等基本转录元件,以及脱落酸、乙烯、茉莉酸甲酯、赤霉素以及病原菌响应元件等。将得到的pTGA利用T/A克隆法连接到植物表达载体pCXGUS-T/A上,通过花序浸染法转化拟南芥,并对转基因拟南芥进行分子检测及GUS组织化学染色。结果表明,在苗期时GUS主要在幼苗根尖表达,在其他部位均没有表达;而在成熟期GUS在多处均有表达,特异性并不明显,表明该启动子是受生长发育阶段调控的组织特异性启动子。通过对rTGA4启动子的特征研究,为进一步克隆HX-3中的抗性基因以及利用奠定基础。     

陆地棉钾转运体基因GhHAK5启动子的克隆与功能分析

KUP/HAK/KT钾转运体基因的转录调控是植物响应低钾胁迫的一项重要机制。克隆和分析棉花钾转运体基因的启动子,不仅有助于了解其表达模式及调控机制,对于改良棉花的钾吸收特性也具有重要意义。陆地棉钾转运体基因GhHAK5是一个在根中特异性高表达的基因,其表达受低钾胁迫诱导,目前关于该基因启动子的功能还不清楚。本研究以陆地棉品种百棉1号为材料,通过PCR方法对GhHAK5上游2000bp启动子片段(pGhHAK5)进行克隆,并通过转化拟南芥、GUS组织定位和低钾诱导表达特性分析来研究其功能。结果表明, pGhHAK5除具有TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有多个响应于光、逆境胁迫、植物激素和生物钟等的顺式作用元件。pGhHAK5与雷蒙德氏棉pGrHAK5在重要调控元件的数量和位置分布上具有较高的一致性,均具有5个参与根特异性表达调控的元件(ATAAAAT)和1个参与低钾条件下转录调控的ARF转录因子结合位点(TGTCNN)。GUS组织化学染色结果显示,转基因拟南芥幼苗的叶脉和胚轴维管束组织染色较深,根系染色较浅;成熟期转基因拟南芥植株的根、叶脉和花萼维管束组织染色较深,茎和荚皮染色较浅,表明pGhHAK5驱动的GUS主要在拟南芥成熟的根和地上部维管束组织中表达。进一步低钾诱导表达特性分析表明, PGhHAK5驱动的GUS在拟南芥幼苗幼嫩根中的表达很弱,且其表达不受低钾胁迫诱导而增强,表明PGhHAK5可能是一个主要在成熟根中具有功能的低钾诱导型启动子。转录组分析和荧光定量PCR结果表明, GhHAK5主要在成熟的根中表达,且其表达受发育时期的影响,该结果与pGhHAK5驱动的GUS在拟南芥根中的表达结果一致。本研究结果有助于深入了解GhHAK5表达调控的分子机制,并为棉花钾吸收效率的提高及钾高效棉花品种的培育提供理论依据。     

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14启动子克隆与功能分析

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14受低磷诱导表达,其超表达显著提高植物有机磷利用效率,为进一步探究其调控机制,本研究以GmPAP14cDNA序列检索大豆参考基因组,获取基因上游启动子序列,设计引物克隆了中黄15 GmPAP14启动子序列。利用PLACE与PlantCARE预测启动子调控元件发现,该序列中含有增强子调控元件、组织特异表达元件,根特异表达元件、转录因子PHR1结合的PIBS元件等。构建了GmPAP14启动子3个5’端缺失片段融合GUS的植物表达载体PGmPAP14-2568-GUS、PGmPAP14-2238-GUS、PGmPAP14-1635-GUS,并通过Floraldip法获得转基因拟南芥。利用GUS染色和活性测定分析GmPAP14启动子不同片段表达活性发现,正常磷条件下各片段转基因拟南芥均在根尖表达,低磷条件下GUS染色可扩展到成熟区和根毛,另外转PGmPAP14-2238-GUS植株的GUS活性最高。这些结果为后续的基因调控研究奠定重要基础。     

巨胚稻OsGAD_3基因启动子的序列及活性分析

本研究以富含γ-氨基丁酸的巨胚稻"Tge B"基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到GABA合成关键酶基因Os GAD3的上游959 bp启动子序列。序列分析表明:Os GAD3启动子不仅含有转录必备的TATA box、CAAT box元件,还含有分生组织特异性表达调控元件CAT-box、CCGTCC-box以及一些非生物胁迫和激素响应元件等。将该启动子序列与GUS基因融合构建表达载体,转化水稻后进行GUS组织化学染色分析,结果显示,Os GAD3启动子驱动的GUS基因在转基因植株的根、茎中具有较高的表达活性,且在根尖和茎初生韧皮部区域的表达更为明显,在种胚及叶片切口处也能检测到GUS表达。浸水后种胚中的GUS活性显著提高,且随着浸水时间的延长呈逐渐增加趋势。研究结果为了解巨胚稻Os GAD3的表达调控机制提供了依据。