检测疫苗中猪肺炎支原体污染的PCR-斑点杂交法和套式PCR法比较研究

为建立一种敏感、特异的检测疫苗中猪肺炎支原体污染的方法,设计了猪源支原体PCR通用外套引物和猪肺炎支原体种特异性内套引物及地高辛标记寡核苷酸探针,建立了PCR-斑点杂交技术,应用于猪瘟活疫苗中猪肺炎支原体污染的检测,并与套式PCR技术进行比较研究.结果显示,探针最低检出DNA量为23.4 pg,比套式PCR(最低检出量为62.5 pg)敏感性更高,且探针与鸡毒支原体和大肠杆菌DNA无交叉反应.对来自6个生产厂家共90批疫苗的检测结果显示,PCR-斑点杂交法比套式PCR法对疫苗猪肺炎支原体污染的检出率高10%.以上结果表明PCR-斑点杂交法具有更高的敏感性和特异性,在疫苗猪肺炎支原体污染的检测中具有推广应用价值.     

兔出血症病毒套式PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的兔出血症病毒的VP60基因序列，设计了2对引物，建立了检测兔出血症病毒的套式PCR检测方法．先用外引物扩增一段389bp的DNA片断，继而用内引物以扩增产物为模板进行第2次扩增（即套式PCR），以提高结果的准确性，避免一次性PCR的假阳性结果．用该方法对12份RHD样本进行检测，检出率为100％．     

猪肺炎支原体套式PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的猪肺炎支原体P36(L-乳酸脱氢酶)全基因序列,设计合成了2对引物,建立套式PCR方法。运用该方法对猪肺炎支原体不同菌株培养物进行了扩增,并对经肺内免疫猪支原体肺炎活疫苗后支气管肺泡灌洗液进行了检测。结果表明,不同菌种均能扩增出427 bp的目的条带,而其他病原菌未出现特异性扩增条带。建立的套式PCR方法检测猪肺炎支原体的最低检测限度为10个CCU(颜色变化单位)。支气管肺泡灌洗液检测结果表明,经肺内免疫的猪支气管肺泡灌洗液扩增结果均为阳性。     

ARMS-PCR对棉花SNP分型的研究

[目的]在已知SNP的情况下,找到适合棉花SNP的简便验证方法.[方法]利用四引物扩增突变体系(tetra-primer amplification refractory mutationsystem PCR,Tetra-primer ARMS-PCR)对槔花SNP分型进行验证.[结果]根据深圳华大基因已组装的棉花转录本做为参考,分别将新海21号和新陆中36号的转录组测序样品比对到参考基因,通过SOAPsnp技术检测样品的单核苷酸多态性.棉花海陆杂交亲本的38个单核苷酸多态性位点设计出的66组SNP引物进行验证.通过优化PCR反应体系,反应条件,调整内外引物浓度和PCR体系的优化,从66组引物中扩增出11组引物,得到了良好的分型效果.[结论]四引物扩增受阻突变体系聚合酶链式反应是一种简单快捷而有效的SNP基因分形方法.     

玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法的建立

[目的]建立玉米内州萎蔫病菌的快速恒温扩增检测技术.[方法]利用GenBank公布的玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis,Cmn)16S-23S序列设计LAMP(loop-mediated isothermal amplification)引物,建立玉米内州萎蔫病菌LAMP检测体系,并对反应条件进行了优化.[结果] LAMP在内引物、环化引物和外引物比为6∶4∶1(30 pmol∶20 pmol∶5 pmol)的25山体系下64℃反应30 min为最佳反应条件,且LAMP引物能从供试的7种菌株中特异性扩增出Cmn梯度性条带.以玉米内州萎蔫病菌基因组和菌悬液梯度稀释液为模板检测LAMP体系的灵敏度,结果显示,LAMP检测体系针对基因组和菌悬液的灵敏度分别达到了50fg和3.6CFU,比普通PCR灵敏度高100倍.[结果]LAMP检测体系简单、快速、灵敏度高、特异性好,在玉米内州萎蔫病菌检测方面潜力巨大.     

鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立

 【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20 μL ,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。     

贝类奥尔森派琴虫可视化LAMP检测技术的建立与应用

根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理,针对奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)的5.8 S核糖体RNA与内转录2间隔区序列,设计了6条特异性LAMP扩增引物,分别为两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。通过对反应条件的优化,建立了一种适用于贝类奥尔森派琴虫的可视化LAMP检测技术。该技术只对奥尔森派琴虫发生扩增反应,产生黄绿色荧光扩增产物,对其他对照DNA样品无扩增反应,不产生黄绿色荧光。对F3和B3外引物扩增产物进行测序分析,其序列与Gen-Bank中奥尔森派琴虫序列一致,检测结果具有高度特异性。对奥尔森派琴虫质粒DNA的最低检测量为100 fg。用该项LAMP技术与OIE公布的派琴虫PCR检测技术分别对50份分别来自华东及华南沿海地区的牡蛎样品进行检测,同时对PCR阳性样品进行测序分析。结果 LAMP检测到2份奥尔森派琴虫,PCR方法检测到9份派琴虫。测序分析结果表明,PCR方法检测到的9份派琴虫阳性样品中有2份为奥尔森派琴虫,其结果与LAMP检测结果相符,说明该技术适用于贝类样品奥尔森派琴虫的检测。     

猪肺炎支原体PCR鉴定方法的建立

根据猪肺炎支原体的P36基因序列设计一对引物,建立猪肺炎支原体PCR检测方法,并对该方法进行了特异性和敏感性试验。成功建立了猪肺炎支原体特异且敏感的PCR检测方法,可区别猪鼻支原体、絮状支原体和鸡毒支原体,最低检出量为4.26 ng。     

鸡传染性喉气管炎病毒PCR诊断技术研究

根据传染性喉气管炎病毒 (ILTV)基因的核苷酸序列 ,设计并合成了一对引物 ,以ILTV北京E2株、ILTV山东分离株和 4个发病鸡喉气管组织的DNA为模板 ,利用PCR反应扩增出了一条长 12 0 0bp的核苷酸片段 ,而以正常绒尿膜组织、鸡正常喉气管组织、鸡传支病毒、鸡新城疫病毒感染鸡胚的尿囊膜DNA为模板的PCR扩增反应 ,则为阴性 ,说明该方法对ILTV是特异的。敏感性实验表明 ,该体系可检测到 40pg的ILTV感染鸡胚尿囊膜DNA。对发病鸡不同部位DNA的PCR扩增结果表明 ,喉气管是ILTV的主要增殖部位     

家蚕核型多角体病毒LAMP可视化检测技术的建立

[目的]建立针对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的环介导等温扩增(LAMP)可视化检测技术,为生产现场进行家蚕血液型脓病早期诊断提供技术支持.[方法]以BmNPV多角体蛋白基因po如为扩增靶标,分别设计5组内/外引物和5条环引物,根据扩增效率筛选最佳引物组合;优化LAMP反应条件,并进行LAMP检测的特异性、敏感性及临床样本检测试验;使用羟基萘酚蓝(HNB)染色对结果进行比色观察,对简化样品处理的条件进行摸索.[结果]使用环引物后LAMP对BmNPV基因组DNA的最低检测浓度为7fg/μL,检测灵敏度得到有效提高,且反应时间缩短.建立的LAMP检测方法对靶标DNA扩增具有特异性,对样本的检出率高于常规PCR,其最低检测限是常规PCR的100倍.在反应前加入HNB,结果易判断且能减少交叉污染.感染家蚕血淋巴进行100℃煮沸处理后即可直接用于LAMP反应,既简化了操作步骤,又降低了检测成本.[结论]针对BmNPV建立的LAMP可视化检测技术具有灵敏、快捷、可靠的特点,适合用于生产现场的BmNPV感染早期诊断.     

新城疫单抗酶联试剂盒对鸡群中强毒感染的监测试验

用新城疫(ND)单抗酶联试剂盒检测从疑有新城疫病毒强毒感染的鸡群中采集泄殖腔棉拭样品68份,检出阳性20份。随机对其中15份样品进行病毒分离,结果阳性符合率为100％(15/15)。结果表明,该试剂盒特异性强,灵敏度高,诊断快速,易于基层推广应用。为ND的确诊和免疫鸡群中NDV强毒感染的监测提供了新方法。     

细胞和病毒活疫苗中支原体污染的PCR检测方法建立与应用

[目的]在生物学研究及生物制品生产中易发生支原体污染,针对我国当前支原体检验方法在时效性和敏感性上的不足,建立一种简便快速、特异敏感的支原体检验PCR方法.[方法]从SILVA数据库下载包含全部细菌、古菌和真菌的核糖体rRNA小亚基(16S/18S,SSU)参考序列的库文件SILVA_123-SSURef,从中提取全部...     

不同类型H5亚型禽流感疫苗的免疫保护效力比较研究

为比较以我国首个H5亚型禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/1996(H5N1)\[GS/GD/96\]为基础构建的新型重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re\|1株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（H5亚型）、禽流感、新城疫重组二联活疫苗（rLH5\|1株）以及禽流感DNA疫苗（H5亚型,pH5\|GD）的免疫保护效力。分别将四种禽流感疫苗以2.8 μg HA/0.3 mL（肌肉注射）、103PFU/100 μL（刺种）、106EID50/100 μL（滴鼻、点眼）、15 μg/200 μL（肌肉注射）等不同剂量和方式免疫3周龄SPF鸡,首次免疫3周后再加强免疫一次,加强免疫2周后用106EID50的高致病力禽流感病毒（HPAIV） GS/GD/96鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况。分别于攻毒后第3 d、第5 d、第7 d采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫及攻毒后血清HI抗体的动态变化。所有疫苗均可对免疫鸡形成100%完全保护（不发病、不致死、不排毒）;在病毒攻击前,灭活疫苗（H5N1亚型,Re\|1株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（H5亚型）、禽流感、新城疫重组二联活疫苗（rLH5\|1株）以及禽流感DNA疫苗（H5亚型,pH5\|GD）所诱导的HI抗体平均水平分别为875log2、6.5log2、5.13log2和7.88log2。新型的基因工程疫苗具有良好的免疫保护性,已经或将在H5亚型HPAIV的防治实践中起到有益的补充作用。     

2009-2011年市售商品化猪流行性乙型脑炎弱毒活疫苗的质量评估

为了解目前市售商品化猪流行性乙型脑炎弱毒活疫苗的质量,利用TCID50效价测定和RT-PCR 2种方法对2009-2011年市场销售的主要国产疫苗产品进行了检测。结果发现,目前市售的疫苗产品中活病毒含量差异较大,虽然部分产品可达103.80 TCID50/头份,但有些产品含量极低。RT-PCR检测结果与TCID50效价测定的结果基本一致。这表明目前市售的乙脑疫苗质量良莠不齐,部分疫苗的抗原含量可能难以满足生产要求,这为规模化猪场乙脑防控的疫苗选择提供了重要参考依据。     

柑橘半穿刺线虫防治试验

[目的]筛选低毒高效的杀线剂,为半穿刺线虫的防治提供科学依据.[方法]进行10%噻唑膦颗粒剂、2.5亿个孢子/g厚孢轮枝菌微粒剂、0.5%阿维菌素颗粒剂、24.5%阿维菌素乳油、10%丙线磷颗粒剂、2亿/g盐生菌及2亿/g盐生菌+0.5%阿维菌素颗粒剂对柑橘半穿刺线虫田间防治效果试验,药后30 d统计不同药剂对柑橘半穿刺线虫的防治效果.[结果]供试的6种药剂对半穿刺线虫均有较好的防效,对土壤中和根上线虫的防效均在50%以上,其中10%噻唑膦颗粒剂的防效最好,对土壤中和根上线虫的防效达80%以上;其次为24.5%阿维菌素乳油和2.5亿个孢子/g厚孢轮枝菌微粒剂,两种药剂对土壤中和根上线虫的防效为70%~75%.[结论]10%噻唑膦颗粒剂、2.5亿个孢子/g厚孢轮枝菌微粒剂和24.5%阿维菌素乳油对柑橘半穿刺线虫有较好的防治效果,且对柑橘生长无不良影响,可作为柑橘半穿刺线虫的防治药剂在柑橘生产上推广应用.     

嗜水气单胞菌3种疫苗免疫的青鱼外周血免疫指标的变化

将福尔马林灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、菌体外膜蛋白(OMP)和菌体脂多糖(LPS)作为免疫原,分别免疫健康青鱼。在免疫1、2、4、7、14、21、28d后进行外周血的血细胞计数和白细胞分类计数,测定细胞吞噬活性和抗体效价,结果表明:3种免疫原均可诱导红细胞和白细胞数量增加,并引起各种白细胞分类百分比变化,提高吞噬活性和抗体效价;免疫应答早期(第1周)主要是红细胞、单核细胞和中性粒细胞数量明显增加,吞噬细胞的吞噬活性迅速提高,吞噬百分比(PP)和吞噬指数(PI)第4天达峰值,F-AH组、OMP组和LPS组的PP、PI值依次分别为39.84%、46.53%、41.59%及3.94、4.26、3.77;随后则是淋巴细胞大量增殖,第21天淋巴细胞数量和抗体效价达峰值,F-AH组、OMP组和LPS组的抗体效价分别为1∶426.67、1∶341.33和1∶213.33。免疫28d后活菌攻毒的结果表明,OMP组的免疫保护率为75%;LPS组为67.8%,均明显优于F-AH组(50%)。可见3种免疫原均能通过促进青鱼血细胞增殖、提高吞噬细胞的吞噬活性、产生特异性抗体等方式增强机体的免疫保护力。     

一株乳酸乳球菌对棒曲霉素的去除作用

以筛选得到的可有效去除棒曲霉素的食品生产用菌株乳酸乳球菌MG1363为实验材料,通过改变环境温度、pH对其降解特性进行研究,并通过灭活菌体、提取粗酶液等手段,对乳酸乳球菌MG1363降解棒曲霉素的机理进行初步探究。结果表明,温度、pH对乳酸菌去除棒曲霉素活力的影响显著(P<0.05),去除棒曲霉素的较佳反应环境为30 ℃、pH值5.5~6.0。乳酸乳球菌MG1363既能物理吸附棒曲霉素,也能通过酶解作用降解棒曲霉素,且发挥降解活性的酶为胞内酶。乳酸乳球菌MG1363酶解棒曲霉素为其自身固有的特性,但棒曲霉素可诱导乳酸乳球菌的降解活性。     

活毒疫苗中禽白血病病毒污染的检测方法探讨

[目的]探讨活毒疫苗中禽白血病病毒污染的检测方法.[方法]随机抽取安徽省鸡群使用的国内外活毒疫苗,使用对禽白血病病毒（ALV）群特异性p27抗原ELISA检测试剂盒进行检测,同时根据禽白血病痛毒各亚群保守的pol基因设计引物,进行PCR检测.[结果]7个国内公司鸡传染性法氏囊B87株检测结果均为阳性,某国外公司鸡痘、鸡传染性喉气管炎检测结果呈阳性,某国内公司为阳性.鸡新城疫lasota株共检测疫苗35份,检出率达28.57％.ELISA检测结果与PCR结果相一致.[结论]使用p27抗原ELISA检测试剂盒和PCR法均可作为活毒疫苗中ALV污染检测的有效方法,说明活毒疫苗中ALV污染是ALV传播的重要因素.     

巴西橡胶树树根组织培养外植体消毒研究

[目的]寻找一条降低橡胶树树根组织培养中外植体污染的有效途径。[方法]对巴西橡胶树树根进行组织培养,取林段断根处理30d后的新根为外植体,采用1g/L多菌灵、0.1%HgCl2和不同浓度益培隆对其进行了消毒试验。[结果]在常规消毒前先采用1g/L多菌灵对外植体处理2.5h,再用75%乙醇消毒30s及0.1%HgCl2消毒6min,然后接种到添加0.1%益培隆的固体愈伤诱导培养基上,培养30d后外植体污染率下降至44.59%,存活率达25.60%。[结论]该研究为降低橡胶树树根组织培养中外植体污染提供了理论依据。