橘蚜传播柑橘衰退病毒的研究进展

就橘蚜传播柑橘衰退病毒 (CTV)的传毒特性、传毒率、影响传毒率因素、与柑橘衰退病流行的关系、对混合株系的虫传分离作用以及带毒橘蚜的分子生物学检测等研究进展作一综述 .橘蚜传播 CTV的方式为非循回型半持久式 ,其从甜橙和墨西哥莱檬植株上传播 CTV的效率高于棉蚜、橘二叉蚜和绣线菊蚜等蚜虫 .橘蚜对 CTV不同株系的传毒率有所差异 ,对重型株系的传毒率较轻型株系高 .影响传毒率的因素有蚜虫发育虫态、毒源植物、接毒植物和环境条件等 .橘蚜与酸橙砧甜橙衰退病的发生与流行 ,特别是衰退型强株系衰退病的发生与流行有密切相关性 ,它是甜橙衰退病发生与流行的最主要传播介体 .橘蚜对 CTV具有分离株系的作用 ,通过单虫传播 ,可以将混合感染状态的 CTV不同株系分离而获得纯化株系 .检测橘蚜携带 CTV的分子生物学反转录 -聚合酶链式反应技术已建立 ,并已应用于检测橘蚜等蚜虫的单虫带毒情况 .讨论认为 ,不同发育虫态、毒源植物、接毒植物和环境条件等因素对橘蚜传播 CTV的影响 ,特别是毒源植物和温度条件对橘蚜传毒率的影响 ,及利用橘蚜单虫传播分离 CTV株系等方面的研究有待进一步加强     

褐色橘蚜中柑橘衰退病毒实时荧光定量 RT-PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法,测定褐色橘蚜（Toxoptera citricida）中柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）含量。【方法】根据CTV CP25保守序列,设计特异性引物HD-F/R,通过优化得到最佳反应条件建立橘蚜中CTV实时荧光定量RT-PCR,并进行灵敏性、重复性检验,评价该方法的可行性。应用该方法测定单头橘蚜中CTV含量。【结果】该实时荧光定量RT-PCR方法最低检测限为9.0拷贝/μL,其灵敏度是常规RT-PCR的100倍。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关性系数为0.998,扩增效率达104.7%。批内和批间变异系数均小于3.24%,表明该方法重现性好。获毒24 h单头橘蚜中CTV最低含量为2.5×103拷贝,最高含量为1.24×106拷贝。【结论】本研究建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法能够准确检测褐色橘蚜中的CTV,可用于研究褐色橘蚜-CTV-寄主互作关系及CTV的流行。     

褐色橘蚜在健康与CTV植株上的EPG比较

利用刺探电位图谱（EPG）技术对褐色橘蚜Toxopter acitricida （Kirkaldy）在健康与感染CTV的植株上的取食行为进行了比较研究.结果显示,褐色橘蚜在二者上均产生8种取食波形,分别为非刺探波（np波）、路径波（A波、B波、C波）、Pd波、韧皮部分泌唾液波（E1波）、韧皮部被动吸食波（E2波）以及木质部主动吸食波（G波）.刺探过程中,二者非刺探总时间（np波）存在差异;褐色橘蚜在健康植株上的刺探次数最多且C波的总持续时间最长,与感病植株差异显著.感病植株上,E1波的次数和持续时间均显著多于健康植株.褐色橘蚜在感病植株上E2波的总持续时间为（241.33±24.12 min）,显著长于在健康植株上（160.30 ±24.63 min）的持续时间.由此可初步推断,感染CTV的植株在一定程度上会增加褐色橘蚜获毒与传毒的几率.     

柑橘衰退病毒株对两种橘蚜不同翅型取食行为的影响

为明确感染柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)的柑橘对不同翅型橘蚜取食行为的影响,通过刺探电位图谱技术(electrical penetration graph,EPG)对褐色橘蚜和棉蚜在感染CTV植株上的取食行为进行持续记录,与健康植株进行比较分析。结果表明,褐色橘蚜无翅型在感病植株的参数均与有翅型无显著差异;棉蚜无翅型在感病植株上的非刺探波(no penetration,np波)和路径波(C波)的总持续时间、电势落差(potential drops,pd波)的次数均显著小于有翅型,C波和刺探的次数均极显著小于棉蚜有翅型。褐色橘蚜无翅型在感病植株上的pd波的次数和韧皮部分泌唾液波(E1波)的平均持续时间显著小于棉蚜无翅型;褐色橘蚜有翅型在感病植株上的C波的次数和总持续时间、刺探的次数、pd波的次数和总持续时间均极显著小于棉蚜有翅型,韧皮部被动吸食波(E2波)的总持续时间和平均持续时间均极显著大于棉蚜有翅型。褐色橘蚜无翅型在感病植株上的刺探和pd波的次数均显著高于健康植株,但总刺探时间相反,np波、C波和非韧皮部阶段的总持续时间极显著高于健康植株,E2波的总持续时间极显著短于健康植株。表明柑橘感病状态对无翅型和有翅型的影响是相似的;柑橘感染CTV对褐色橘蚜无翅型的取食行为影响明显,且偏好健康植株,从而促进病毒的传播。     

抗柑橘衰退病毒基因工程研究进展

本文从选育和利用抗（耐）柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）的柑橘品种和砧木、弱毒株交叉保护、转基因诱导的CTV抗性等方面综述抗柑橘衰退病毒基因工程研究进展,并就人工miRNA（artifical microRNA,amiRNA）介导抗性加以展望,旨在为更好地控制CTV危害提供借鉴。     

柑橘衰退病毒分子生物学研究进展

柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)是对世界柑橘生产具有严重为害的重要病原物之一。近年来，CTV的分子生物学研究取得了很大的进展。本文综合有关文献，主要就CTV的基因组结构与功能、复制与表达及其分子诊断等方面进行综述。同时，本文简要指出了目前CTV分子生物学研究中存在的问题，并对研究前景做了简要展望，认为关于CTV的弱毒株系构建、弱毒系交叉保护机理、抗病毒基因工程等还有待进一步深入研究。     

胡柚上柑橘衰退病毒的分子检测

胡柚是我国东部地区重要的柑桔栽培品种.近年来,一种以叶片黄化为主要症状的新病害在胡柚种植区暴发流行.通过血清学和分子生物学检测,研究首次从黄化的胡柚叶片中检测到柑橘衰退病毒.系统进化分析表明,分离的CTV CS-7分离物与P09.18、NZRB-TH30等分离物具有较近的进化关系,而与T30等强毒株系有较大的遗传距离,...     

江西赣州柑橘衰退病毒种群构成变化研究

通过研究柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)的种群构成,探究江西赣州纽荷尔脐橙上茎陷点型衰退病暴发的原因.从赣州的10个区县采集了199份疑似感染了CTV的纽荷尔脐橙样品,对阳性样品进行了8种基因型的检测,结果发现,有112份样品感染了CTV,且均含有2种及2种以上的基因型.最常见的基因型组合为T36+VT+T3+T30+S1+RB和T36+VT+T3+T68,分别占总数的13.4%和9.8%.与2004-2007年采集的CTV样品相比,2019-2020年采集的样品中新出现了RB, T30和HA16-5基因型,且T36和RB基因型的检出率显著上升.赣州CTV的种群结构发生了改变,RB和HA16-5基因型可能是引起赣州纽荷尔脐橙上茎陷点型衰退病暴发的原因.     

柑橘衰退病毒基因RNAi载体的构建

基于转化病毒基因介导抗性,通过在植物表达载体p CAMBIA 2301上插入启动子–内含子–终止子的方式,构建一种含有发夹结构的、通用型强的RNAi载体骨架结构;以柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)的p25、p20和p23基因保守序列为模板设计正向片段和反向片段,先后与骨架载体连接,成功构建了3个RNAi载体(分别命名为ds2301–p25、ds2301–p20和ds2301–p23),并将载体ds2301–p23注射入墨西哥莱蒙叶片。制作p23基因的地高辛标记探针,用Northern杂交检测是否有si RNA产生。结果表明:用Northern杂交可以检测到p23特异的si RNA,在墨西哥莱蒙叶片中瞬时表达的农杆菌ds2301–p23可以发生RNAi,表达有效的si RNA。本研究中构建的骨架载体可以广泛用于RNAi载体的构建,含有柑橘衰退病毒基因片段的3个载体可以用于基因功能分析及具有CTV抗性的柑橘种质资源获得。     

中国野生柑橘上衰退病毒分离株分子特征分析

 【目的】了解中国野生柑橘上携带柑橘衰退病毒（CTV）分离株的CP/HinfⅠRFLP组群构成和分子特征。【方法】运用RT-PCR对采自中国云南、广西、四川、湖南、江西等省11个野生柑橘上CTV分离株的病毒衣壳蛋白基因(CPG)进行扩增，利用RFLP和SSCP对CPG进行分析，并将测定的CPG序列进行同源性比较和聚类分析。【结果】发现野生柑橘上11个CTV分离株以单一组群感染为主；这些CTV分离株CPG的核苷酸序列和相应的氨基酸序列同源性分别为92.5％～99.5％和95.0％～100％；与GenBank收录的9个全基因组CTV分离株的相应基因序列进行聚类分析，其核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为92.1％～98.8％和94.6％～100％。【结论】序列同源性比较说明CTV CPG具有高度保守性，同时系统进化分析表明收集到的野生CTV分离株与国外分离株分属5大类群，具有较复杂的亲缘关系。     

赣南柑橘产区衰退病毒外壳蛋白基因初步分析

[目的]对江西赣南柑橘果园感染衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)样品的外壳蛋白(CP)基因进行克隆及序列遗传信息分析,为利用弱毒株交叉保护法预防该地区CTV的蔓延奠定基础.[方法]运用RT-PCR扩增样品的CP基因并测序,应用软件检测CP序列基因重组,分析碱基含量,再将所测序列与10个外国CTV分离株计算核苷酸遗传距离,比对序列同源性及构建系统发育树.[结果]214份柑橘样品中有78份感染了CTV,发病率为36.4％.78个样品中仅有一个存在基因重组现象;78个CTV分离株CP基因全长序列均为672 bp,无碱基缺失、插入等现象,CP基因平均GC含量为52.8％,AT(U)为47.2％;所有样品核苷酸遗传距离在0～0.072,与10个已知CTV分离株CP基因核苷酸遗传距离在0～0.106.78个样品的CP基因核苷酸及其推导氨基酸序列同源性分别为89.1％～100.0％和92.3％～100.0％,与10株已知CTV分离株的同源性分别为76.5％～98.9％和73.6％～99.5％.系统进化分析结果表明,78个分离样品与10株已知CTV分离株可聚为四大类群,第Ⅰ类群包含49个分离样品和7个症状不同的已知CTV分离株(6个强毒型和1个弱毒型);第Ⅱ类群包含21个样品,国外强毒株系Qaha和引发茎陷点、速衰症状的Mexico-ctv株系聚于此类群;第Ⅲ类群仅由采自瑞金的CRJ14组成;第Ⅳ类群包括一个国外强毒株系HA16-5和采自江口、宁都的样品.[结论]赣南柑橘产区CTV分离株的CP基因保守性较高,序列存在一定程度的变异;各分离株间亲缘性较高但关系复杂,大部分样品与强毒型和茎陷点型分离株相关.     

柑橘衰退病毒柚类分离物CP基因的克隆及原核表达分析

以来自湖北省的HB柚柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)分离物(CTV-HB1)为材料,利用RT-PCR技术对其CP基因进行克隆,序列分析结果表明:CTV-HB1与典型茎陷点分离物SY568和NUagA的核苷酸和推定氨基酸的序列相似性均在97%以上,而与CTV速衰分离物T36和弱毒分离物T385和T30的核苷酸和氨基酸序列相似性较低,均在95%以下。将CP基因片段连接到表达载体,转化大肠杆菌后诱导重组蛋白的表达。SDS-PAGE和Westen-blot分析结果表明,经IPTG诱导后产生了预期大小的重组蛋白,该蛋白可与CTV-L5提纯病毒制备的多克隆抗体发生特异性免疫反应。     

梅州市柑橘衰退病发生原因及综合防控技术

介绍了柑橘衰退病病原及表现,探讨了梅州市柑橘衰退病的发生原因,并提出了综合防控技术,具体包括选用耐病砧木并种植无病毒苗木、引入弱毒系交叉保护技术、基因工程防治等方面内容,以期为促进梅州市柑橘产业健康发展提供参考。     

从感染叶片中提取柑橘衰退病毒总核酸3种方法的比较

用分光光度计检测微量抽提法、Trizol法和氯化锂法提取的CTV总核酸,再用RT-PCR和实时RT-PCR法检测,结果表明：3种抽提方法均可以获得CTV的总核酸,其中Trizol法获得的总核酸质量最好,平均浓度为329.3521（μg/mL）,A260/A280平均值为1.8052;进行RT-PCR反应后电泳条带亮度最强;实时RT-PCR显示其Ct值最小.氯化锂法与微量抽提法获得的总核酸质量差异不大,但是微量抽提法更为简便快捷.     

四川安岳柑橘衰退病病原鉴定及序列分析

[目的]探明引起四川安岳柑橘衰退病的病原。[方法]利用RT-PCR、克隆、测序等技术对四川安岳地区的柑橘类果树进行柑橘衰退病毒(CTV)检测,并对其外壳蛋白(CP)全序列进行了分析。[结果]81个疑似CTV侵染的样品中共有18个检测呈阳性,检出率为22.2%,表明安岳地区柑橘类果树衰退病由CTV引起。基于CP全序列同源性比较及进化分析表明,危害该地区柑橘类果树的CTV分属5个组群,亲缘关系较复杂。[结论]为安岳地区CTV的防控与防治提供了理论依据。     

果树病毒载体研究进展

植物病毒载体作为重要的研究工具被广泛运用于蛋白表达、基因沉默等研究,当前普遍使用的是以烟草花叶病毒载体等为代表的草本植物病毒载体,但其大多不能侵染果树,且稳定性较差,容易丢失插入的外源基因,因此该类载体无法满足果树等多年生植物研究的需要。近年来新兴的果树病毒载体可解决这些难题,为此作者对果树病毒载体的研究进展和发展方向进行综述。当前国内外取得的研究成果主要包括：（1）通过掌握柑橘衰退病毒、柑橘叶斑病毒、李痘病毒、苹果潜隐球形病毒、葡萄病毒A和葡萄卷叶伴随病毒等果树病毒的传播途径、寄主范围、致病力分化、基因功能和表达策略等特性,采用体外转录或农杆菌介导的方式获得了上述果树病毒的全长侵染性克隆。在此基础上,通过在病毒外壳蛋白基因与其邻近的上游基因之间插入外源基因（包括荧光蛋白基因和β-葡萄糖醛酸酶基因等报告基因）,并用该病毒外壳蛋白基因的启动子或其他异源启动子驱动外源基因表达的方式,将上述6种果树病毒的全长侵染性克隆改造成为病毒载体;（2）运用果树病毒载体明确了柑橘衰退病毒、柑橘叶斑病毒、李痘病毒、苹果潜隐球形病毒和葡萄卷叶伴随病毒在植株中的分布、移动规律,及其在细胞中的定位。探寻了柑橘衰退病毒在大翼来檬上产生茎陷点症状的原因,以及交叉保护防治柑橘衰退病的主要机理。果树病毒载体还被作为病毒诱导的基因沉默载体用于基因功能和防病研究;（3）通过选用本地已经存在,且无虫传能力的弱毒株,以及对控制病毒致病和媒介传播能力的基因进行敲除、突变可以解决果树病毒载体研发过程中所遇到的安全风险。由于有些果树病毒仅分布于植株的韧皮部,因此限制了其作为病毒载体在植株中表达外源基因的范围,但由这类果树病毒构建的病毒载体稳定性极高,并且通过添加分泌信号肽基因等方式可以扩大表达产物在植株中的分布和作用范围,因此其在果树病毒研究方面仍然具有很高的应用价值。此外,采用不同病毒来源的异源启动子代替同源重复区来驱动外源基因的表达,可以进一步提高果树病毒载体的稳定性。     

作物种传病毒研究进展

概述了种传病毒的危害,种子传毒机制与传毒率,种传病毒与传毒率的检测方法,病毒在作物种子中的分布与种传率的检测等。旨在对作物种传病毒引以重视,杜绝使用、传播携带病毒的种子,防治人为因素造成病毒的扩散。     

从感染叶片中提取柑橘衰退病毒总核酸3种方法的比较

用分光光度计检测微量抽提法、 Trizol法和氯化锂法提取的CTV总核酸, 再用RT-PCR和实时RT-PCR法检测, 结果表明: 3种抽提方法均可以获得CTV的总核酸, 其中Trizol法获得的总核酸质量最好, 平均浓度为329.352 1(μg/mL), A260/A280平均值为1.805 2; 进行RT-PCR反应后电泳条带亮度最强; 实时RT-PCR显示其Ct值最小. 氯化锂法与微量抽提法获得的总核酸质量差异不大, 但是微量抽提法更为简便快捷.