产丁二酮的嗜热链球菌的筛选和鉴定

从酸马奶中分离出五株链球菌，其中KM18的丁二酮的产量为20mg／mL。利用PCR扩增该菌的16SrRNA基因，将测序结果同该属内菌株的16SrRNA基因序列作多序列比较，并建立链球菌属的系统发育树。结果表明，KM18的16SrRNA基因序列同S．thermophilus的同源性百分比为98．2％。综合系统发育树的结果，将KM18鉴定为S．thermophilus。菌株KM18的16SrRNA基因序列已经在GENBANK申请国际序列注册号，为D0176426。     

高产苯乳酸菌株的筛选及发酵条件的优化

苯乳酸既可以延长饲料保质期又可以提高畜禽生产性能,但目前生物工业化生成苯乳酸的产量很低。为找到高产的菌株,本试验从泡菜中筛选出一株高产苯乳酸菌株,经16S rDNA测序确定该株为乳酸菌属植物乳杆菌。通过单因素试验与正交试验优化其发酵条件,由响应面试验确定外源添加物与温度之间的最佳方案,得到苯乳酸高产方案。结果表明：正交试验和响应面试验确定葡萄糖添加量为25 g/L、玉米浆添加量为5 g/L、接种量为100μL菌液、发酵时间为72 h、苯丙氨酸添加量为8 g/L、柠檬酸添加量为5 g/L、反应温度为33℃时苯乳酸的表达量达到374.26 mg/L,优于未优化前38.97 mg/L的产量。在优化后的植物乳杆菌可以高产苯乳酸,解决原始株表达量低的问题。     

乳酸菌产酸特性研究

对比研究了嗜热性乳酸菌、乳球菌的产酸特性以及影响后酸化的因素。结果显示,乳球菌最大产酸量为64.4^0T～72.7^0T;嗜热性乳酸菌的最大产酸量为106.8^0T～294.2^0T。德氏乳杆菌保加利亚亚种、唾液链球菌嗜热亚种的最大产酸速率为20.75^0T/h、24.57^0T/h。乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳油亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种的最大产酸速率分别为7.65^0T/h、6.52^0T/h、9.65^0T/h。优良的菌株特性、低温贮存、较低的最终发酵酸度是保证乳酸菌低后酸化的有效措施。     

一株保加利亚乳杆菌N~+诱变前后特性比较研究

以一株N+诱变保加利亚乳杆菌为研究对象,比较研究诱变前后菌种的形态、活力、产酸性、产黏性等特性变化,探讨N+诱变处理保加利亚乳杆菌在工业生产中应用的可行性。结果表明,在发酵培养基(11%脱脂乳)培养条件下,出发菌株L0603菌株活力为0.39,N+诱变菌株P0603活力为0.29,诱变后菌株活力降低了35%;P0603凝乳性能良好,但产酸性比L0603差,诱变后产酸性降低;P0603黏度最高值为360mPa.s,L0603的黏度最高值为151.5mPa.s,诱变后菌株黏度提高了60.6%;L0603的胞外多糖最高产量为17.56mg/L,P0603的最高产量为44.6mg/L,诱变后菌株胞外多糖产量提高了57.9%。     

谷草青贮用耐低温产乳酸芽孢杆菌的筛选、鉴定及性质研究

本试验旨在筛选一株谷草青贮用耐低温产乳酸芽孢杆菌,首先通过溴甲酚紫平板扩散法和气相色谱法分离得到1株乳酸产量较高的菌株。再通过形态学观察、16S rDNA序列发育树分析和生理生化试验对目的菌株进行种属鉴定。最后对目的菌株进行性质研究,包括pH耐受性、温度耐受性、抑霉菌试验、产酸时间。结果表明:筛选获得了1株产乳酸含量较高的菌株F-1,该菌株在10℃、180 r/min培养48 h后乳酸产量为1328.9 mg/L,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。性质研究发现,菌株F-1耐酸,在pH为3.0的条件下可以生长;该菌耐低温,在10℃时生长良好;对禾谷镰刀菌有明显的抑制作用;摇床培养12 h菌株开始产酸,并且随着发酵时间的延长产酸量越来越大。     

玉米干秸秆发酵生产优质粗饲料的优势菌株筛选

在玉米干秸秆中分别接种酵母菌、乳酸菌和纤维素分解菌，以筛选出适合玉米干秸秆发酵生产优质粗饲料的理想菌株。结果表明，对秸秆粉处理30d后，乳酸菌组发酵产物的酸碱度和氮损失均最低，即PH4．12，氨态氮和总氮比为6．4％；玉米秸秆粉发酵后感官评价得分最高的是乳酸菌组；酵母菌组，乳酸菌组，纤维素分解菌组的乙酸含量分别为33．35mg／mL、15．57mg／mL和6．32mg／mL，组间差异显著（P〈0．05）；乳酸含量分别为15．25mg／mL、30．89mg／mL和1．37mg／mL，组间差异显著（P〈0．05）；丁酸含量分别为5．35mg／mL，3．11mg／mL和20．53mg／mL，组间差异显著（P〈0．05）。试验结果提示，在本试验条件下，乳酸菌是玉米干秸秆发酵的最佳菌株。     

地塞米松、油酸、乳酸对体外培养脂肪细胞HSL活性的影响

为了研究地塞米松、油酸、乳酸对体外培养的脂肪细胞激素敏感脂肪酶（HSL）活性的影响,以体外培养生长良好脂肪细胞为实验模型,培养介质中分别添加0、10、20、40、80、160mg／I。的地塞米松,0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5mmol／L的油酸,0、10、20、30、40、50mg／L的乳酸,培养24h后提取总蛋白,每个处理3个重复,分别采用脂肪酶测定试剂盒检测HSL活性。结果表明,添加乳酸、油酸可抑制HSL的活性,随添加浓度增加,其抑制作用增强;地塞米松对HSL活性有促进作用,且存在剂量依赖性。     

产类胡萝卜素酵母的筛选及全基因组分析

锁掷酵母是一类可以产生多种类胡萝卜素、安全性较高的微生物，近年来得到广泛关注。试验对筛选得到的产类胡萝卜素酵母进行产量及生物学特性测定，通过全基因组分析对Sporidiobolus pararoseus TR71菌株安全性进行评估并探究其潜在的益生特性，并采用DMSO法测定类胡萝卜素产量。通过Illumina NovaSeq平台进行全基因组测序。结果表明：所筛选酵母类胡萝卜素平均产量为1.65 mg/L，最高产量为4.27 mg/L。菌株S. pararoseus TR71具有蛋白酶及脲酶活性，基因组序列全长为13 698 066 bp,CG含量为47.36%，有多个基因基因被KEGG、eggNOG等多个数据库注释。试验分离得到的S. pararoseus TR71菌株有相对较高的安全性，有希望成为饲喂益生菌制剂的后备菌株。     

正交设计在多年生黑麦草组织培养中的应用

以多年生黑麦草的成熟种子为外植体，应用正交设计方法，对愈伤组织的诱导和分化培养基进行了优化筛选。结果表明，愈伤组织诱导的最佳因素组合：2．4-D(7mg／L) 6-BA(0．1mg／L) NAA(0．3mg／L) CH(0．1g／L)(特拉华)；2，4-D(7mg／L) 6-BA(0)(尤文图斯、托亚)。特拉华愈伤组织分化的最佳因素组合：6-BA(0．1mg／L) NAA(0．8mg／L) ZT(0．1mg／L) Cu^2 (8，96mR,／L)；6-BA为0．2mg／L时．托亚的愈伤组织分化率最高。比较三个品种的出愈率和分化率：特拉华最高，托亚次之，尤文图斯最低。     

1株产绿原酸菌株的诱变选育及发酵条件优化

试验旨在利用随机诱变技术选育出高产绿原酸(CGA)菌株,并通过优化发酵条件进一步提高CGA的产量。以烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)N22为试验菌株,利用常压室温等离子体(ARTP)和紫外复合诱变获得高产CGA的菌株,通过单因素与响应面结合的方法对发酵条件进行优化。结果显示,经ARTP和紫外复合诱变处理获得了一株遗传稳定、CGA产量高的菌株AU-34,产量为4.7 mg/L,为野生型菌株的2.8倍。最优培养基成分为玉米浆124 g/L、果糖31.06 g/L、MnSO₄ 0.1 g/L、L-Tyr 1 g/L、VB₁ 3 mg/L、CaCO₃ 3 g/L、Tween-800.05%,此条件下CGA产量达102.55 mg/L,约为未优化前的22倍。研究表明,试验结果为工业化发酵生产CGA提供了潜在的菌种资源。     

两段牛乳铁蛋白肽基因在乳酸乳球菌中的共表达

根据乳酸乳球菌密码子的偏嗜性,优化设计并合成牛乳铁蛋白肽的两段基因序列LFcinB和LFampin,将其与乳酸乳球菌表达载体pAMJ399分别用SalⅠ和BglⅡ双酶切后进行连接,并电转化至乳酸乳球菌MG1363中,经酶切鉴定表明获得带有两段牛乳铁蛋白肽基因的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFcinBA/MG1363。结果表明,优化表达条件,在GM17培养基中添加3.8%的β-甘油磷酸二钠可以获得表达重组蛋白的适宜pH,West-ern-blot检测可见重组蛋白大小约13 ku,表明牛乳铁蛋白肽在重组乳酸乳球菌中获得了表达。     

传统乳制品中-产细菌素乳酸乳球菌的筛选

采用平板挖井扩散法对从内蒙古传统乳制品中分离鉴定的34株乳酸菌的细菌素产生特性进行研究。在排除有机酸和过氧化氢的干扰后发现，一株乳酸乳球菌CB20—2的发酵上清液对革兰氏阳性60乳酸菌和非乳酸菌显示出抑菌活性，但对革兰氏阴性菌无抑菌作用。其蛋白特性及广谱抑菌性表明乳酸乳球菌CB20—2产生的抗菌物质是一种细菌素。     

猪脂联素球状结构域gAd基因在乳酸乳球菌中的表达

本研究旨在克隆猪脂联素球状结构域gAd基因,构建重组质粒并将其转化至乳酸乳球菌NZ9000中进行表达,并在体外对重组猪脂联素球状结构域进行生物学活性分析。提取猪脂肪组织总RNA,扩增得到脂联素基因全长并测序,设计引物引入酶切位点和His-tag,把gAd亚克隆到表达载体pNZ8048,将重组质粒转化乳酸乳球菌NZ9000中诱导表达。通过Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白纯化后再Western blotting检测。然后,将gAd蛋白注射到高糖饲喂的小鼠体内鉴定生物学活性。结果表明成功获得了gAd基因并在乳酸乳球菌NZ9000中表达,表达产物相对分子质量约17ku。经纯化后用Western blotting检验具有反应原性,动物试验证明制备的gAd蛋白能显著降低小鼠的血糖水平。本研究为利用外源重组脂联素球状结构域调节猪的脂肪代谢打下了良好的基础。     

低温发酵乳品质特性研究

以青藏高原传统发酵牦牛乳中分离的保加利亚乳杆菌（编号为CGMCC2603）和酸乳球菌（编号为CGMCC1.3920）为研究对象，研究菌株低温发酵酸乳的感官特性、后酸化能力、粘度及双乙酰含量变化。结果表明试验菌株在25℃发酵的酸乳凝乳状态较好，冷藏14d后酸度分别提高29．2°T和8．5°T，后酸化较弱。冷藏期间粘度变化与发酵温度没有直接关系。低温有利于双乙酰的积累，双乙酰含量最高分别为12．04ug／mL和9．78ug／mL。本研究时开发低温发酵剂具有重要意义。     

重组牛α干扰素的分泌表达及抗病毒活性分析

本研究旨在利用乳酸乳球菌构建牛α干扰素（BoIFN-α）的分泌表达系统并分析其抗病毒活性。根据乳酸乳球菌MG1363密码子使用的偏好性，对BoIFN-α基因进行优化合成。将目的基因和乳酸乳球菌表达载体质粒pAMJ399分别进行SalⅠ和BglⅡ双酶切，将胶回收产物进行连接后，转化大肠杆菌TG1感受态细胞，提取阳性质粒电转化乳酸乳球菌感受态细胞，用SDS-PAGE和Western blotting方法对表达蛋白进行分析和鉴定，同时将重组乳酸乳球菌培养28 h后取上清用PEG20000浓缩10倍左右，进行体外抗病毒试验。结果显示，试验成功构建了重组乳酸乳球菌pAMJ399-BoIFN-α/MG1363，重组菌上清和沉淀均出现约20 ku的目的条带，表明重组蛋白以分泌的形式同时存在于培养液的上清和沉淀中。浓缩后的重组BoIFN-α（rBoIFN-α）上清与水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）同时作用，用MDBK/VSV系统以微量细胞病变抑制法测定rBoIFN-α的效价为1.02×10⁶ U/L；通过Alamer Blue法分析可知，加入rBoIFN-α后对细胞的活性影响较小；间接免疫荧光试验可见加入rBoIFN-α后细胞无绿色荧光，说明rBoIFN-α有良好的抗病毒效果；实时荧光定量PCR结果进一步证实rBoIFN-α具有一定的抗病毒效果。本试验构建了能分泌表达rBoIFN-α的乳酸乳球菌，通过一系列的体外抗病毒试验证明rBoIFN-α具有良好的抗病毒活性，试验结果为rBoIFN-α作为抗病毒药物、免疫增强剂的开发、肽类用药及临床应用提供新途径。     

“胃宝”复合菌生物学特性的研究

对“胃宝”发酵液的微生物分析结果表明,“胃宝”发酵液中的微生物主要有酵母菌、乳酸菌、醋酸菌。以醋酸菌为主体,酵母菌和乳酸菌为辅形成了“胃宝”共生复合体。     

乳酸乳球菌乳脂亚种IMAU60064增殖培养基的优化

以分离自西藏那曲县罗玛镇传统发酵酸牦牛奶中的乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactis subsp．Cremoris）IMAU60064为试验菌株,研究其最佳的培养条件。对碳源、氮源、缓冲盐等培养基成分及培养条件进行优化,并采用响应面法对优选的碳源、氮源和缓冲盐类的组成含量进行优化,得到IMAU60064的增殖培养基为：葡萄糖23g／L、大豆蛋白胨11g／L、牛肉膏11g／L、胰蛋白胨5g／L、NaAC1．8g／L、K2HP041．2g／L、柠檬酸钠1．2g／L、MgSO4·7H200．4g／L、MnSO4·5H2O54mg／L、L-半胱氨酸盐酸盐0．5g/L、吐温80为1g／L。Lactococcus lactis subsp．cremorisIMAU60064在此增殖培养基中经30℃,14h培养活菌数可达到3．26×10^8cFu／mL,比在MRS中（6．54×10^7CFU／mL）提高近5倍。     

柔嫩艾美耳球虫TA4抗原基因cDNA在乳酸乳球菌中的克隆与表达

用PCR技术特异扩增了柔嫩史美耳球虫TA4抗原基因cDNA序列，克隆至质粒pMD18-T中，获得重组质粒pMD18-T-TA4，采用KpnⅠ／SacⅠ双酶切法及PCR确认正确后，将TA4基NcDNA目的片段亚克隆到乳酸乳球菌表达载体pMG36n中，电穿孔法转化乳酸乳球菌LM0230，获得重组质粒pMG36n-TA4，采用KpnⅠ／SacⅠ双酶切法及DNA测序证明cDNA序列完全正确。获得TA4乳酸乳球菌表达株，经SDS—PAGE电泳分析，结果表明表达产物与预期大小的TA4蛋白分子量一致。     

口服疫苗抗原递送载体Lactococcus lactis NZ9000研究进展

综述了基因工程菌Lactococcus lactis NZ9000在基因组学、安全性、功能性、疫苗载体构建、菌株改造等方面的研究进展,对NZ9000作为口服疫苗载体的表达系统进行了评述,展望了其在生物制药、疫苗开发和食品工业等领域的应用前景,并对今后研究的发展方向做了分析。