农杆菌介导玉米转基因的影响因素研究

研究了农杆菌介导玉米转基因过程中涉及的外植体选择、高渗和农杆菌共培养、选择培养基筛选转化体等因素对愈伤组织生长及转化效率的影响。结果表明,同一基因型玉米自交系中有少数幼穗幼胚诱导出的愈伤组织生长速度快,转化效率高;高渗和农杆菌共培养以及除草剂筛选抑制愈伤组织的生长,致使部分转基因愈伤不能分化成苗,并提出其解决途径。     

甘蔗根癌农杆菌介导遗传转化研究

以根癌农杆菌（Agrobactrium tumefaciens)EHA105菌株介导将海藻糖合酶基因（TSase)遗传转化甘蔗（Saccharum officinarum)胚性愈伤组织，对转化材料进行连续的PPT抗性筛选。获得93株抗性植株。对部分植株的总DNA作PCR及Dot-Southern检测。结果3株呈阳性，而对照均为阴性，证明外源基因已整合到甘蔗基因组中。     

根癌农杆菌介导草莓遗传转化研究

利用带有内含子gus基因的瞬时表达,研究影响根癌农杆菌介导"鬼露甘"草莓遗传转化的若干因素。结果表明:草莓叶片外植体对卡那霉素较为敏感,适宜的筛选浓度为20mg/L,可明显抑制非转化组织的生长;300mg/L的羧吩青霉素可有效抑菌,对外植体生长影响也较小;预培养2-4d有利于转化;共培养2-3d有利于提高转化频率并避免了农杆菌的过度生长;OD600nm值为0.4的菌液侵染10min效果最佳。再生植株经PCR检测初步证明gus基因已成功整合到草莓基因组中。     

根癌农杆菌介导水稻基因转化研究进展

简要综述了根癌农杆菌介导水稻基因转化的优点及转化后代的遗传学行为 ,着重分析了影响农杆菌介导水稻基因转化的各种因素和存在问题     

根癌农杆菌介导的葡萄遗传转化体系的优化

以梅鹿辄葡萄离体叶片为转化材料,对根癌农杆菌介导的遗传转化过程中涉及的几个主要影响因素:抗菌素羧苄青霉素(Carb)的浓度、乙酰丁香酮(AS)的浓度、农杆菌菌液的浓度及卡那霉素筛选压进行优化。结果表明,抗菌素羧苄青霉素在浓度300mg·L-1下即可有效去除农杆菌,且对胚性愈伤组织的分化的影响不大;乙酰丁香酮(AS)的最适浓度为50μm·L-1;农杆菌菌液的浓度控制在OD6000.5~0.7时转化率最高;卡那霉素的筛选浓度控制在100mg·L-1。利用优化的农杆菌介导法进行转化,对再生苗进行PCR检测,结果显示,外源基因已导入了葡萄基因组中。本研究优化了农杆菌介导的葡萄遗传转化影响因素,并获得了转基因植株。     

影响根癌农杆菌介导的香蕉遗传转化因素研究

以香蕉（Musa spp.)的横切薄层切片（transverse thin cell layer,tTCL)外植体作为转化受体，通过对外植体GUS基因瞬时表达率的研究以及受体材料对抗生素的敏感性实验，找出了较适合的外植体转化条件和培养条件。研究表明：用低代香蕉无菌苗为材料，横切薄层切片芽再生率高，有较高的GUS基因瞬时表达率；香蕉对头孢霉素（Cefotaxime)和羧苄霉素（Carbenicillin)不敏感，而对潮霉素（Hygromycin)很敏感；菌液的预处理是影响香蕉转化的主要因子，重悬液中的蔗糖浓度也是影响转化的因素之一，对遗传转化有明显的促进作用。     

根癌农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化

报道了根癌农杆菌（Agrobacterium tumifaciens）介导的蓝猪耳（Torenia foumieri）遗传转化的方法。筛选蓝猪耳转化芽的最适卡那霉素（Kan）浓度为400mg／L；以稀释10倍的菌液浸染叶盘10～20min，固体共培养基（含20μmol／L乙酰丁香酮）上23℃共培养7～8d可获得转化芽诱导率27．2％；16h光照，8h黑暗是较理想的共培养光周期；茎段作为外植体，其转化芽诱导率要高于叶盘的转化芽诱导率，而且其转化芽比叶盘的转化芽健壮；1／2MS＋100mg／L Kan＋0．5mg／L IAA是比较理想的生根培养基。实验结果表明，根癌农杆菌介导的蓝猪耳转化获得了抗性再生植株，转化率为24．1％。     

根癌农杆菌介导的向日葵遗传转化体系的建立

采用携带gus和hpt基因双元表达载体pCAMBIA1301的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105对向日葵（Helianthus annuus）品种新葵杂6号的茎尖分生组织进行遗传转化,以共培养后7 d外植体的gus基因纯合表达频率为指标测定转化率.结果表明,潮霉素适宜的筛选浓度为10mg/L,根癌农杆菌侵染浓度OD600=0.8,果胶酶（0.05%）与纤维素酶（0.1%）共同消化外植体30 min,共培养温度24℃,共培养培养基中添加乙酰丁香酮（ACS）100μmol/L,向日葵茎尖gus基因纯合表达率高达32.8%.对抗性苗进行PCR和Southern blot检测,初步证明T-DNA上的hpt基因已整合向日葵的基因组中.     

农杆菌介导获得转基因抗虫匍匐翦股颖植株

利用转基因技术，将目的基因导入愈伤组织或原生质体，获得转基因植株提高抗逆性，已成为匍匐翦股颖遗传改良的重要手段(郭振飞和卢少云，2002)。本实验利用农杆菌介导法，将经过改良的抗虫Bt基因crylAb导入匍匐翦股颖，初步建立了匍匐翦股颖遗传转化体系。     

根癌家杆菌介导的玉米遗传转化体系的建立

用根癌农杆菌菌株LBA4404（pTOK233)转化多种基因型的玉米幼胚。幼胚与农杆菌共培养3d后，检测到了GUS基因的瞬时表达。利用GUS基因的瞬时表达对农杆菌转化玉米的条件进行了优化，共培养后的幼不经含潮霉素的培养基筛选培养两个月后，获得了多种基因型的抗性愈伤组织。其中综3自交系的抗性愈伤组织分化出植株，P9－10、综3自交系R0结实得到后代。Southern杂交分析证实了霉素基因在玉米自交系P9－10基因组中的整合，建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。     

黄淮麦区推广品种小偃22农杆菌遗传转化体系的建立

小偃22小麦是目前陕西省生产上的主栽品种,在黄淮麦区其他地区也大面积推广种植。本文通过对小偃22小麦胚性愈伤组织的来源﹑生理状态和干燥时间,根癌农杆菌的接种浓度和侵染方式,AS的添加浓度,胚性愈伤组织和根癌农杆菌的共培养温度和共培养时间,潮霉素的筛选浓度和筛选方式等参数进行比较研究,建立了小偃22小麦农杆菌遗传转化体系。结果显示,以来源于幼穗的胚性愈伤组织作为转化受体较为适宜,愈伤组织生理状态为从幼穗直接诱导30d后继代1次并培养15d的胚性愈伤组织,农杆菌侵染前对胚性愈伤组织干燥处理30 min较为适宜;农杆菌菌液浓度为0.8OD,采用抽真空侵染5min＋非真空侵染10min的浸染方式,共培养温度为22℃,共培养时间为72h,AS的适宜添加浓度为150μmol/L;筛选方式选用在抗性愈伤组织筛选阶段经75mg/L潮霉素筛选后,在分化阶段不再进行筛选或采用25mg/L低浓度潮霉素筛选。通过重复转化验证试验和分子生物学鉴定,表明该遗传转化体系具有可行性。     

农杆菌介导春小麦遗传转化体系的优化研究

采用携带GUS基因双元表达载体p1301-Pubi-Ecppc的根癌农杆菌菌株C58c1、LBA4404和EHA105对4个春小麦品种的幼胚愈伤组织进行了遗传转化。结果表明,3M1.5为最佳诱导培养基;扬麦158和扬麦10是用于小麦遗传转化的良好基因型。对农杆菌转化条件进行进一步优化,得出用农杆菌C58c1侵染预培养15d的扬麦158幼胚愈伤组织,当侵染液浓度为OD6000.8、侵染40min、共培养3d时,可以提高农杆菌介导小麦遗传转化的筛选频率和PCR阳性率。对所得到的具有hyg抗性的愈伤和抗性植株进行GUS基因化学组织检测和PCR分子鉴定,初步证明Ecppc基因已整合到小麦再生植株基因组中。本研究初步建立了农杆菌介导小麦的遗传转化体系。     

根癌农杆菌介导转褪黑素基因草莓的获得

为建立根癌农杆菌介导的草莓褪黑素基因高效遗传转化体系,以草莓品种“早红”叶片和叶柄为外植体,优化了影响根癌农杆菌遗传转化的因素,包括农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间和预培养时间等,建立了适宜草莓“早红”的农杆菌遗传转化体系。结果表明,“早红”草莓适宜的转化条件是：外植体的最适预培养时间为2～3 d,农杆菌侵染的最佳菌液浓度为OD600 0.3～0.5,最适侵染时间为15 min,最适共培养时间为3 d。在此基础上,通过根癌农杆菌介导法将褪黑素合成关键酶N -乙酰转移酶（AANAT）和羟吲哚-氧甲基转移酶（HIOMT）基因AANAT和HIOMT转入草莓基因组,并对获得的抗性植株进行PCR和PCR-Southern blot检测分析,结果表明外源基因已经整合进草莓基因组中。RT-PCR分析证明外源基因已经在转录水平表达。     

两种质粒中gus基因在植物细胞和根癌农杆菌中的表达特性研究

以含有基因转化操作过程中常用的两种质粒载体pBI121和pCAMBIA2301的根癌农杆菌EHA105为材料,分别转化甜瓜子叶,应用组织化学方法检测了甜瓜子叶和子叶培养后的愈伤组织及根癌农杆菌菌液的瞬时转化效果,研究了两种不同的质粒载体上所含的gus基因在根癌农杆菌中和植物细胞中的表达特性。结果表明,不同质粒载体上所含的gus基因的表达特性不同,质粒载体pBI121上所含的gus基因既能在植物细胞中能表达,也能在根癌农杆菌细胞中表达,而质粒载体pCAMBIA2301上所含的gus基因能在植物细胞中表达,但是不能在根癌农杆菌细胞中表达。     

一种发根农杆菌介导的花生遗传转化新方法

花生是中国重要的油料作物、经济作物和豆科作物。作为世界第一花生生产国和出口国,利用遗传转化方法,加快花生生物性状和遗传育种的研究势在必行。花生根系和根瘤系统的研究对于提高花生抗性进而提高花生的产量和品质以及生物固氮能力具有重要的意义。然而,目前花生遗传转化体系还不成熟,给花生研究造成了严重的障碍。本文建立了利用发根农杆菌介导花生下胚轴形成转基因毛根和根瘤的新方法,并分别用GFP和GUS两种检测方法对该转化体系进行了检测,表明该方法是一个操作简易、高效的遗传转化方法,为利用基因工程技术对花生进行研究和遗传改良提供了一套新方法。     

棉花农杆菌基因转化体系的优化和转苜蓿抗菌肽基因(alfAFP)植株的获得

为了优化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的棉花(Gossypium hirsutumL.)下胚轴切段的基因转化体系,以苜蓿(Medicago sativa L.)抗菌肽基因(alflafa antifungul peptide,alfAFP)为目标,利用γ-葡萄糖甘酸酶基因(gus)和潮霉素抗性基因(Hpt)的检测方法,分析了根癌农杆菌菌种、菌液浓度、浸染下胚轴的时间、共培养中乙酰丁香酮(AS)的浓度、共培养温度和时间等因子对基因转化的影响.优化分析表明,用农杆菌菌株LBA4404,当OD_(600)值为0.5～0.7的菌液浸染5～7日龄的棉花无菌苗下胚轴切段10～15 min.在含200 μmol/L AS的共培养基中21℃暗培养60h,可更有效地提高转化率.经上述条件处理的下胚轴在含50 mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上培养3周可产生转化率最高的愈伤组织.愈伤组织经分化培养获得15株再生棉花,经过PCR和PCR-Southern分析.发现其中12株含有外源基因alfAFP.