锦鲤疱疹病毒ORF27基因的原核表达及免疫原性研究

克隆锦鲤疱疹病毒(KHV)ORF27基因,构建重组质粒p ET32a-ORF27,并用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测获得含his标签大小为27.3ku的蛋白条带。蛋白纯化浓缩后免疫小鼠,不同时间采血收集血清用间接ELISA检测抗体水平。结果显示:注射表达蛋白的小鼠血液中可检测到KHV的特异性抗体,在21 d左右抗体水平达到最大值,而对照组小鼠没有检测到抗体。     

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF136基因的原核表达及免疫原性研究

为了研究能有效预防锦鲤疱疹病毒的疫苗,本文研究克隆了锦鲤疱疹病毒ORF136基因,并构建重组质粒PET32a-ORF136,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测获得含his标签大小为36.4kDa的蛋白条带。蛋白纯化后免疫鲤鱼,不同天数采血收集血清用间接ELASA检测抗体水平。结果显示：用10ug/尾、20ug/尾和40ug/尾的蛋白免疫后均可检测到KHV的抗体,用PET32a-ORF136表达的蛋白20ug/尾和40ug/尾的蛋白免疫后的抗体水平比10ug/尾剂量蛋白免疫后的抗体水平高但差异不显著（p＞0.05）。     

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF126基因的原核表达及免疫试验研究

为了研究能有效预防锦鲤疱疹病毒的疫苗,选取了锦鲤疱疹病毒膜糖蛋白基因ORF126并构建重组质粒p ET32aORF126,SDS-PAGE检测获得含his标签大小为49.9 k Da的蛋白条带。蛋白纯化后免疫鲤鱼,采集不同天数血清,用间接ELISA检测抗体水平。结果显示,用10μg/尾、20μg/尾和40μg/尾的蛋白免疫后均可检测到KHV的抗体,3者之间的抗体水平差异不显著(P>0.05)。     

锦鲤疱疹病毒双重PCR检测方法的研究

为了快速确诊锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,KHV),本试验建立了KHV双重PCR检测方法。根据锦鲤疱疹病毒的SphⅠ-5基因和胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(thymidine kinase,TK)基因设计特异性引物,优化反应条件,建立了KHV双重PCR检测方法。结果表明,建立的方法简单、灵敏、准确,一个反应体系可同时扩增292 bp和410 bp两个基因片段,可有效用于KHV的检测。     

利用壳聚糖-海藻酸盐胶囊运送表达KHV ORF81蛋白的益生菌疫苗：一种适于鲤鱼口服免疫抗KHV感染的疫苗策略

正锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV),又称鲤疱疹病毒3型,是鲤科新发病原。KHV基因组为线性双链DNA,大小为295 kb,编码156个开放阅读框。KHV对普通鲤鱼和锦鲤具有强致病性,引起锦鲤疱疹病(KHVD),该病自20世纪90年代末发现以来,随着国际鱼类贸易,目前已遍布全球,给普通鲤鱼和锦鲤养殖业造成了巨大的经济损失。     

锦鲤疱疹病毒的PCR鉴定

根据锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,KHV)的基因序列合成了2对引物,对送检的发病锦鲤样品提取DNA进行PCR检测,分别扩增出KHV的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因(thymidine kinase,TK)409 bp和AF411803基因序列484 bp的条带,对484 bp的PCR扩增产物经限制性内切酶TaqⅠ和AluⅠ酶切,分别得到200 bp/284 bp和185 bp/299 bp的片段,484 bp的PCR扩增产物的测序结果与GenBank上已发表的KHV序列一致。结果显示发病锦鲤为KHV阳性。     

锦鲤疱疹病毒双基因检测方法的研究

为建立锦鲤疱疹病毒(KHV)双基因检测方法,本研究根据KHV聚合酶基因(Sph)和胸苷激酶基因(TK)的保守序列设计2对引物,建立两基因同时检测的PCR方法.结果表明,利用双基因同时检测KHV,可以同时特异扩增出570 bp和155 bp片段,而与鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和鲤鱼疱疹病毒无扩增反应.而且所建立的双基因检测方法对临床样品的检测结果与单一PCR方法比较符合率为100％.为进一步研究KHV以及诊断方法奠定了基础.     

锦鲤疱疹病毒减毒株的筛选及免疫原性研究

为了致弱锦鲤疱疹病毒得到减毒株,试验采用细叶桉叶的提取液与病毒在细胞中共培养来致弱病毒,并以中和抗体试验检验弱毒株的免疫原性。结果表明:利用获得的减毒株在加强免疫42天时,抗锦鲤疱疹病毒中和抗体效价达到最高水平,同时灭活病毒免疫组的抗锦鲤疱疹病毒中和抗体水平低于KHV-P_(52)免疫组,PBS对照组未检测出抗锦鲤疱疹病毒的中和抗体,两个免疫组与对照组比较差异显著(P0.05);KHV-P52免疫组对鲤鱼的免疫保护效果好,免疫保护率为100%。说明细叶桉叶提取液能有效致弱锦鲤疱疹病毒,通过试验获得了一株锦鲤疱疹病毒弱毒株。     

养殖锦鲤鲤鱼浮肿病的检测与鉴定

北京房山某锦鲤养殖场锦鲤发生大量死亡,患病锦鲤呈烂鳃、肾脏糜烂、身体浮肿;症状类似锦鲤疱疹病毒（koi herpes virus,KHV）感染,但经PCR检测排除了KHV感染。为进一步确定病原,对发病鱼进行了临床症状观察、病毒分离、细菌分离培养、病鱼组织超薄切片电镜观察和PCR扩增等检测。通过病鱼组织超薄切片电镜观察,在肾脏内可见200 nm×400 nm的痘病毒样颗粒。抽提病毒核酸后,用已知的鲤鱼浮肿病毒（carp edema virus,CEV）的保守序列设计2对引物进行PCR扩增,扩增出548和180 bp片段,测序结果和GenBank公布的CEV H504株序列完全一致。根据发病鱼临床症状和实验室检测结果,最终确定该病为CEV引起的鲤鱼浮肿病。这是在中国首次发现的鲤鱼浮肿病。     

天津市锦鲤疱疹病毒PCR检测与序列分析

2017年6月,天津市滨海新区、北辰区等地一些养殖场的锦鲤出现急性死亡,发病3 d后死亡率高达85%以上。病鱼呈现眼部凹陷、烂鳃、内脏出血等临床症状,初步诊断为锦鲤疱疹病毒病。针对锦鲤疱疹病毒(KHV/CyHV)的TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因设计特异性引物,建立PCR方法进行KHV基因检测。结果显示:死亡疑似病例的KHV检测阳性;测序获得的TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因片段长度分别为409、300、317、939和156bp,与CyHV-3-J2病毒株基因序列同源性为97.6%～100%。系统发育树分析显示,其与CyHV-3亲缘关系最近,自然聚为一支,最终确定为CyHV-3型。以上研究为锦鲤疱疹病毒病的分子诊断及流行病学调查奠定了基础。     

锦鲤疱疹病毒病的诊断病例

锦鲤疱疹病毒病(koi herpesvirus disease,KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,KHV)感染锦鲤、鲤及其普通变种如框镜鲤等而导致的一种具有高度传染性和致死性的疾病。该病多发生在水温为18℃～28℃的春秋季节,具有高度传     

锦鲤爆发性出血病病原电镜观察和PCR检测研究

2002年春季以来,广东省数家锦鲤养殖场爆发了烈性锦鲤疫病,其临床症状和流行病学特征与在英国、以色列、美国等国家报道过的锦鲤疱疹病毒病(KHVD)极相似,各种抗生素治疗均无效,临床初步诊断为由锦鲤疱疹病毒(Kio Herpesvirus,KHV)引起的锦鲤爆发性出血病.     

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF124基因的克隆及生物信息学分析

为研究我国锦鲤疱疹病毒的基因背景信息,从锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ株)获得ORF124基因,应用生物信息学方法分析KHV-CJ株ORF124基因结构和功能,并与Genbank上已公布的三株KHV进行比较分析.结果显示,ORF124基因的理论分子质量为31221.96 Da,KHV-CJ株与其他三株KHV同源性均为99％;信号肽切割部位最可能位于24位的T(苏氨酸)和25位的V(缬氨酸)氨基酸之间;ORF124基因无跨膜区;氨基酸序列不存在潜在的N-糖基化位点、11个潜在的O-糖基化位点和7个磷酸化位点.该蛋白的表面抗原决定簇位点区域广泛、峰值高,预示该基因可作为基因工程疫苗的重要候选基因.     

锦鲤疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据锦鲤疱疹病毒(KHV)胸苷激酶(TK)基因的保守序列设计一对引物和相应的TaqMan探针,建立荧光定量PCR方法,用于锦鲤疱疹病毒快速、灵敏、可定量的检测手段。构建并制备实时荧光定量PCR的标准品,对反应体系进行优化,并做特异性,敏感性和重复性试验。结果表明,成功构建荧光定量PCR标准品,建立荧光定量标准曲线,标准曲线的相关系数为0.992,所建立的荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高,重复性好。     

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF25基因的克隆及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF25蛋白的结构特征和进化关系,采用框镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF25基因,将其克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF25基因的结构和功能,并与GenBank上已公布的三株KHV构建系统进化树。结果显示,获得了长1824 bp的ORF25基因,编码608个氨基酸;预测ORF25基因编码蛋白的理论分子质量为66825.44 Da,等电点为7.947;抗原表位预测显示抗原性良好;编码蛋白存在6个N-糖基化位点、25个O-糖基化位点和28个磷酸化位点;系统进化树分析显示,与锦鲤疱疹病毒美国株属同一分支。     

口蹄疫疫苗非抗原蛋白对146S抗原免疫效果的影响

为探究非抗原蛋白对口蹄疫病毒A型(FMDV-A) 146S抗原免疫效果的影响,本研究以小鼠和猪为试验动物,分别制备5组小鼠注射用样品:A组(3μg 146S抗原)、B组(3μg 146S抗原+25μg非抗原蛋白)、C组(3μg 146S抗原+50μg非抗原蛋白)、D组(3μg 146S抗原+100μg非抗原蛋白)及E组(空白对照,PBS);同时制备4组猪注射用样品:A组(18μg 146S抗原)、B组(18μg 146S抗原+400μg非抗原蛋白)、C(18μg 146S抗原+4 000μg非抗原蛋白)及D组(空白对照,PBS)。免疫接种试验动物后,通过淋巴细胞增殖试验及实时荧光定量PCR评价比较不同疫苗样品组小鼠产生的细胞免疫应答水平,同时通过液相阻断ELISA方法检测、评价各试验组动物(小鼠和猪)产生的体液免疫应答水平。小鼠试验结果显示,在免疫后3个检测时间点内,4个试验组中C组的平均抗体水平最高,平均抗体效价分别为4.13、5.83和5.50,而D组的抗体水平最低,平均抗体效价分别为3.46、5.16和4.46;C组细胞增殖能力及Th-1型细胞因子IL-6、IFN-β和TNF-αmRNA表达量均高于其他组。猪试验结果显示,A组和B组间平均抗体水平差异不显著(P>0.05),但A组和B组的平均抗体效价均极显著高于C组(P<0.01)。综合上述结果表明,一定范围内少量非抗原蛋白对FMDV-A 146S抗原的免疫效果没有影响,而高浓度的非抗原蛋白则抑制FMDV-A 146S抗原的免疫效果。     

口蹄疫疫苗非抗原蛋白对146S抗原免疫效果的影响

为探究非抗原蛋白对口蹄疫病毒A型(FMDV-A) 146S抗原免疫效果的影响,本研究以小鼠和猪为试验动物,分别制备5组小鼠注射用样品:A组(3μg 146S抗原)、B组(3μg 146S抗原+25μg非抗原蛋白)、C组(3μg 146S抗原+50μg非抗原蛋白)、D组(3μg 146S抗原+100μg非抗原蛋白)及E组(空白对照,PBS);同时制备4组猪注射用样品:A组(18μg 146S抗原)、B组(18μg 146S抗原+400μg非抗原蛋白)、C(18μg 146S抗原+4 000μg非抗原蛋白)及D组(空白对照,PBS)。免疫接种试验动物后,通过淋巴细胞增殖试验及实时荧光定量PCR评价比较不同疫苗样品组小鼠产生的细胞免疫应答水平,同时通过液相阻断ELISA方法检测、评价各试验组动物(小鼠和猪)产生的体液免疫应答水平。小鼠试验结果显示,在免疫后3个检测时间点内,4个试验组中C组的平均抗体水平最高,平均抗体效价分别为4.13、5.83和5.50,而D组的抗体水平最低,平均抗体效价分别为3.46、5.16和4.46;C组细胞增殖能力及Th-1型细胞因子IL-6、IFN-β和TNF-αmRNA表达量均高于其他组。猪试验结果显示,A组和B组间平均抗体水平差异不显著(P0.05),但A组和B组的平均抗体效价均极显著高于C组(P0.01)。综合上述结果表明,一定范围内少量非抗原蛋白对FMDV-A 146S抗原的免疫效果没有影响,而高浓度的非抗原蛋白则抑制FMDV-A 146S抗原的免疫效果。     

感染锦鲤疱疹病毒的鲤鱼免疫相关分析

锦鲤疱疹病毒能在宿主体内持续性潜伏感染,被感染的鲤鱼会产生相应的免疫应答来抵抗病毒侵袭。笔者概述了被感染鲤鱼的抗锦鲤疱疹病毒的免疫应答及参与免疫的细胞因子表达水平及相互作用,从免疫学角度论述了锦鲤疱疹病毒与被感染鲤鱼间的相互作用关系。     

大肠杆菌O157∶H7 Ivy蛋白表位多肽及免疫原性分析

为评价合成的O157∶H7Ivy146—157多肽作为疫苗抗原的可行性,本试验利用生物信息学方法分析Ivy的二级结构、氨基酸亲水性、蛋白柔性区域、表面可及性和抗原指数,筛选获得1条含有B细胞抗原表位的多肽序列Ivy146—157,进行化学合成。多肽免疫BALB/c小鼠,测定免疫后小鼠的抗体水平及Ivy146—157多肽对小鼠脾淋巴细胞的刺激增殖情况。结果显示,合成的Ivy146—157多肽第3次免疫小鼠后抗体水平达到1∶6 400,制备的Ivy146—157多克隆抗体能够识别天然菌株中的目的蛋白;MTT试验结果显示,Ivy146—157免疫后小鼠脾淋巴细胞增殖明显,与对照组差异显著(P0.05)。结果表明,Ivy146—157多肽能够诱导机体产生体液免疫和细胞免疫反应,为其作为疫苗用抗原的进一步研究奠定了理论基础。     

利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因

为建立锦鲤疱疹病毒(KHV)多靶基因PCR检测方法,本实验将KHV接种鲤鱼鳍条细胞,收获病变细胞悬液,提取DNA,根据GenBank中登录的KHV基因序列及出入境检验检疫行业标准推荐的基因(ORF7),设计合成3对特异性引物,针对胸苷激酶基因(TK)、聚合酶基因(Sph)和ORF7基因进行PCR检测.通过优化后的反应体系进行特异性、敏感性试验和样品检测.结果表明:3对引物能够分别特异性扩增出409bp、292 bp和484bp片段;敏感性试验表明对TK基因检测的敏感性高于Sph和ORF7基因,其最低检测量为1.9×106copies/μL;采用优化的3个PCR方法对8个有临床症状的样品进行检测,其中3份样品的3个基因PCR扩增结果均为阳性.因此,本研究选取的3个基因均可用于KHV的检测及确证实验.