氨氮胁迫下中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)谷氨酸脱氢酶基因的表达分析

采用 RACE 技术克隆获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)谷氨酸脱氢酶 GDH 基因(FcGDH)。FcGDH 基因全长1779 bp,包括1个1659 bp 的开放阅读框(ORF),编码552个氨基酸,预测分子量大小为61.3 kDa,理论等电点为6.54。同源性分析显示,FcGDH 氨基酸序列与其他动物高度保守,其中,与凡纳滨对虾最为相似,高达98%,其次为中华绒螯蟹,为89%。系统进化树分析显示,FcGDH 氨基酸序列与凡纳滨对虾 GDH 聚为一支,之后依次为：中华绒螯蟹、黑腹果蝇、埃及按蚊。组织表达分析发现,FcGDH 基因在肌肉、鳃、肝胰腺、胃、肠、淋巴和血淋巴中均有表达,其中,肌肉中表达量最高。氨氮胁迫后,FcGDH 基因在肌肉和肝胰腺组织中变化显著,在胁迫后期,FcGDH 基因表达量均上调,且与对照组相比差异显著(P<0.05),说明 FcGDH 基因在氨氮解毒代谢过程中发挥了重要作用。     

三疣梭子蟹钙调蛋白基因的克隆及在蜕皮中的功能分析

基于转录组数据库信息,采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)钙调蛋白基因(PTCaM)。该基因cDNA全长1981 bp,包含450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,预测分子量16.8 k D,理论等电点为4.09。对序列进行生物信息学分析发现,PTCaM是一个高度保守的序列,具有EF家族典型的EF-hand钙离子结合域。同源性分析结果表明,PTCaM基因编码的氨基酸与果蝇和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的Ca M氨基酸序列覆盖率高达100%,与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)和仿刺参(Apostichopus japonicus)覆盖率高达99%。系统进化表明,PTCaM基因氨基酸序列与凡纳滨对虾、中华绒螯蟹和克氏原螯虾聚为一支。通过分析不同蜕皮时期各个组织中PTCaM的表达情况得知,该基因在蜕皮时期的各个组织中均出现差异性表达,并且差异显著,说明该基因参与蜕皮调控过程。     

中华绒螯蟹Akt基因的cDNA克隆、序列分析及表达特征

为研究Akt基因在中华绒螯蟹蜕壳前后肌肉生长过程中的功能,应用RACE技术克隆得到编码中华绒螯蟹Akt(命名为Es Akt)的全长为2 200 bp的c DNA序列,包括159 bp的5′非翻译区(5′-UTR)、496 bp的3′非翻译区(3′-UTR)和长度为1545 bp编码514个氨基酸的编码序列。蛋白质结构域分析显示Es Akt含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的3个特征性保守结构域。多序列比对和系统发育分析显示,Es Akt与中国明对虾、凡纳滨对虾的Akt序列一致性都为0.889,在系统发育树中节肢动物Akt形成一个分支。应用荧光定量RTPCR技术分析Es Akt在性成熟中华绒螯蟹各组织及幼体不同蜕壳时期不同部位肌肉组织中转录水平上表达量的变化。结果显示,Es Akt在性成熟个体的肝胰腺、眼柄、表皮、卵巢、精巢、心脏、螯足、鳃、三角膜等组织中均有表达,其中卵巢、眼柄和精巢中表达量较高,肝胰腺中表达量最低。在幼体不同蜕壳时期不同部位的肌肉中,Es Akt表达量变化不同,步行足肌肉组织中Es Akt m RNA无显著的统计学差异。腹部肌肉组织中Es Akt m RNA水平在蜕壳前晚期D3~D4期表达量显著高于蜕壳后A~B期和蜕皮间期C期。螯足肌肉在蜕壳前晚期D3~D4期急剧下调,蜕壳后A~B期开始表达量显著升高,直至蜕皮间期C期。研究表明,Es Akt在中华绒螯蟹蜕壳过程中不同部位肌肉组织中的表达量变化与蜕壳周期密切相关,说明Es Akt参与中华绒螯蟹蜕壳诱导的肌肉萎缩、生长及重建过程。     

脊尾白虾热休克蛋白HSP70基因的克隆及其表达分析

克隆了脊尾白虾热休克蛋白基因全长cDNA,并进行了序列分析。该基因由2 250 bp的碱基组成,开放阅读框长1 959 bp,编码由652个氨基酸组成的蛋白,基因两翼分别存在83 bp(5′端)和208 bp(3′端)的非翻译区,将该基因命名为Ec-HSP70。与其它物种HSP70s氨基酸序列进行同源性比较发现,与甲壳动物的同源性都在90%以上,表明该蛋白属于热休克蛋白HSP70家族。聚类分析表明,脊尾白虾热休克蛋白氨基酸序列与中国明对虾和凡纳滨对虾紧密聚为一支,之后聚类顺序依次为斑节对虾、日本囊对虾、刀额新对虾等。通过荧光定量RT-PCR对该基因在肝胰腺、肌肉的表达分析表明,温度、pH和氨氮胁迫都可以引起该基因的高表达,而且肝胰腺中的高表达时间相对肌肉中出现的较早。试验结果表明,温度、pH和氨氮胁迫对脊尾白虾HSP70基因表达有一定的诱导效果,但胁迫的时间过长则抑制其表达,肝胰腺对胁迫比肌肉较敏感。     

中华绒螯蟹延伸因子EF-1δ基因全长cDNA克隆及表达

根据非洲爪蟾延伸因子-1δ(elongation factor-1δ,EF-1δ)基因的保守序列设计引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆出中华绒螯蟹EF-1δ基因并进行各组织间的表达分析.序列分析表明,中华绒螯蟹EF- 1δ cDNA全长933 bp,编码263个氨基酸,经BLASTN和BLASTX软件分析表明,此EF-1δ cDNA核苷酸序列与非洲爪蟾EF-1δ核苷酸序列的同源性最高,其相似性为70％;所编码的氨基酸序列与大红斑蝶EF-1δ的氨基酸序列相似性为54％.聚类分析表明,中华绒螯蟹EF-1δ的氨基酸序列与鱼虱EF-1δ聚为一支.荧光定量PCR结果显示,EF-1δ在正常成熟中华绒螯蟹肌肉中表达量最高,精巢、肝胰腺中有少量表达,心脏、卵巢、胃、肠、鳃中有微量表达.不同发育状态的中华绒螯蟹EF-1δ在肌肉组织中表达量均显著高于肝胰腺和鳃组织中表达量(P＜0.05);3个不同发育状态蟹EF-1δ在肌肉中的表达量也呈显著性差异(P＜0.05),在早熟蟹肌肉中表达量最高,正常成熟蟹肌肉中次之,幼蟹肌肉中最低;不同发育状态蟹EF-1δ在肝胰腺和鳃组织中的表达没有显著差异(P＞0.05).     

凡纳滨对虾6-磷酸海藻糖合成酶在抗高温胁迫中的表达特征

6-磷酸海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase, TPS)是海藻糖合成的关键酶,在生物体逆境胁迫应答中发挥着重要的作用。本研究以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)高温胁迫转录组测序的Unigene序列为基础,采用直接PCR扩增的方法,获得了TPS部分cDNA (完整的ORF和部分UTR)序列(LvTPS)。序列分析结果显示,LvTPS序列包含1个2529 bp的开放阅读框,可编码842个氨基酸,分子量为95.4 kDa,等电点为6.17。LvTPS具有Glyco-transf-20和Trehalose PPase 2个功能结构域。多序列比对结果显示,LvTPS与中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)的相似性最高,为63.73%;系统进化树显示,凡纳滨对虾与中国对虾亲缘关系最近,并与蓝蟹(Callinectes sapidus)、脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)等无脊椎动物聚为一支,脊椎动物单独聚为一支。基因表达水平的定量分析结果显示,LvTPS在鳃、肝胰腺、眼柄、心脏、神经和肌肉6种组织中均表达。鳃和肌肉表达量基本相同,为最高;眼柄、心脏和神经表达量次之,显著低于鳃和肌肉中的表达量(P<0.05);肝胰腺中表达量为最低,显著低于其他5种组织中的表达量(P<0.05)。与26℃温度下的凡纳滨对虾相比,水温升至32℃时,眼柄和心脏中的LvTPS显著上调表达(P<0.05);水温升至38℃时,鳃、肝胰腺、眼柄和心脏中LvTPS显著上调表达(P<0.05)。其中,在肝胰腺中表达量变化较显著。之后,随着温度的下降,其表达量总体呈下调趋势。回温至32℃和26℃时,6种组织中LvTPS基因表达量与对照组均无显著性差异。在神经和肌肉中,不同温度胁迫下的LvTPS基因表达量没有显著变化。上述研究结果表明,LvTPS与凡纳滨对虾应对高温胁迫过程密切相关。本研究可为解析凡纳滨对虾应答高温胁迫机制提供一些基础数据。     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)p38 MAPK基因克隆及表达分析

应用RACE克隆技术获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)p38 MAPK基因全长c DNA序列,并对该序列进行分析。结果显示,中国对虾p38 MAPK基因全长为1563 bp,开放阅读框长1098 bp,5'非编码区长122 bp,3'非编码区长343 bp,将该基因命名为Fcp38。氨基酸序列分析推测,该基因编码365个氨基酸,分子量为41.77 k Da,理论等电点为5.68。同源性分析表明,Fcp38基因与凡纳滨对虾和日本囊对虾的p38相似性最高,为98%。通过比对发现,该基因除含p38家族特有的标志性Thr-Gly-Tyr双磷酸化位点和底物结合位点Ala-Thr-Arg-Trp,还具有p38家族关键功能位点ED。系统进化分析显示,Fcp38与凡纳滨对虾和日本囊对虾的p38聚为一支。荧光定量PCR结果显示,Fcp38基因在肠、鳃、胃、心脏、淋巴、肝胰腺、肌肉、血细胞中均有表达,以在肌肉中表达量最高。氨氮胁迫后,该基因在中国对虾肌肉、血细胞、鳃、心脏、肠和胃中的相对表达量均显著增加,且有不同的时空表达趋势,表明Fcp38基因可能在中国对虾应对环境胁迫过程中起着重要作用。     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)p38 MAPK基因克隆及表达分析

应用RACE克隆技术获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis) p38 MAPK基因全长cDNA序列,并对该序列进行分析.结果显示,中国对虾p38 MAPK基因全长为1563 bp,开放阅读框长1098 bp,5′非编码区长122 bp,3′非编码区长343 bp,将该基因命名为Fcp38.氨基酸序列分析推测,该基因编码365个氨基酸,分子量为41.77 kDa,理论等电点为5.68.同源性分析表明,Fcp38基因与凡纳滨对虾和日本囊对虾的p38相似性最高,为98％.通过比对发现,该基因除含p38家族特有的标志性Thr-Gly-Tyr双磷酸化位点和底物结合位点Ala-Thr-Arg-Trp,还具有p38家族关键功能位点ED.系统进化分析显示,Fcp38与凡纳滨对虾和日本囊对虾的p38聚为一支.荧光定量PCR结果显示,Fcp38基因在肠、鳃、胃、心脏、淋巴、肝胰腺、肌肉、血细胞中均有表达,以在肌肉中表达量最高.氨氮胁迫后,该基因在中国对虾肌肉、血细胞、鳃、心脏、肠和胃中的相对表达量均显著增加,且有不同的时空表达趋势,表明Fcp38基因可能在中国对虾应对环境胁迫过程中起着重要作用.     

中华绒螯蟹ELOVL6 cDNA全长克隆及其表达分析

为了探究中华绒螯蟹自身脂肪酸合成能力,采用RACE技术,克隆获得中华绒螯蟹ELOVL6 c DNA序列全长(Gen Bank accession:KT779219)。该序列全长2247 bp,包括235、873和1139 bp的5'非编码区(5'-UTR)、开放阅读框(ORF)和3'非编码区(3'-UTR),编码290个氨基酸(AA),具有ELOVL家族的全部特征:6个跨膜区、高度保守的组氨酸簇HXXHH、多个保守区以及内质网滞留信号KXKXX。分析发育树表明,ELOVL2与ELOVL5聚为一支,ELOVL6聚为另一支,其中中华绒螯蟹ELOVL6与其他节肢动物ELOVL6聚为一支,与凡纳滨对虾聚为一小支。采用异源表达方法研究ELOVL6编码的蛋白质对脂肪酸的作用,GC-MS结果显示,转基因的酵母培养物C16:0和C16:1n-7含量下降,而C18:0和C18:1n-9的含量升高,同时有新产物C18:1n-7产生。通过荧光定量PCR(q PCR)技术研究ELOVL6基因在中华绒螯蟹不同组织及不同脂肪源喂养下的表达情况,显示该基因在肠道、胃、心脏、肝胰腺、胸神经节、肌肉、眼柄、鳃和脑神经节9个组织均有表达,其中在肝胰腺中表达量最高,显著高于其他组织;在不同脂肪源饲喂的结果中,肝胰腺、肌肉、卵巢和精巢4个组织中均有表达,并且各组织在全鱼油组饲喂下表达量最低,其中用全豆油组饲喂后,肝胰腺中的表达情况显著升高,明显高于全鱼油组和鱼油豆油混合组。以上结果综合表明,中华绒螯蟹中ELOVL6能够催化C16的饱和及C16的单不饱和脂肪酸延长,同时受到饲料中不同脂肪源的一定影响,这为探究中华绒螯蟹PUFA合成途径及脂肪酸调控机制提供了依据。     

中华绒螯蟹铁蛋白基因的克隆及表达分析

铁蛋白普遍存在于生物体内,具有铁离子解毒和储存等功能。在构建脂多糖刺激的中华绒螯蟹cDNA文库的基础上,获得了中华绒螯蟹铁蛋白基因EsFer的cDNA序列,其全长为1 118 bp,包含480 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为159氨基酸,其5′ 和3′ 端的非编码区分别为178 bp和461 bp,预测的分子量为18.3 ku,理论等电点为5.81,在15~37 aa处有一个跨膜螺旋。在5′ 非编码区核甘酸序列的135~162的位置有个特殊的结构,即铁反应元件(iron response element,IRE)。通过荧光定量PCR的方法研究了铁蛋白基因在中华绒螯蟹的组织表达分布,以及经脂多糖刺激后在血淋巴、肠和肝胰腺组织中的表达变化,发现EsFer在中华绒螯蟹血淋巴、肌肉、肠、鳃、心脏、性腺、肝胰腺等组织器官中都有表达,在肝胰腺的表达量最高,血淋巴中表达量最低。经脂多糖诱导后EsFer在血淋巴、肠和肝胰腺呈上调表达。     

凡纳滨对虾Arf6基因的克隆及表达分析

通过电子克隆所得序列设计引物,采用PCR扩增方法首次克隆得到长695bp的凡纳滨对虾Arf6基因序列,其中包括96bp的5'非翻译区(Untranslated region,UTR)、71bp的3'非翻译区和528bp的开放阅读框.编码175个氨基酸残基,推算分子量约为20kDa,理论等电点为8.82,分子式为C896H1426N252O255S8.氨基酸序列分析表明,Arf6基因编码的氨基酸序列中具有保守的GTP结合区域,总的带负电荷的残基(Asp+Glu)为21,总的带正电荷的残基(Arg+Lys)为25.与其他物种的Arf6基因进行同源比对发现,该基因的氨基酸序列具有较高的保守性,基于氨基酸序列的聚类分析表明,凡纳滨对虾与果蝇属种类亲缘关系最近.半定量RT-PCR的结果显示,该基因在组织中广泛表达且在肝胰腺中表达量最高,在眼柄中表达最低;其在经桃拉综合征病毒(TSV)感染后的凡纳滨对虾肝胰腺中的表达量显著高于在无特定病原(SPF)凡纳滨对虾;加之ProtFun在线预测蛋白质的功能分类,表明Arf6基因可能是一免疫应答因子参与凡纳滨对虾免疫防御反应.     

斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)获得了斑节对虾(Penaeus monodon)谷氨酸脱氢酶基因(PmGDH)的cDNA序列。该序列全长2386 bp,开放阅读框(ORF)为1677 bp,3?非编码区(UTR)为688 bp,包括含有27个碱基的poly(A)尾,5?非编码区(UTR)为21 bp。ORF可编码558个氨基酸,预测分子量为61.837 kD,理论等电点为6.57。序列含有ELFV dehydrog N与NAD bind 1 Glu DH两个保守结构域,37个磷酸化位点,3个糖基化位点。通过同源性、相似性以及系统进化树分析,斑节对虾的GDH基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)GDH基因的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了PmGDH基因在斑节对虾不同组织、氨氮胁迫过程中差异表达情况。结果表明, PmGDH的mRNA在各组织中都有表达,其中,在肌肉组织中表达量最高,其次为眼柄神经,在血淋巴与肠组织中表达量最低。96 h氨氮胁迫后,荧光定量PCR分析结果表明PmGDH在肝胰腺和鳃组织中的表达与对照组相比都具有显著差异(P<0.05),都具有不同程度的表达上调。表明PmGDH在氨氮代谢方面具有重要的作用,参与了斑节对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。     

斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得了斑节对虾(Penaeus monodon)谷氨酸脱氢酶基因(PmGDH)的cDNA序列。该序列全长2386 bp,开放阅读框(ORF)为1677 bp,3'非编码区(UTR)为688 bp,包括含有27个碱基的poly(A)尾,5'非编码区(UTR)为21 bp。ORF可编码558个氨基酸,预测分子量为61.837 k D,理论等电点为6.57。序列含有ELFV dehydrog N与NAD bind 1 Glu DH两个保守结构域,37个磷酸化位点,3个糖基化位点。通过同源性、相似性以及系统进化树分析,斑节对虾的GDH基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)GDH基因的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了PmGDH基因在斑节对虾不同组织、氨氮胁迫过程中差异表达情况。结果表明,PmGDH的m RNA在各组织中都有表达,其中,在肌肉组织中表达量最高,其次为眼柄神经,在血淋巴与肠组织中表达量最低。96 h氨氮胁迫后,荧光定量PCR分析结果表明PmGDH在肝胰腺和鳃组织中的表达与对照组相比都具有显著差异(P0.05),都具有不同程度的表达上调。表明PmGDH在氨氮代谢方面具有重要的作用,参与了斑节对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。     

中国明对虾caspase2基因克隆及其在抗白斑综合征病毒中的表达分析

采用RACE技术克隆获得中国明对虾caspase2基因cDNA序列全长,并对该序列进行分析。结果显示,中国明对虾caspase2基因全长为1517 bp,开放阅读框长924 bp,5'非编码区长78 bp,3'非编码区长515 bp,命名为FcCasp2。推测该基因编码307个氨基酸,预测分子量为34.21 ku,理论等电点为7.62。同源性和系统进化分析发现,FcCasp2基因与凡纳滨对虾caspase2和斑节对虾caspase的相似性分别为88%和80%,与其他节肢动物caspase家族基因聚为一类。荧光定量RT-PCR结果显示,FcCasp2基因在肝胰腺中的相对表达量最高,在肌肉中表达量最低。WSSV感染后该基因在中国明对虾肌肉、肝胰腺和鳃丝中的表达量有不同的时空表达趋势,表明FcCasp2基因可能参与中国明对虾生物胁迫的应答反应。     

凡纳滨对虾热休克蛋白90基因cDNA全长克隆及表达分析

为探究咪唑类物质KK-42提高凡纳滨对虾存活率的机理,克隆出HSP90全基因序列,采用real-time PCR法研究该基因的时空表达状况。将体长3.5～5.0cm的凡纳滨对虾幼虾随机分成2组,分别用1.95×10-4 mol/L的KK-42溶液和不含KK-42的溶液浸泡1min后,在相同条件下常规饲养。试验结果显示,凡纳滨对虾HSP90开放阅读框为2160bp,编码720个氨基酸,包含HSP90家族的保守序列。HSP90在凡纳滨对虾脑、肌肉、眼柄和肝胰腺中均有表达,其中肝胰腺中的表达水平较高。KK-42处理后,肝胰腺中HSP90mRNA水平升高69.1%以上(P0.05),其中第2d和3d,mRNA含量分别升高了505.5%和481.7%(P0.01)。结果表明,KK-42能诱导凡纳滨对虾肝胰腺HSP90的表达,这可能是KK-42提高凡纳滨对虾存活率的机制之一。     

中华绒螯蟹RXR基因全长cDNA克隆及表达分析

维甲类X受体(retinoid X receptor,RXR),属于核受体超家族(nuclear receptor super family)成员,是一种重要的调控因子,对甲壳动物生长发育和繁殖具有十分重要的作用。本研究根据陆地蟹 RXR基因保守区序列设计上下游引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)RXR基因并进行各组织间的表达分析。序列分析表明中华绒螯蟹RXR cDNA全长1517bp,编码433个氨基酸。经BLASTn和BLASTx分析表明,中华绒螯蟹RXR氨基酸序列与陆地蟹RXR基因的氨基酸序列相似性最高,为96%。系统进化树分析显示,中华绒螯蟹RXR的氨基酸序列与陆地蟹RXR聚为一支。荧光定量PCR结果显示,RXR在所有检测的组织中均有表达,且在中华绒螯蟹Y器官中表达量最高,肝胰腺、鳃和肌肉中有少量表达,心脏、胃、肠、胸神经节和脑神经节中微量表达。在中华绒螯蟹不同蜕皮时期中,Y器官中RXR表达量在D期最高,与AB期、C期呈显著性差异（P＜0.05）;肌肉中RXR在AB期表达量最高,与其他蜕皮时期呈显著性差异（P＜0.05）;肝胰腺和鳃中RXR在AB期表达量最高,E期表达量最低,但各蜕皮时期表达量之间差异不显著。     

中国明对虾MKK3 基因cDNA 克隆及其在氨氮胁迫下的表达

采用RACE技术克隆获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)丝裂原活化蛋白激酶激酶3(MKK3)基因全长c DNA序列,并对该序列进行分析。结果表明,该基因全长为1434 bp,开放阅读框长1011 bp,5′非编码区长33 bp,3′非编码区长390 bp,将该基因命名为Fc MKK3。推测该基因编码336个氨基酸,分子量为37.89 k D,理论等电点为6.08。同源性和系统进化分析表明,Fc MKK3基因与丽蝇蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)和地中海实蝇(Ceratitis capitata)的相似性分别为69%和68%,与其他节肢动物MKK3聚为一类。荧光定量RT-PCR结果表明,Fc MKK3基因在肌肉中的相对表达量最高,其次为鳃。氨氮胁迫后该基因在中国明对虾肠、鳃、胃、心脏、肝胰腺、肌肉和血细胞中的表达量均显著增加,并有不同的时空表达趋势,表明Fc MKK3基因可能在中国明对虾应对非生物胁迫反应的过程中起着重要的作用。     

凡纳滨对虾核自身抗原精子蛋白基因克隆及其表达

利用cDNA末端快速扩增技术克隆出凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)核自身抗原精子蛋白(NASP)基因,NASP基因c DNA全长2258 bp,其中包括92 bp 5′端非编码区,147 bp 3′端非编码区及2019 bp开放阅读区,编码673个氨基酸,预测分子量为74.18 k D。该序列已提交至Gen Bank,序列号为KT274811。在NCBI上进行序列比对后发现,其与斑节对虾(Penaeus monodon)NASP序列相似性最高,为90%。采用荧光定量PCR方法测定了不同发育时期卵巢与肝胰腺中NASP m RNA相对表达水平,结果表明,NASP在卵巢中的表达量高于肝胰腺中的表达量,且在Ⅱ期表达量最高,Ⅲ期表达量最低。此外,通过构建系统进化树比较了凡纳滨对虾NASP与其他物种间的遗传距离。实验结果为进一步研究该基因在凡纳滨对虾卵巢发育中的作用提供了依据。     

三疣梭子蟹14-3-3基因的克隆及其在低盐和病原胁迫后的表达分析

本研究利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)14-3-3基因(Pt14-3-3)。Pt14-3-3基因cDNA序列全长为2510 bp,包含开放阅读框741 bp,编码由247个氨基酸组成的蛋白,分子量为27.98 kDa。序列比对结果显示,Pt14-3-3基因与中华绒螯蟹14-3-3基因同源性最高(100%)。系统进化树分析表明,Pt14-3-3氨基酸序列与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)紧密聚为一支。组织表达分析显示,Pt14-3-3基因在肝胰腺、肌肉、鳃、心脏、眼柄、血淋巴中均有表达,其中,在肝胰腺中的表达量最高。低盐胁迫后,Pt14-3-3基因在鳃和肝胰腺中的表达量分别于48 h和12 h显著上调并达到最大值,分别为对照组的1.34倍(P<0.05)和7.54倍(P<0.05)。人工感染副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和白斑综合征病毒(WSSV)后,Pt14-3-3基因在肝胰腺和血细胞中整体均呈显著上调表达,最高上调17.52倍(P<0.05)。本研究结果表明,Pt14-3-3基因可能在三疣梭子蟹低盐适应和免疫反应中发挥重要作用。     

凡纳滨对虾脂肪酸结合蛋白基因全长cDNA的克隆及序列分析

克隆了凡纳滨对虾脂肪酸结合蛋白基因全长cDNA并进行了序列分析。该基因由1042bp的碱基组成,开放阅读框长411bp,编码由136个氨基酸组成的蛋白,基因两翼分别存在113bp(5'端)和518bp(3'段)的非翻译区。聚类分析表明,凡纳滨对虾脂肪酸结合蛋白氨基酸序列与斑节对虾脂肪酸结合蛋白紧密聚为一支,之后聚类顺序依次为刀额新对虾、意大利蜜蜂、斑马鱼、大西洋鲑、鸡、猪和人。通过半定量RT-PCR对该基因在不同组织的表达分析表明,该基因在抗IHHNV对虾肠、胃、肝胰腺和肌肉组织中表达较高,在心肌中表达较低,在眼柄中不表达。比较该基因在抗IHHNV对虾和IHHNV易感对虾心、肝胰腺、肠、胃、眼柄和肌肉组织表达发现,该基因在两种对虾心、肠、胃和肌肉组织中的表达无明显差异,但在肝胰腺中抗IHHNV对虾的表达量明显高于IHHNV易感对虾的表达量,说明该基因参与抗性对虾抑制IHHNV感染的免疫过程。