农杆菌介导法将抗草甘膦基因转入玉米自交系

利用农杆菌介导法将抗草甘膦基因(ssu-G₂-aroA)转入优良玉米自交系R18-599和齐319,侵染后的愈伤组织转至潮霉素浓度为10 mg/L的筛选培养基上,继代筛选3轮,每轮3周;得到的抗性愈伤组织在含有潮霉素浓度为3 mg/L的分化培养基上进行分化,R18-599获得30株再生植株,齐319获得18株再生植株。经PCR鉴定后共得到7株转化抗性植株(4株R18-599、3株齐319)。经PCR-Southern及RT-PCR检测结果表明,ssu-G₂-aroA基因已稳定整合到了玉米基因组中,并在RNA水平上得到表达。     

玉米Opaque-2基因在毕赤酵母中的表达

从玉米自交系辽2345授粉后18 d的胚乳中提取总RNA,经反转录后得到第一链cDNA,利用Opaque-2基因的特异引物克隆出该基因的全编码区,将该编码区的全序列以正确的阅读框架利用Infusion同源重组的方法亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9的α因子下游,并置于AOXⅠ启动子控制下,利用pPIC9表达载体上的特异引物进行PCR鉴定,鉴定后的重组质粒用Bgl Ⅱ酶切线性化后,电转化导入甲醇型毕赤酵母菌株GS₁15中,利用MM、MD和菌落PCR的方法筛选出Mut⁺表型,得到的重组子以甲醇诱导表达蛋白。经SDS-PAGE结果显示,Opaque-2蛋白得到表达,其相对分子质量（Mr）约为47 KD。     

高粱EPSPS基因的克隆、修饰及在玉米中的功能验证

针对草甘膦结合位点,对高粱5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）基因进行4种定点修饰,将修饰后的基因分别导入到玉米中。通过对转化体的抗性鉴定,确定将高粱EPSPS基因106位的脯氨酸变为丝氨酸（P106S）能够赋予转基因玉米草甘膦抗性。在喷施4倍的草甘膦时抗性事件CL38-1不产生药害。Southern杂交结果表明,目标基因在该转化事件中稳定遗传,转化其余3种EPSPS基因的植株对草甘膦没有足够的抗性。     

玉米雄性不育突变体ms1153的遗传分析与基因定位

以玉米雄性不育突变体ms1153为材料,通过减数分裂期花粉母细胞染色体观察和不同发育时期花药石蜡切片分析突变体不育表型产生的原因,利用F₁和F₂群体确定突变体MS1153的遗传方式和基因ms1153物理位置。结果表明,与野生型相比,突变体植株在营养生长期无明显差异,在生殖生长阶段花药不能从颖壳外露,成熟花粉粒内无淀粉积累。细胞学分析发现,突变体减数分裂过程正常,但减数分裂后绒毡层降解推迟。遗传分析表明,突变体ms1153的不育性状受1对隐性核基因控制。利用图位克隆的策略将MS1153基因定位于玉米第4染色体分子标记8243与8275之间,物理区间为221.4~226.2 Mb,此区间内没有已克隆雄性育性基因,说明MS1153是一个新的玉米雄性育性基因。     

过量表达拟南芥GPX3基因提高玉米苗期抗旱性研究

通过农杆菌介导法将拟南芥抗旱基因AtGPX3导入玉米自交系郑58中,用PCR和RT-PCR法对转化玉米进行检测,在水分胁迫下对T₁代转基因玉米和非转基因玉米进行抗旱性分析。结果表明,共得到56株转化苗,检测获得9个株系的30株T₀代转基因阳性植株,抗性植株阳性率为53.6%。RT-PCR检测表明,T₁代有6个株系为稳定遗传阳性株系,并且AtGPX3基因在转基因玉米中表达量大幅度提高。耐旱性分析表明,非胁迫条件下,非转基因和转基因株系中游离脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）的含量基本无显著差异。在干旱胁迫条件下,转基因玉米叶片的Pro含量高于非转基因玉米,比非转基因株系提高了46.2%;MDA含量低于非转基因玉米,比非转基因玉米下降了34%。通过导入AtGPX3基因,可以提高玉米苗期的耐旱性。     

玉米胚乳突变基因ae1和du1的遗传效应

利用玉米ae1和du1隐性纯和突变自交系与普通玉米自交系48-2的杂交F₁、F₂代子粒为研究材料,通过单粒法测定子粒的直链淀粉含量和重量,用于分析玉米胚乳突变基因ae1和du1的遗传效应。结果表明：F₂代中具有ae1或者du1纯和突变的子粒表皮皱缩,重量明显下降,直链淀粉含量显著提高。在ae1与du1的杂交后代中,子粒的单粒重和直链淀粉含量没有显著变化,表明ae1与du1双突变并不能导致直链淀粉含量增加。单突变的ae1和du1群体内各子粒间的直链淀粉含量和重量差异较大,说明遗传背景中存在影响直链淀粉含量的修饰基因,表明在选育高直链淀粉玉米品系时,应当重视遗传背景的选择和修饰基因的累加。采用单粒法技术对分离后代进行直链淀粉含量和重量选择,有利于积累高直链淀粉修饰基因,是选育子粒饱满、高粒重的高直链淀粉玉米自交系的有效方法。     

转小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥植株的主要抗旱性研究

核氧还蛋白（nucleoredoxin,NRX）可通过还原目标蛋白的二硫键来调控其生物活性,在植物的生长发育和抗逆境胁迫中发挥着重要作用。蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）、h型硫氧还蛋白（h-type thioredoxin,TRXh）和蛋白磷酸酶2A催化亚基（protein phosphatase 2A catalytic subunit,PP2Ac）是小麦核氧还蛋白TaNRX1的互作蛋白。为了明确TaNRX1互作蛋白的抗旱性功能,本研究在拟南芥中过表达了小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因,对野生型和转基因拟南芥的表型和抗旱相关生理指标进行了鉴定。结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的根长、存活率、脯氨酸含量均大于野生型,离体叶片失水率、丙二醛（MAD）含量均小于野生型。二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）对H₂O₂组织定位染色结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的H₂O₂含量均低于野生型。上述结果说明,TaNRX1的互作蛋白基因 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D增强了拟南芥对于干旱胁迫的抵抗能力。本研究可为小麦抗旱育种提供候选基因和理论基础。     

玉米耐旱相关基因dbf1的序列变异分析

玉米dbf1 基因在干旱胁迫下的编码产物与DIP₁蛋白相结合,调控植物激素脱落酸（ABA）响应基因rab17 的表达,从而提高耐旱性。以B73的dbf1 基因组序列为模板,对104个玉米自交系的dbf1 基因进行测序,研究玉米dbf1 基因的序列多态性。多态性分析表明,在全长为2 118 bp的序列中共发现48个SNP和12个InDel。尽管大部分变异位点集中在非编码区,但编码区的1个InDel和3个非同义突变位点的变异可以产生氨基酸序列改变。玉米dbf1 基因的全长序列和编码区序列的变异位点可以分别将该基因划分成33和11种单倍型,并且编码7种蛋白质。在供试材料中,dbf1 基因至少经历了9次重组,中性检测表明,该基因的进化没有偏离中性选择。     

耐盐碱基因eIF1A对玉米遗传转化研究

以来自柽柳的耐盐碱基因eIF1A为研究对象,构建其单子叶植物表达载体,并利用农杆菌介导法转化极早熟玉米自交系加2和M1的胚性愈伤组织,创制转eIF1A基因玉米新材料,为耐盐碱转基因玉米育种提供技术和材料支持。结果表明,成功构建eIF1A基因的单子叶植物表达载体pCAMBIA3300-Ubi-eIF1A,共获得33株除草剂抗性植株,其中,12株目的基因和筛选标记基因PCR呈阳性反应,RT-PCR检测表明,目的基因正常转录表达。     

Ae显性突变体对玉米农艺性状及直链淀粉含量的影响分析

玉米直链淀粉是重要的食品和工业原料,高直链淀粉性状的产生受多种酶和基因-环境等因素的共同影响。玉米ae基因（amylose extender）突变导致子粒中直链淀粉含量增高、子粒表面皱缩、淀粉颗粒呈不规则形状、尺寸不均匀且表面基质蛋白增多,用于玉米育种后获得的品种直链淀粉含量升高,产量显著降低。通过将显性Ae突变体与16份优质玉米自交系杂交,对F₁代植株进行开花期、株型、产量性状调查,分析F₁代子粒总淀粉、直链淀粉的含量。结果表明,Ae突变体与不同的自交系杂交,F₁代直链淀粉含量及产量的变化存在明显差异,与基因型有密切关系,以Ae突变体和W16F41、CA240为亲本杂交,可显著提高直链淀粉含量同时产量变化最小。根据F₁代表现筛选直链淀粉含量提高、产量变化较小的双亲配制杂交种,可加速高直链淀粉玉米新品种培育进程。     

宁夏小麦黄色素含量相关基因的组成与分布

选育低黄色素含量品种是宁夏小麦品质改良的重要目标之一。为阐明宁夏小麦中控制籽粒黄色素含量基因TaZds-A1和TaZds-D1的组成及分布特点,利用其功能标记YP2A-1和YP2D-1对91份小麦品种进行检测与分析。结果表明,在TaZds-A1位点,等位变异TaZds-A1a(与低黄色素含量相关)和TaZdsA1b(与高黄色素含量相关)分别占59.3%和40.7%;在TaZds-D1位点,等位变异TaZds-D1a(与高黄色素含量相关)占95.6%,TaZds-D1b(与低黄色素含量相关)仅占4.4%。宁夏小麦黄色素含量基因位点存在4种等位变异组合类型:以TaZds-A1a/TaZds-D1a(57.1%)组合类型为主,TaZds-A1b/TaZds-D1a(38.5%)组合类型次之,TaZds-A1a/TaZds-D1b和TaZds-A1b/TaZds-D1b组合类型最低(2.2%);不同等位变异组合类型在不同地区间的分布比例也不同。     

小麦TaDHN2基因及其启动子的克隆与功能研究

为给深入研究Ta DHN2基因在小麦抗旱机制中的作用机理奠定基础,并为进一步丰富小麦DHN基因研究内容提供参考,本研究通过筛选石麦15基因组BAC文库和BAC克隆测序方法克隆了Ta DHN2基因及其启动子,并对Ta DHN2基因序列特征、表达模式和启动子功能等进行了分析和探讨。结果表明,Ta DHN2基因含有1个88 bp的内含子,开放读码框长为696 bp,编码1个含有231个氨基酸的脱水素蛋白。Ta DHN2蛋白具有Y-segment、S-segment和K-segment结构域,属于YSK2类型脱水素蛋白。此外,该蛋白含有明显的核定位信号序列S-segment和基序RRKK。Ta DHN2基因受渗透胁迫诱导表达,在根和叶中表达模式类似,叶中表达量显著高于根中。Ta DHN2基因启动子序列长为2 025 bp,预测含有9个脱水响应顺式元件。在转基因拟南芥中,Ta DHN2基因启动子能够启动GUS基因表达,并在渗透胁迫下诱导GUS基因上调表达。以上结果说明,Ta DHN2基因为脱水响应基因,其启动子为渗透胁迫强诱导启动子。     

华山新麦草穗发芽抗性相关基因AIP2的克隆及其序列分析

为了挖掘和利用华山新麦草(Psathyrostachys huashanica,2n=14,NsNs)的优良基因,拓宽小麦穗发芽抗性基因资源,以华山新麦草为材料,采用同源克隆的方法克隆AIP2基因,利用生物信息学软件分析其基因结构及功能。结果表明,从华山新麦草中成功克隆AIP2基因,该基因的开放阅读框为840bp,编码279个氨基酸残基,结构域预测结果显示AIP2蛋白含有完整的Ring保守域,属于锌指环家族成员。AIP2的gDNA含5个外显子,4个内含子,华山新麦草AIP2氨基酸序列与感穗发芽小麦品种中优9507的AIP2氨基酸序列的相似性为84%,与中优9507相比缺失了44个氨基酸,与抗穗发芽的乌拉尔图小麦的AIP2氨基酸序列的相似性为80%,华山新麦草和乌拉尔图小麦都有氨基酸缺失,推测这些缺失的氨基酸可能与华山新麦草穗发芽抗性强有很大关系。本研究为小麦穗发芽抗性改良提供了新的候选基因。     

玉米opaque2近等基因系中相关基因的表达量分析

Opaque2(O2)基因编码产生OPAQUE2蛋白,该蛋白为碱性亮氨酸拉链家族的一种转录因子,可作用于基因的启动区,调控基因的转录。辽2345/o2为本实验室构建的辽2345的opaque2(o2)基因回交导入系,蛋白组学分析表明,辽2345与辽2345/o2在授粉后18 d的胚乳细胞中表达蛋白的种类和数量存在很大差异,从中筛选出差异较明显的9种蛋白质。为了进一步验证O2与9种蛋白间的作用关系,应用相对荧光定量PCR的方法对9种蛋白进行了RNA水平表达量的检测。结果表明,在胚乳发育过程中Chfi很可能受到O2的抑制作用,O2很可能对Ubc、Lgl、Sdh、LOC541920、Shmt、Ppdk等基因存在某种促进或激活作用。     

郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因突变位点分析与高效分子标记开发

opaque2突变体材料是最常用的高赖氨酸玉米供体。对已获得的郑58/o2近等基因系研究表明,胚乳发育不同时期22-kDα-醇溶蛋白的积累均明显低于郑58。荧光定量PCR结果表明,α-醇溶蛋白家族基因Z1A、Z1B、Z1C和Z1D的表达均显著低于郑58。郑58/o2胚乳发育不同时期Opaque2基因均正常表达。测序分析发现,郑58/o2中o2基因ATG后713 bp处缺失10个碱基,ORF预测Opaque2蛋白翻译提前终止。针对突变缺失位点开发基因内分子标记o2-indel-1,利用该标记进行回交转育,结果表明,o2-indel-1与o2突变表型完全连锁,错选率为0。opaque2基因突变位点的解析有助于高效分子标记的开发,有效降低错选率,提高优质蛋白鲜食玉米多基因聚合育种的选择效率。     

Molecular characterization and comparative analysis of four new genes from Sec2 locus encoding 75K γ-secalins of rye species

Using a PCR-based strategy, four new 75K γ-secalin genes were isolated from Secale cereale, Secale vavilovii, Secale sylvestre, and Secale strictum in genus Secale (rye). Based on amino acid sequences, the primary structure of the 75K γ-secalin subunits was demonstrated, which was composed of four main structural regions: (a) a conservative 19 amino acids signal peptide, (b) a steady short N-terminal region of 12 amino acids containing a cysteine residue, (c) a repetitive domain, which began with the conservative tetrapeptides PQ₃ and was rich in glutamine and proline. PFPQ₁₋₂(PQQ)₁₋₂ was the core repeat motif in the repetitive region. Besides amino acid substitutions, this region showed variations in length due to the insertion and deletion events. In the repetitive region of EF432549 (Secale strictum), there were two octapeptides (PFPQQPQQ and PVPQQSQQ) insertions. On the contrary, deletion events of two residues (QT) took place in EF432546 (Secale sylvestre). Accounting for the amino acid replacement, an extra cysteine residue appeared in the repetitive region of EF432546, which did not exist in other genes, and (d) a conserved 143 amino acids C-terminal domain including eight cysteine residues. The implications of the results for quality improvement are discussed.     

玉米子粒粉质突变体3901l的图位克隆

粉质胚乳突变体3901l来源于美国种质中心,该突变体胚乳呈现完全不透明表型。生化分析发现,该突变体α-和β-醇溶蛋白剧烈下降,同时伴随着非醇溶蛋白的大幅度升高。通过玉米SNP3072芯片进行基因分型分析发现,3901l基因定位于7号染色体约33 M的区间。通过与o2突变体进行等位测试,确认3901l是o2的等位突变体。进一步研究表明,该突变体的O2转录本缺失了一个61-bp的外显子,造成开放阅读框移码和翻译提前终止。利用O2特异抗体检测子粒总蛋白,发现突变体中O2蛋白完全缺失,不能检测到提前终止的O2蛋白,说明错误翻译的O2蛋白被机体快速识别并降解。     

Effect of two plant growth regulators on the yield and quality of russet burbank potatoes

Summary Foliar applications of ethephon (ETH) 300 g a.i. ha⁻¹; chlormequat chloride (CCC) 920 g a.i. ha⁻¹, with a second application of 230 g a.i. ha⁻¹ approximately 2 weeks later; and a mixture of the two (ETH/CCC) 156 g a.i. ethephon and 299 g a.i. chlormequat chloride ha⁻¹ were made to field-grown Russet Burbank potatoes in 1986, 1987 and 1989. All the treatments increased the number of tubers set and reduced the average tuber weight compared to the control resulting in a reduction in premium and marketable tubers, and an increase in small tubers. Differences were greatest for ETH and least for CCC. ETH and ETH/CCC decreased the specific gravity, increased the incidence of deformities, and decreased the incidence of tubers with hollow heart. The growth regulators did not affect fry colour.     

不同发育特性小麦品种春化基因 VRN2的序列分析

为了明确小麦春化基因VRN2与春化发育表现型的关系,以6个不同春化发育特性的普通小麦品种为试验材料,采用PCR技术对春化基因VRN2的CCT保守区中43个氨基酸序列进行了分析。结果表明,不同品种间ZCCT-A1的CCT功能域的序列存在差异,肥麦有R35W突变,另外5个品种均有R39C突变;ZCCT-A2均存在R16C突变;B和D基因组中均未发现突变。这表明VRN2基因编码区的等位变异主要出现在A基因组上,而B和D基因组中的VRN2基因在目前大面积主栽品种中均为显性。