利用CRISPR/Cas9技术对鸡AMHR2基因进行精确编辑

为了在鸡基因组上对AMHR2基因进行精确编辑,该研究利用crispr.mit.edu:807网站设计并通过PCR退火拟合获得成对的AMHR2基因靶位点,将靶位点分别整合进pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9载体骨架,构建靶向AMHR2基因的成对CRISPR/Cas9敲除载体。将包含成对靶位点的DNA序列整合进pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200 bp repeat.Puro-T2A-GFP载体骨架,构建与敲除载体对应的双荧光报告载体。载体测序鉴定正确后分别共转染HEK293T细胞与鸡DF-1细胞,通过细胞荧光粗略判断CRISPR/Cas9系统是否工作。随后,利用Puromycin对基因编辑阳性的DF-1细胞进行药物筛选富集,提取细胞基因组进行TA克隆,进一步检测CRISPR/Cas9系统的工作效率。结果表明靶向鸡AMHR2基因的CRISPR/Cas9敲除系统构建成功,且成对靶位点敲除系统的工作效率高于单一靶位点敲除系统,CRISPR/Cas9敲除系统在DF-1细胞基因组上对AMHR2基因的敲除效率约为60.0%,并在鸡DF-1细胞基因组上实现了AMHR2基因的精确编辑。     

CRISPR/Cas9系统在鸡MSTN上的效率验证

随着基因编辑技术的飞速发展,CRISPR/Cas9技术逐渐成为主流。为了验证CRISPR/Cas9系统在鸡基因组上的切割效率,在鸡肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因第1、第2外显子上各自筛选了5个Cas9靶点,构建p X330-sg RNA表达载体;将GFP质粒电转入DF-1细胞,通过检测表达GFP细胞的比例来优化电转程序;将载体用优化后的电转程序电转入DF-1细胞,培养72 h;最后收集细胞提取基因组,通过T7核酸内切酶Ⅰ(T7EⅠ)酶切试验,选出具有Cas9切割效率的靶点片段,将该片段连入p MD19-T载体,测序并分析结果。结果表明CRISPR/Cas9系统可以成功对DF-1细胞基因组进行切割并引入突变,其中1号外显子上4号靶点的突变率为64.3%,2号外显子上2号靶点的突变率为23.3%。研究表明CRISPR/Cas9系统在DF-1细胞中可以有效切割基因组,为CRISPR/Cas9技术应用于鸡的基因组编辑提供科学依据。     

RNA干扰文库研究进展及其应用

RNA干扰是一种在进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制,存在于许多不同种属的生物体中,在生物体细胞之间进行传递,具有抵抗病毒入侵和维持基因组稳定的作用.RNA干扰文库是以RNA干扰技术为基础建立的一种简单、高效、大规模、高通量的功能基因组学研究的工具,应用于大规模基因功能的筛选,在基因功能研究、发现新的药物靶基因和疾病相关基因等方面具有广阔的应用前景.     

CRISPR/Cas技术可有效介导家鸡基因敲除

本研究旨在家鸡上建立一种高效、稳定的基因组定点编辑技术体系,实现目的基因定点敲除,为后续家鸡基因编辑提供操作依据。基于NCBI数据库提供的CDS序列克隆C2EIP(chr2,Expression In PGC)基因全长,并根据基因序列中APM的位置设计特异性gRNA1、gRNA2和gRNA3,并构建cas9/gRNA载体;将设计好的cas9/gRNA转染状态良好的DF-1,利用Luciferase SSA重组检测法、T7E1酶切法以及TA克隆测序法检测gRNA在DF-1细胞中基因的敲除效率。Luciferase SSA重组检测结果表明,只有cas9/gRNA3载体具有基因敲除活性,荧光活性比对照组高两倍,T7E1酶切结果显示cas9/gRNA3基因的敲除活性为27%,TA克隆测序结果表明,30个测序菌液中有8个菌液出现不同数目的碱基缺失或增加,初步估计基因敲除效率为26%。通过本研究在家鸡中初步建立了cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在鸡的细胞DF-1上介导基因敲除。     

利用CRISPR-Cas9系统定点突变猪MSTN基因的研究

为了今后能够有效的利用CRISPR-Cas9系统进行基因功能研究及转基因动物的培育,本研究将带有绿色荧光蛋白(GFP)和肌肉生长抑制素基因(Myostatin,MSTN)靶序列的CRISPR-Cas9系统转染入PK15细胞系,利用流式细胞仪分离并收集转染成功的阳性细胞,使用PCR扩增结合克隆测序的方法检测和分析CRISPR-Cas9系统的定点突变情况,以评价CRISPR-Cas9系统的作用效果。结果发现,随机挑选的100个阳性克隆中,38个发生了变异,突变效率为38%,其中32个为插入突变,6个为缺失突变。插入突变中突变1(Mutation1)所占比例最高,为47.4%。本研究中CRISPR-Cas9系统的突变效率达到了38%,是目前进行基因组编辑的一个有效工具,推测其突变类型具有一定的偏好性。     

CRISPR/Cas9技术在猪、鸡中的应用研究进展

基因编辑是利用核酸酶在基因组的特定位点产生DNA双链断裂，从而触发细胞自身的DNA损伤修复机制，实现对靶基因序列进行位点特异性修饰。规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspersed short palindromic repeat，CRISPR）及其相关蛋白9（Cas9）系统作为第3代基因编辑技术在农业和基因治疗研究中发挥着重要作用，与传统的锌指核酶和转录激活因子样效应物核酶基因编辑方法相比，它可以靶向基因的任何位点引起DNA双链断裂，实现目标基因的精准敲除或插入外源片段，并能快速、高效地修饰基因组，包括基因敲除、敲入、抑制、激活等，是应用最广泛的基因编辑工具。CRISPR/Cas9技术的出现彻底改变了生命科学、医学和遗传学研究现状。近年来，利用CRISPR/Cas9技术对动物基因组进行修饰，开启了畜禽分子育种的新纪元，不仅极大地推动了现代畜禽养殖技术的发展，而且为人类医学研究做出了特殊贡献，特别是在猪和鸡上。作者以猪和鸡为对象，综述了CRISPR/Cas9技术在异体器官移植供体、人类疾病的生物模型、抗病育种材料、全基因组高通量筛选等方面的研究进展，以及如何利用CRISPR技术快速又简单地生产出基因编辑猪、鸡，为推动CRISPR技术制备其他基因编辑动物提供参考依据。     

1株基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性研究及全基因组序列分析

为研究当前流行的新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）基因型、致病性及其与传统新城疫病毒疫苗株（La Sota等）的核苷酸差异,试验从某发病鸡场病死鸡体内分离到1株疑似NDV毒株,经红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）初步确定为鸡源NDV。参照GenBank公布的NDV F基因部分片段（登录号：JF950510.1）设计1对引物,通过RT-PCR技术扩增分离株的F基因并克隆、测序,测序结果与NCBI中NDV F基因序列进行比对,构建系统进化树并分析其基因型;通过测定鸡胚平均致死时间（MDT）、1日龄鸡脑内致病指数（ICPI）和6周龄鸡静脉致病指数（IVPI）判断病毒致病性;参照GenBank公布的NDV全基因组序列（登录号：JF950510.1）设计9对引物对分离株进行全基因组序列测定,并分析其基因组结构。结果表明,RT-PCR扩增得到F基因长约500 bp,基于F基因构建的系统进化树显示分离株为基因Ⅶ型NDV;MDT、ICPI和IVPI分别为52.8 h、1.675和2.46,表明分离株属于强毒株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组全长15 192 bp,与传统La Sota株基因组相比,序列多出6个碱基,核苷酸序列同源性82.8%。本研究成功分离到1株基因Ⅶ型NDV强毒株,且与传统疫苗毒株La Sota的核苷酸序列同源性差异较大。     

CRISPR/Cas9介导鸡IHH基因载体构建及其敲除效率检测

为了揭示IHH(Indian hedgehog)基因在鸡匍匐性状形成过程中的作用机制,利用在线sgRNA平台设计4条IHH sgRNA序列,构建了sgRNA-PX459表达载体,分别命名为sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4。采用脂质体转染至鸡DF-1成纤维细胞后,通过嘌呤霉素筛选4d后收集阳性细胞,采用试剂盒法提取基因组DNA,利用T7E1内切酶和TA克隆测序方法检测4个表达载体的打靶效率。结果表明:4条sgRNA表达载体构建成功,并且都能高效地在DF-1细胞中表达,其中sgRNA1表达载体能有效地打靶IHH基因,通过测序分析发现打靶效率为75.0%,测序结果表明这些突变都以碱基缺失为主。研究结果为揭示IHH基因在鸡匍匐性状中作用机制奠定了坚实的基础。     

1株基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性研究及全基因组序列分析

为研究当前流行的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基因型、致病性及其与传统新城疫病毒疫苗株(La Sota等)的核苷酸差异,试验从某发病鸡场病死鸡体内分离到1株疑似NDV毒株,经红细胞凝集试验(HA)和红细胞凝集抑制试验(HI)初步确定为鸡源NDV。参照GenBank公布的NDV F基因部分片段(登录号:JF950510.1)设计1对引物,通过RT-PCR技术扩增分离株的F基因并克隆、测序,测序结果与NCBI中NDVF基因序列进行比对,构建系统进化树并分析其基因型;通过测定鸡胚平均致死时间(MDT)、1日龄鸡脑内致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉致病指数(IVPI)判断病毒致病性;参照GenBank公布的NDV全基因组序列(登录号:JF950510.1)设计9对引物对分离株进行全基因组序列测定,并分析其基因组结构。结果表明,RT-PCR扩增得到F基因长约500bp,基于F基因构建的系统进化树显示分离株为基因Ⅶ型NDV;MDT、ICPI和IVPI分别为52.8h、1.675和2.46,表明分离株属于强毒株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组全长15 192bp,与传统La Sota株基因组相比,序列多出6个碱基,核苷酸序列同源性82.8%。本研究成功分离到1株基因Ⅶ型NDV强毒株,且与传统疫苗毒株La Sota的核苷酸序列同源性差异较大。     

CRISPR/Cas9介导CPED1基因敲除载体活性的验证

试验旨在利用CRISPR/Cas9技术分别在鸡成纤维细胞DF-1和鸡胚胎干细胞(Em-bryomic stem cell,ESCs)上介导CPED1基因敲除,以期为后续研究CPED1基因功能提供技术依据。克隆CPED1基因全长;构建cas9/g RNA载体并转染DF-1和ESCs,经流式分选阳性细胞,采用T7E1酶切法选择活性最佳的敲除载体并分析其敲除效率;同时,对DF-1中的脱靶效率进行检测。结果成功克隆鸡CPED1基因,并构建3个cas9/g RNA载体;T7E1酶切结果表明cas9/g RNA1载体在DF-1阳性细胞中的敲除活性(37%)最佳,该载体也可定点敲除ESCs中的CPED1基因,敲除活性为25%,且在DF-1细胞中未发生脱靶。表明CRISPR/Cas9可有效介导鸡CPED1基因在DF-1和ESCs上敲除。     

CRISPR-Cas9系统及其在动物生产和疾病基因治疗中的应用

CRISPR-Cas9系统是生产转基因动物的有力的基因组编辑工具,具有制作相对简单、成本相对较低的优点,可快速用于基因敲除、基因定点突变和基因修复等,在动物基因组定点改造、编辑、疾病控制和治疗中具有广阔的应用前景。文章从CRISPR-Cas9系统的技术原理、研究进展和应用等方面进行描述,旨在阐明CRISPR-Cas9系统的原理及在动物基因组编辑方面的优势和局限,为动物生产、动物基因组编辑、遗传疾病的治疗等研究提供支撑。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在家禽中应用的研究进展

基因组编辑技术的快速发展促进了对特定基因功能探索及模式动物建立的研究。在家禽动物模型中，CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技术是最新和最先进的基因编辑工具，研究人员可以通过修饰和改变禽类基因组中关于转录调节、基因靶向、表观遗传修饰、基因治疗和药物输送等基因功能，进而获得满足需求的优良性状。然而，CRISPR/Cas9系统（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Associated Nuclease 9）在禽类基因组的基因编辑和修饰中的适用性仍处于萌芽阶段。到目前为止，在使用CRISPR/Cas9技术方面只在鸡和鹌鹑2个禽类上取得了实质性进展，在鸡的研究中使用较多。最近在通过禽类生殖细胞系对禽类基因组进行修饰方面取得了重大进展。在家禽养殖业中，育种者和养殖者可以利用CRSPR/Cas9介导的方法来增强特定家禽种群必需基因的变异，以获得原本家禽生产中没有的遗传特征。作为编辑基因工具，CRISPR/Cas9可以在家禽基因...     

基因芯片在抗微生物药学研究中的应用

基因芯片技术是一种高通量、快速、平行、自动化的DNA测序及基因表达研究工具。病原微生物全基因组测序的完成为抗微生物药物提供了大量潜在靶位。因而利用基因芯片技术进行抗微生物药学研究已逐渐成为热点之一。本文从药物作用机制、药物靶位研究、病原菌与寄主的相互作用、病原菌的鉴定及其耐药性的监测以及新药筛选、用药个体化等方面对其进行了综述。     

副猪嗜血杆菌血清4型全基因组序列草图测定与分析

本研究应用Illumina Hiseq 2000测序系统对副猪嗜血杆菌(HPS)血清4型gx033株进行全基因组序列测定,经过DNA文库构建、测序、数据过滤和组装,绘制了全基因组草图.全基因组草图显示,HPS血清4型的基因组大小为2 155 493 bp,G+C含量为39.79％,含有编码基因2 189个,基因总长度1 881 801 bp.基因功能注释表明,849个基因功能尚不明确,1 340个基因被分为能量产生和转化、转录和细胞周期调控等19个功能组.该HPS血清4型全基因组草图的绘制为HPS病的致病机制等研究提供依据.     

利用转线粒体细胞模型验证鸡线粒体基因单倍型对能量代谢的影响

能量代谢对鸡的正常生长发育至关重要。细胞能量代谢平衡由细胞核基因组和线粒体基因组共同调节。然而,不同线粒体DNA单倍型与细胞核互作对鸡能量代谢水平的影响并不清楚。本研究以DF-1细胞为细胞核供体,芦花鸡原代胚胎成纤维细胞与婆罗门鸡原代胚胎成纤维细胞为线粒体供体构建转线粒体细胞,旨在分析相同细胞核背景下不同线粒体DNA单倍型对能量代谢的调控。结果表明,与DF-1比对时,芦花鸡细胞线粒体DNA比婆罗门鸡细胞线粒体DNA错义突变的数量更多,保守性更低。芦花鸡转线粒体细胞与婆罗门鸡转线粒体细胞的氧化磷酸化水平均显著低于DF-1细胞,而糖酵解水平有升高趋势,与原代细胞结果相反。此外,转线粒体细胞的相对ROS含量均高于DF-1细胞。综上所述,线粒体DNA单倍型间差异导致的核质互作可以不同程度影响细胞氧化磷酸化功能和糖酵解水平。本研究为线粒体基因组和细胞核基因组的互作提供了直接证据,为杂交育种方案构建提供了一定的理论基础。     

单细胞测序技术及其在畜牧科学研究中的应用

单细胞测序(Single Cell Sequencing)是对单个细胞进行测序后利用生物信息学等手段进行分析的技术,包括单细胞分离、扩增测序和数据分析3个方面,主要应用于肿瘤、胚胎发育、免疫学等方面。随着单细胞测序技术的迅速发展,单细胞测序技术已成为研究细胞发育中基因组、转录组和表观基因组异质性的重要工具。单细胞测序可以获取单个细胞完整的全基因组,克服了大样本量、细胞异质性等问题,为研究细胞间异质性信息和细胞群体之间关系提供了新的研究策略。本文就单细胞测序方法及其在畜牧科学研究中的应用进行综述,并探讨其应用前景。     

应用CRISPR/Cas9系统对鸡马立克氏病病毒基因编辑的研究进展

鸡马立克氏病病毒（MDV）属于疱疹病毒，基因组巨大，编码百余个基因，绝大多数的基因功能未知，在一定程度上滞后了MDV致病机理的研究。MDV在鸡体内的增殖不受母源抗体干扰使其作为理想的重组疫苗载体一直备受关注。CRISPR/Cas9系统已经广泛应用于基因编辑，具有高效、快捷优势。本文针对近五年利用CRISPR/Cas9系统研究MDV基因功能及重组MDV的进展进行总结，对于MDV的致病与免疫研究具有重要的参考意义，也为其它家禽病毒基因编辑的研究提供参考。     

美洲貂BAC文库的构建及毛皮产业重要候选基因的筛选

BAC文库是基因组分析的有力工具,再结合最新兴起且快速的深度测序技术,从而提供了一个很好的基因组计划的信息平台。本研究介绍了一个产于丹麦的雄性美洲貂CHORI-231BAC文库的构建方法及其特点,该文库包含了165888个克隆,平均插入片段在170kb,代表了约10倍的覆盖度。用一个有18432个克隆位点的高密度过滤器复制两份,用于杂交测序及公共使用。基于Overgo探针的表达序列标记,代表21个与毛皮工业关系密切的特征候选基因,用于BAC文库的筛选,这些候选基因包括了毛色、毛发生长、毛发长度和粗细及一些毛皮病毒疾病的感受器受体等。大规模测序以寻找其中19个相关基因。将获得的与这些基因相关的35个克隆进行高通量测序,并对大的重叠群进行组装。知道这些候选基因的全长序列之后有助于确认表型的位置及揭示目的性状的成因。另外,对1577个克隆进行了末端测序,获得了2505个克隆的末端序列(80%的BAC克隆),对剩余2Mb进行了分析,从而获得了貂皮整个基因组的快照。所构建的CHORI-321美洲貂BAC文库可用于基因和基因组兴趣位点的鉴定。试验描述了如何利用此文库进行特殊位点的鉴定,开发遗传标记,用于BAC末端测序和深度测序以选取克隆。这是首次利用454测序来挑选哺乳动物的克隆,确认了利用此技术获得小基因组目的基因序列信息的可行性。文中所获得的BAC末端测序结果已保存到GenBank数据库(HN339419-HN341884,HN604664-HN604702),从所选取克隆中获得的454序列重叠群的参考编码为(GenBank:JF288166-JF288183&JF310744)。