Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的研制

为研制鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV) VP1蛋白单克隆抗体,用已鉴定的Ⅰ型DHV的全病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,并以构建的原核重组质粒pET-VP-1在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的VP1蛋白作为筛选抗原,通过间接ELISA法对杂交瘤进行筛选,经亚克隆后获得l株针对Ⅰ型DHV VP1蛋白的特异性单克隆抗体.对该株单克隆抗体的特性鉴定发现其特异性强、中和性较好.该抗体为今后Ⅰ型鸭肝炎病毒的检测试剂盒研制提供了重要的生物制剂.     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因克隆及其原核表达

根据Genbank中的Ⅰ型鸭肝炎病毒全基因序列设计了扩增Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因的包含有EcoRV和xhoⅠ酶切位点的引物，用该特异性引物从Ⅰ型鸭肝炎病毒cDNA模板中扩增得到目的基因VP1，以相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET32a后构建重组表达载体，经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆，测序证明目的基因正确插入了表达载体，转化宿主菌RossetaⅡ，用不同浓度的IPTG诱导VP1基因的表达，收集菌液进行SDS-PAGE电泳，Western-blotting分析蛋白免疫原性。结果表明，VP1在大肠杆菌RossetaⅡ中表达量较高，表达产物的分子量约为48ku、并能被Ⅰ型鸭肝炎病毒阳性血清所识别。Ⅰ型鸭肝炎病毒VPI蛋白在大肠杆菌RossetaⅡ中表达产物具有免疫原性。     

鸭甲肝病毒抗体的间接ELISA检测方法的建立

为建立一种切实可行的鸭甲肝病毒抗体的检测方法,将1株临床分离的3型鸭甲肝病毒的VP3基因进行原核表达的纯化蛋白作为包被抗原,初步建立了检测鸭肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。通过条件优化,得到VP3蛋白最佳包被浓度为0.159 5μg/mL,血清最佳稀释倍数为1∶200。结果显示,建立的ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,与商品化的双抗原夹心ELISA的符合率为92.5%,且该方法可同时检测1型和3型鸭甲肝病毒抗体,因而可用于临床免疫鸭甲肝病毒的种鸭血清抗体水平的检测和卵黄抗体的效价测定。     

1型鸭肝炎病毒E53株VP1基因在昆虫细胞中的表达及产物分析

根据1型鸭肝炎病毒E53株基因组序列设计并合成一对特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因,将其定向克隆至pFastBacTMHTB载体,转化至DH10BacTM感受态细胞中,蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒rBacmid-VP1,重组质粒在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒。结果表明VP1蛋白在昆虫细胞中获得表达,表达产物能够与兔抗1型鸭肝炎病毒VP1蛋白多抗血清和鸭肝炎病毒阳性血清发生特异性反应。在昆虫细胞中表达VP1蛋白为VP1功能的研究及鸭肝炎病毒抗体的检测提供了物质材料。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因串联表达载体的构建

为了构建Ⅰ型鸭肝炎病毒双拷贝VP1基因的原核表达质粒,试验采用RT-PCR技术扩增鸭肝炎病毒VP1基因,将其连接到克隆载体pGEM-T Easy中得到重组克隆质粒pGEM-T-VP1,阳性克隆质粒经鉴定正确后,分别用BamHⅠ、XholⅠ、BglⅡ进行酶切,重组后得到pGEM-T-2VP1,然后将双拷贝VP1基因亚克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,得到重组质粒pET-30a(+)-2VP1。结果表明:得到了含有目的基因的阳性克隆。说明Ⅰ型鸭肝炎病毒双拷贝VP1基因原核表达质粒构建成功。     

鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的原核表达和单克隆抗体制备

本试验旨在研制鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的单克隆抗体。将鸭疫里默氏杆菌WJ4菌株的groEL基因进行原核表达,重组蛋白经过纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行3次亚克隆后制备小鼠腹水单克隆抗体。共获得2株稳定分泌鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G2B6和1G2F10。2株单克隆抗体均为IgG1亚类。腹水单克隆抗体ELISA效价达到1:102 400。Western blot检测结果表明2株单克隆抗体均能与鸭疫里默氏杆菌血清1、2和10型菌株发生特异性结合,而与禽致病性大肠杆菌、沙门氏菌和禽巴氏杆菌菌株无反应性。本研究成功制备了稳定性好、特异性强的鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体,为进一步研制基于抗体检测鸭疫里默氏杆菌抗原的试剂盒奠定了基础。     

鸭肠炎病毒VP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

应用截短表达的鸭肠炎病毒(DEV) VP5-C蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合及筛选,获得4株稳定分泌抗VP5蛋白的杂交瘤细胞株,命名为1B5、3A1、4F9、6F6.抗体亚类鉴定表明,4株单克隆抗体均为IgG、k链.间接免疫荧光检测结果表明,4株单克隆抗体均能够与DEV感染CEF发生特异性反应,而不与CEF对照发生反应.Western blot检测,4株单克隆抗体均能够识别大小约为150 kDa的蛋白,说明4株单抗隆抗体是特异性识别VP5蛋白的抗体.DEV VP5蛋白单克隆抗体的制备为进一步鉴定VP5蛋白B细胞抗原表位及VP5蛋白功能研究提供了有效工具.     

3株鸭疫里默氏杆菌OmpA单克隆抗体的制备及特性鉴定

鸭疫里默氏杆菌(RA)病,是家禽中主要的细菌性传染病之一,血清型复杂且各血清型间缺少交叉免疫保护,其中血清1型、2型、10型是国内优势血清型。外膜蛋白A(OmpA)是RA的毒力因子之一,在不同血清型RA中保守性良好。用OmpA蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,与骨髓瘤细胞SP2/0融合后用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,腹腔注射BALB/c小鼠制备单克隆抗体。通过间接ELISA检测单克隆抗体效价及稳定性,秋水仙素法进行染色体分析,Western blot和玻片凝集试验鉴定单克隆抗体特异性。获得3株稳定分泌抗RA OmpA的单克隆抗体,分别命名为2D5、2A6、4H8;3株单克隆抗体的亚型均为IgG2a,腹水效价均为1∶2 048 000,均与鸭疫里默氏杆菌血清1型RA-CH3、血清2型RA-NJ3、血清10型RA-HXb2发生特异性反应,而与其他禽源致病菌不发生交叉反应。本研究成功研制的3株单克隆抗体具有良好的菌种特异性,有助于RA致病机理和RA快速诊断试剂盒的研制。     

传染性囊病病毒(IBDV)VP3蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备抗IBDV VP3蛋白的单克隆抗体,以VP3-His蛋白免疫BALB/c小鼠,经4次免疫、融合、亚克隆,筛选出1株能够稳定分泌抗VP3蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为4H8F7C10。经间接ELISA方法检测,小鼠的腹水效价为2.05×106,单克隆抗体的解离常数(k D)为9.67×10-8,此株抗体亚类为Ig G3。通过Western Blot和间接免疫荧光试验检测,该株单克隆抗体可以识别IBDV感染DF-1细胞产生的VP3蛋白。初步确定此株单克隆抗体的抗原识别区位于VP3蛋白N端的第50-90位氨基酸。此株单克隆抗体的制备为IBDV临床检测方法的建立以及致病分子机制的研究奠定了基础。     

表达1型和3型鸭甲型肝炎病毒VP1基因重组新城疫病毒的构建及其免疫原性

为进一步研发安全有效的鸭甲型肝炎病毒(DHAV)多价疫苗,本研究以新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株为载体,构建出共表达DHAV-1和-3型VP1基因的重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1,并对其毒力、生物学特性进行鉴定。通过间接免疫荧光试验(IFA)验证DHAV-1和-3型VP1蛋白在细胞内能够有效表达。利用Western blot进一步验证重组病毒产生的中和抗体能和DHAV-1和DHAV-3VP1表达蛋白发生较强的反应。重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1保持了原重组疫苗株rLS-RFP对鸡胚的高滴度生长适应和低致病的特性。将重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1免疫种鸭1次,通过中和试验检测该重组病毒能够在鸭体内产生针对DHAV-1和DHAV-3的中和抗体,平均效价分别为1∶18.17和1∶16.60。本研究结果表明重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1具有作为鸭肝炎重组病毒活载体疫苗用于种鸭的潜力。     

新型鸭肝炎病毒疫苗候选株的筛选

本试验对临床患病鸭分离的一株疑似鸭肝炎病毒进行了血清型鉴定和毒力测定。利用Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒鉴别引物对提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增;将分离病毒分别与Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒阳性血清进行中和试验;根据测定的病毒ELD50,进行雏鸭攻毒和鸭胚肝细胞接毒试验。结果表明:RT-PCR扩增出了与新型鸭肝炎病毒预期片段相符的705bp条带;分离病毒不能被Ⅰ型鸭肝炎病毒阳性血清中和,新型鸭肝炎病毒阳性血清对该病毒的中和效价是1:200,说明该分离株属于新型鸭肝炎病毒。该毒株的ELD50为10-5.7/0.2mL,能引起攻毒鸭与临床病例一致的症状和病变以及显著的肝细胞病变,可作为新型鸭肝炎病毒的疫苗候选株开发应用。     

鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒MY株VP1基因克隆、原核表达及抗原性分析

应用巢氏PCR(nested-PCR)扩增出1型鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒MY株结构蛋白VP1基因片段,将VP1克隆到pMD18-T载体上,测序结果为714 bp,GenBank登录号:GU363950。对MY株VP1基因编码蛋白的主要抗原位点进行预测,aa208-aa222氨基酸区段表现很高的亲水性、抗原指数和表面可及性。VP1经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆至pET32a(+)原核表达载体,获得重组质粒pET-VP1,转入BL21 PLyss(DE3)细胞中,IPTG诱导后SDS-PAGE检测结果表明,在大肠杆菌中表达了1个相对分子质量为47 ku的融合蛋白。Western blotting分析结果表明,该重组蛋白可与鸭肝炎标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

传染性法氏囊病病毒VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法的建立

为建立敏感、特异、稳定的传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法,本试验以杆状病毒表达系统表达的重组IBDV-VP2结构蛋白为抗原,通过包被VP2单克隆抗体捕捉VP2结构蛋白的形式,建立鸡血清VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法(VP2-ELISA)。条件优化结果显示:单克隆抗体最适包被质量浓度为3mg/L,VP2最佳稀释度为1∶20,夹心ELISA效价1∶12.8,被捡血清的稀释度为1∶400。该方法与禽流感、鸡新城疫、鸡马立克氏病、鸡传染性喉气管炎病毒及杆状病毒阳性血清无交叉反应,对琼扩效价为1∶32的IBDV阳性血清的最低检出量为1∶12 800,ROC曲线确定的D450nm临界值为0.236,组内、组间重复性试验变异系数均小于10%。用本试验建立的VP2-ELISA方法与进口IBDV-ELISA抗体试剂盒平行检测100份背景已知的临床鸡血清样品,总符合率VP2-ELISA(97%)高于进口ELISA试剂盒(96%)。本试验为进一步研制鸡传染性法氏囊病病毒VP2结构蛋白抗体ELISA检测试剂盒奠定基础。     

鸭1型甲肝病毒亚型VP1蛋白单克隆抗体的研制及鉴定

为制备抗鸭1型甲肝病毒亚型（DHAV-1a）结构蛋白VP1的单克隆抗体（MAbs）,本研究以pGEX-VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,同时以纯化浓缩的全病毒作为包被抗原,建立了筛选抗VP1蛋白阳性杂交瘤细胞株的间接ELISA方法,经融合、筛选制备杂交瘤细胞及鉴定MAbs的稳定性、特异性、腹水效价和中和活性等生物学活性,获得了2株持续且稳定分泌抗体的杂交瘤细胞（1A2和5G3）。MAbs腹水ELISA效价分别为1：3.2×10⁴和1：2.0×10⁶。亚类鉴定均为IgG1/κ型。Western blotting结果显示,2株MAbs均能与DHAV-1a VP1蛋白和DHAV-1a全病毒发生特异性反应。特异性试验结果显示2株MAbs能与鸭1型甲肝病毒（DHAV-1）和DHAV-1a发生交叉反应。中和试验结果显示5G3株具有中和活性。结果表明2株MAbs的ELISA效价高、特异性强、稳定性好,均能与DHAV-1和DHAV-1a全病毒发生特异性反应,其中一株具有中和活性。     

猪脑心肌炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其识别表位分析

为获得针对猪源EMCV结构蛋白VP2的特异性单克隆抗体,本试验以EMCV结构蛋白VP2为对象,将EMCVBJC3株VP2基因定向插入穿梭质粒中,构建重组腺病毒AdV—VP2,免疫BALB／c小鼠制备单克隆抗体,利用Pepscan技术对单抗识别的抗原位点进行分析。结果显示,间接ELISA及间接免疫荧光法筛选获得了2个阳性细胞克隆株,命名为C11和G8。经检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1：1600,腹水效价分别为1：2．56×106和1：1.28×106,中和试验鉴定均无中和活性。Western—blot鉴定表明获得的2株单抗均能识别原核表达的重组VP2蛋白。亚类鉴定结果显示2株单抗均为IgG2b亚类,轻链均为κ型。Pepscan分析结果显示,这2株单抗可分别识别EMCVVP2蛋白上的2个B细胞线性表位。本研究获得的蛋白十分接近于其天然构象,很大程度上保证了病毒表面抗原位点的结构和功能。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因串联表达载体的构建

为了构建Ⅰ型鸭肝炎病毒双拷贝VP1基因的原核表达质粒,试验采用RT - PCR技术扩增鸭肝炎病毒VP1基因,将其连接到克隆载体pGEM -T Easy中得到重组克隆质粒pGEM -T - VP1,阳性克隆质粒经鉴定正确后,分别用BamH Ⅰ、Xhol Ⅰ、BglⅡ进行酶切,重组后得到pGEM -T - 2VP1,然后将...     

血清3型鸭甲型肝炎病毒阳性血清的制备

通过使用血清3型鸭甲型肝炎疫苗免疫SPF鸡,制备了一批血清3型鸭甲型肝炎诊断用阳性血清,并对其进行了无菌、支原体和特异性检验以及中和效价测定。结果表明,该血清无菌检验合格,无支原体污染,特异性良好,无禽类常见13种外源病毒抗体,血清中和效价为10-2.8。本研究为鸭甲型肝炎病毒血清学鉴定及相关研究提供了重要的物质基础。     

1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的抗血清中和活性分析及B细胞表位鉴定

旨在探究1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)VP3蛋白抗血清的中和活性并鉴定VP3的线性B细胞表位。利用pGEX-4T-1表达载体,在BL21(DE3)宿主菌中原核表达DHAV-1 VP3基因,以切胶纯化出的蛋白质为抗原免疫兔制备多克隆抗体,通过鸡胚中和试验对多抗的中和效价进行检测;采用KarplusSchulz、Emini、Jameson-Wolf和Parker方法分别对柔韧性、表面可及性、抗原性及亲水性进行分析,得到了4条候选线性B细胞表位,以制备的兔抗VP3多克隆抗体为一抗,通过间接ELISA方法对人工合成的B细胞表位进行鉴定,并进一步用临床鸭血清样品对鉴定的B细胞表位的抗体检测能力进行评估。结果显示,VP3在BL21(DE3)中以包涵体形式表达,大小约54ku,Western blot分析表明重组蛋白质具有较好的反应原性。制备的兔抗VP3多克隆抗体的琼扩效价达到1∶16,并能中和DHAV-1,中和效价为1∶39;利用间接ELISA鉴定出GKRKPCRRPIHKPKNPPQEP(1—20aa)、FNTGRYQMSWYPIADGEQSL(131—150aa)和VNSSAPSNID(200—209aa)为VP3的B细胞表位,抗体检测能力试验结果显示表位肽可检测临床DHAV-1鸭血清。本研究表明DHAV-1VP3的抗血清具备一定的中和活性,1—20aa、131—150aa和200—209aa为VP3的B细胞表位且具有临床应用前景。     

鸭肝炎病毒Ⅰ型、新型二价精制卵黄抗体在SPF雏鸭体内的代谢规律研究

采用实验室试制的二价抗体接种5日龄SPF雏鸭,分别在注射抗体后24、48、72、96、120、144和168 h进行采血及分离血清。采用鸭胚中和试验,进行Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒抗体效价的测定。结果表明,抗体注射24~72 h,血清中Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒抗体效价基本稳定在峰值,从96 h开始缓慢下降但仍在保护效价(1:32)以上,至144 h抗体下降至保护效价以下,即抗体的被动保护期在5 d以内。     

IBDV血清Ⅱ型VP5蛋白原核表达及型特异性单克隆抗体的制备

本实验构建表达了传染性法氏囊病病毒(IBDV)血清Ⅱ型23/82株VP5蛋白,并制备出能够区分不同血清型IBDV的单克隆抗体(mAb).利用EcoR I和Xho I双酶切pUC57-23/82VP5质粒,获得23/82株IBDV VP5基因片段,连接到同样处理的原核表达质粒pET-28a,经酶切鉴定获得重组质粒pET-23/82VP5,转化到宿主茵BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白,SDS-PAGE分析表明该融合蛋白分子量大小约为23 ku.Ni-NTA柱纯化重组蛋白,复性后免疫8周龄BALB/c小鼠,3次免疫后,常规方法进行细胞融合,获得1株阳性杂交瘤细胞株(5D3),IFA和western blot分析表明该细胞株分泌的mAb仅与血清II型IBDV 23/82株VP5反应,不与血清I型IBDV Gt株VP5反应.腹水抗体间接ELISA效价为1×104.该mAb的制备为研究血清II型IBDV的VP5的功能和标记疫苗的研制奠定了基础.