编码日本血吸虫CIAPIN1 cDNA的克隆及其重组蛋白的原核表达

本研究利用生物信息学并结合分子生物学实验对日本血吸虫细胞因子诱导凋亡因子CIAPIN1（cytokine induced apoptosis inhibitor 1）基因进行了初步研究。研究表明日本血吸虫存在CIAPIN1同源基因,将其命名为SjCIAPIN1,SjCIAPIN1基因已知cDNA长1143 bp,包括完整的CDS,编码276个氨基酸,预测分子量为30.55863 kDa。通过原核表达系统对该蛋白进行了重组表达和纯化,并制备了多克隆抗体制备。Western blot分析表明,本研究制备的多克隆抗体能与SjCIAPIN1重组蛋白特异识别。     

日本血吸虫GSK3蛋白编码cDNA的克隆、表达及其重组蛋白的免疫保护研究

本研究利用生物信息学分析了日本血吸虫(Schistosoma japonicum,sj)Glycogen synthase kinase 3(GSK3)蛋白,并对其中一个GSK3蛋白的编码cDNA进行了克隆和原核表达,制备了特异性的多克隆抗体.同时,还初步评估了重组蛋白的免疫保护效果.生物信息学分析表明在日本血吸虫数据库存在两种GSK3蛋白,且其中一个SjGSK3在日本血吸虫不同发育时期均有转录.Western blot结果表明本研究制备的抗体能特异性识别日本血吸虫SjGSK3重组蛋白,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性.动物实验表明免疫SjGSK3重组蛋白的动物与佐剂对照组比较分别获得了平均10.6％减虫率和40.5％肝脏减卵率.     

日本血吸虫PDIA3的原核表达和多抗血清制备

为获得日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)PDIA3(Sj PDIA3)重组蛋白,并制备多克隆抗体血清,本研究以日本血吸虫c DNA文库为模版,利用PCR技术扩增得到PDIA3 ORF全长,并克隆到p ET28a(+)载体中,将得到的重组质粒p ET28aSj PDIA3转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后His-Ni柱亲和层析纯化得到Sj PDIA3重组蛋白,利用重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,Western blot分析重组蛋白的免疫原性。扩增得到长为1482 bp日本血吸虫PDIA3的ORF序列,该序列编码493个氨基酸,含两个硫氧还原蛋白结构域和一段信号肽,无扩膜结构。在原核表达系统中表达得到大小为55 k Da的Sj PDIA3重组蛋白,分析显示其具有良好的抗原性。     

编码日本血吸虫Akt蛋白的cDNA克隆及原核表达

本研究利用生物信息学分析日本血吸虫编码Akt蛋白的cDNA并对编码该蛋白的cDNA进行了克隆和原核表达。生物信息学分析表明日本血吸虫存在两个Akt蛋白。利用PCR将其中一个Akt蛋白催化功能域的编码cDNA进行了克隆,并利用原核表达系统对此蛋白片段进行诱导表达并进行了重组蛋白的纯化,将重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。Western blot分析表明,该抗体能被日本血吸虫Akt重组蛋白特异性识别。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

日本血吸虫精氨酸酶的克隆表达及酶活性分析

为解析日本血吸虫精氨酸酶的功能,本研究克隆了SjARG基因、长度为1095 bp,并将该基因克隆一到原核表达载体pET-28a,获得重组质粒pET-28a-SjARG,并在大肠杆菌中成功表达,Western blot显示重组蛋白具有良好的抗原性;通过酶活性分析显示,重组蛋白SjARG在添加Mn2+后活性得到提高,酶活性大小为502 U/mg,Km值为82.7mM。该研究结果为进一步深入研究该基因的表达特性、酶学性质以及候选疫苗分子研究方面提供了基础。     

日本血吸虫基因差异表达研究进展

随着EST技术的建立和日本血吸虫基因组计划的启动,GenBank中日本血吸虫基因序列数据迅速增长,对日本血吸虫不同发育阶段基因克隆和表达分析已基本完成.迄今为止,GenBank中登录的日本血吸虫表达序列标签(ESTs)69 000条,但只有极少数ESTs进行了详细研究,越来越多的ESTs有待进一步研究.作者对日本血吸虫各个发育阶段基因组的研究情况进行了综述.     

日本血吸虫重组IAP蛋白的免疫保护效果评估

为研究日本血吸虫凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein of Schistosoma japonicum,SjIAP）重组蛋白诱导BALB/c小鼠的免疫保护效果,利用PCR技术扩增SjIAP基因,构建重组表达质粒pET-28a（＋）-SjIAP,诱导表达重组SjIAP蛋白,并利用重组蛋白制备兔源多克隆抗体血清。然后,选用SjIAP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用ELISA检测免疫小鼠血清中的特异性抗体水平,以及免疫小鼠脾脏淋巴细胞在SjIAP重组蛋白刺激后产生的细胞因子水平。强化免疫后,将小鼠进行血吸虫尾蚴攻虫试验,感染38 d,进行剖杀,计算虫体减虫率及肝脏减卵率。Western blot结果表明本研究制备的兔源多抗血清能特异性识别SjIAP重组蛋白。ELISA检测表明免疫SjIAP重组蛋白可诱导较高水平的IgG及IgG亚型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。动物试验表明,免疫SjIAP重组蛋白的小鼠与PBS组相比分别获得了31.5%的减虫率和37.2%的肝脏减卵率。免疫SjIAP重组蛋白能诱导小鼠获得一定减虫和减卵保护效果,提示血吸虫凋亡蛋白抑制因子可作为抗血吸虫病的疫苗候选分子。     

表达日本血吸虫凋亡抑制因子的重组腺病毒的构建和鉴定

为探讨腺病毒介导的基因操作技术在血吸虫基因功能中的应用,本研究构建了表达日本血吸虫凋亡抑制因子(an inhibitor apoptosis protein of Schistosoma japonicum,SjIAP)的腺病毒,免疫印迹分析表明获得了表达SjIAP的重组病毒,并对重组病毒的滴度进行了测定.本研究为进一步利用腺病毒对血吸虫基因操作相关研究及SjIAP的功能奠定了基础.     

牛支原体重组蛋白P48原核表达、多克隆抗体制备及间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立牛支原体抗体间接ELISA检测方法,为牛支原体灭活疫苗的效力检测提供方法。【方法】构建pET-32a-P48原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)Plyss感受态细胞筛选阳性质粒并进行双酶切验证,用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达,使用镍柱进行蛋白纯化,经SDS-PAGE验证蛋白纯度及分子质量大小,采用Western blotting检测重组P48蛋白特异性和反应原性;将重组P48蛋白免疫家兔制备多克隆抗体。建立牛支原体间接ELISA抗体检测方法并进行条件优化,确定阴阳性临界值。对建立的方法进行敏感性、稳定性、特异性及与平板凝集试验的符合率试验检测。【结果】经SDS-PAGE验证,P48蛋白分子质量大小为62.68 ku,纯度在90%以上;Western blotting检测结果显示,P48蛋白仅与相应抗体结合呈现单一条带,该蛋白特异性和反应原性良好;琼脂扩散方法测得阳性血清效价为1∶64。建立的间接ELISA检测方法条件优化结果为：抗原包被浓度为0.3μg/mL,1%BSA 37℃封闭120 min,待检血清按1∶1 280稀释,37℃孵育60 m...     

日本血吸虫WD40信号蛋白的原核表达

本研究克隆了编码日本血吸虫WD40信号蛋白的cDNA,并分析了WD40在日本血吸虫不同发育时期的转录情况.同时还利用原核表达系统对该蛋白的部分序列进行了表达,并进行了重组蛋白的纯化和多克隆抗体的制备,Western blot分析表明本研究中获得多克隆抗体可与重组表达的蛋白和血吸虫全虫蛋白裂解物具有特异性反应.本试验结果为进一步研究WD40信号分子的功能奠定了初步基础.     

3个日本血吸虫新基因的克隆和分析

为获得新的可表达保护性抗原分子的编码基因 ,以重复感染兔血清为探针 ,筛选日本血吸虫成虫 c DNA文库 ,对获得的阳性克隆进行 PCR鉴定并测序后 ,通过互联网将测序结果进行同源性分析 ,并对新基因的编码阅读框及其编码蛋白质的结构及功能进行预测。 3个日本血吸虫新基因 IR1、IR2、IR3在 Gen Bank的登录号分别为 AY1 70 31 3、AY1 73930、AY2 5 1 4 81。 BL AST分析结果表明 ,它们与 Gen Bank中其他基因无显著的同源性。其中 IR3为全基因 ,含897个碱基 ,编码 2 99个氨基酸 ,推测等电点 ( p I)为 6 .0 9,相对分子质量约为 331 90     

日本血吸虫Sj32KD抗原基因的克隆、表达及诊断应用

目的开展日本血吸虫中国大陆株Sj32KD抗原基因研究,探讨其作为诊断抗原的潜力。方法应用PCR方法克隆Sj32KD抗原基因,并在大肠杆菌系统中进行表达,利用H is亲和层析方法纯化融合蛋白,并应用重组的Sj32KD抗原检测羊日本血吸虫病。结果克隆了ORF为1 272bP的日本血吸虫中国大陆株Sj32KD抗原基因,成功构建表达质粒Sj32-pET28 a,并在BL21(DE3)菌株中获得了分子量为47KD的特异性表达产物。应用Sj32KD重组抗原应用于检测羊日本血吸虫病,结果阴性血清的特异性为85.71%,阳性血清的敏感性为95.45%。结论成功克隆表达了日本血吸虫Sj32KD抗原,原核表达融合蛋白有一定的诊断应用潜力。     

日本血吸虫信号转导蛋白sjwnt10a基因的克隆及其在童虫和成虫中mRNA表达量的变化

利用RACE技术从19日龄的日本血吸虫童虫中扩增了1个Wnt家族基因，并对其进行了生物信息学分析。同源性分析表明，该基因为日本血吸虫新基因，完整开放阅读框（ORF）长1896bp，编码631个氨基酸，理论分子质量为73．3ku。该基因编码的氨基酸序列具有wnt家族蛋白的典型特征，与人、鼠Wnt10a的氨基酸序列同源性均为26％，推测为血吸虫的Wnt10a基因，命名为Sjwnt10a（GenBanK登录号DQ643829）。利用实时荧光定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达情况，结果显示该基因在19日龄的日本血吸虫童虫中表达量最高，在14日龄童虫和44日龄雄虫中也有表达，但分别仅为19日龄童虫表达量的8．8％和5．0％，而在31日龄成虫和44日龄雌虫中没有检测到该基因。结果提示，童虫差异表达的Sjwnt10a基因可能对童虫的生长、发育至关重要。     

日本血吸虫尾蚴分泌蛋白水解酶的初步研究

为了解日本血吸虫尾蚴转化为童虫过程中是否分泌蛋白水解酶，进行了日本血吸虫尾蚴在DSM培液中进行机械转化和尾蚴接种于复盖DSM培液液面的人工小鼠皮上进行自然转化时酶活性测定，测定应用酪蛋白溶液。结果证实日本血吸虫尾蚴转化为童虫过程中和新转化的童虫均能分泌一种蛋白水解酶。根据报道，曼氏血吸虫的这种酶起到钻透结缔组织的蛋白水解和促使尾蚴转化为童虫时糖萼脱落两个作用，并随之而起到抵抗免疫杀伤功能。说明日本血吸虫尾蚴和童虫，与曼氏血吸虫一样有这方面的功能。     

日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆和分析

为筛选新的有潜在保护性的抗原分子编码基因，采用重复感染兔血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，将阳性克隆的插入序列进行了PCR扩增和序列分析。结果发现，所筛选的阳性克隆中有2个为日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(SPI)。序列分析表明，它可编码分子质量为4．6ku，等电点为5．76的蛋白，与GenBank中日本血吸虫SPI基因(大陆株)、曼氏血吸虫SPI基因和埃及血吸虫SPI基因编码的氨基酸序列的同源性分别为98％、62％和62％。TMpred分析表明，该蛋白具有2个明显的跨膜区即36～55和356～372位氨基酸。     

重组日本血吸虫抱雌沟蛋白诱导的免疫机制研究

应用大肠杆菌表达日本血吸虫抱雌沟蛋白（Schistosoma japonicum gynecophoral canal protein, SjGCP）。将重组蛋白rSjGCP与FCA、ISA206、ISA70M三种佐剂混合后免疫BALB／c小鼠,分析重组抗原诱导的免疫保护机制。用流式细胞术检测三次免疫后小鼠体内CD4＋、CD8＋T淋巴细胞亚群和IL-2、IL-4、γ—IFN、IL-10等细胞因子,应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗SjGCP特异性1gG抗体及其亚型lgG1水平。和空白对照组相比,GCP—FCA组和GCP-206组小鼠脾细胞中CD8＋T淋巴细胞比例显著下降,而GCP-70M组的CD4＋T淋巴细胞显著下降;GCP—FCA组、GCP-206组中IL-4、IL-10表达水平均显著上升;GCP—FCA组、GCP-206组、GCP-70M组血清中特异性IgG1亚型抗体含量显著升高。本研究为探讨重组日本血吸虫抱雌沟蛋白诱导的免疫保护机制积累了有价值的数据。     

日本血吸虫重组抗原Sj GST Paramyosin和Sj23对绵羊的保护性免疫…

１９９４￣１９９５年１９９７年应用日本血吸虫３类候选疫苗分别免疫绵羊，各组的减虫率、粪便虫卵减少率和组织（肝、大肠、小肠）的虫卵减少率分别是：虫体副肌球蛋白组１７．４％￣５５．３％，１４．６％￣６８．１％和４８．９％￣７６．７％；重组副肌球蛋白组４１．４％￣４４．２％，１５．９％￣２５．１％和４１．１％￣４８．０％；Ｓｊ２６谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴ）组５３．４％￣６２．１％，１１．０％￣３８．６％     

应用重组日本血吸虫组织蛋白酶L诊断日本血吸虫病的研究

在大肠杆菌BL21中表达日本血吸虫组织蛋白酶L基因，经镍离子亲和层析柱纯化得到重组日本血吸虫组织蛋白酶L；以间接ELISA法，检测血吸虫病因牛血清104份，阳性检出率为67．31％；以血吸虫感染小鼠、兔、绵羊血清做阻断试验，得到的OD值与阴性血清相当。结果表明，以重组日本血吸虫组织蛋白酶L作为诊断抗原检测日本血吸虫病牛感染情况，有一定的应用前景。