CpG寡核苷酸对IBDV VP2基因真核表达质粒免疫增效作用

以传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白基因表达质粒DNA为免疫原，以CpG的寡核苷酸(CpG-0DN)为免疫佐剂，肌肉注射于14日龄SPF鸡，1周后加强免疫1次，2次免疫后15d和21d分别测定血清ELISA抗体效价，并于免疫后21d用IBDV99儿强毒株攻毒和进行病理学观察。结果显示，(1)VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组的ELISA抗体水平明显高于VP2重组质粒免疫组；(2)IBD弱毒苗与VP2重组质粒免疫组抗体水平明显高于VP2重组质粒免疫组，且比VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组略高；(3)VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组及IBD弱毒苗与VP2重组质粒免疫组可明显降低IBDV强毒攻击后引起的急性发病率和死亡率。由此表明，CpG寡核苷酸对IBDV VP2蛋白基因真核表达质粒免疫具有明显增强作用，有很大的应用前景。     

传染性法氏囊病病毒的病毒样颗粒制备及免疫原性分析

为了研究传染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒样颗粒(VLP)的免疫原性,通过RT-PCR扩增其VP2基因,克隆到pSYno-1原核表达载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行表达。通过烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus, TEV)蛋白酶酶切后制备VLP并进行免疫原性分析。结果显示:His-MBP标签能够促进VP2蛋白的可溶性表达,其可溶性表达水平约为50%;透射电镜观察发现TEV蛋白酶切开的VP2能形成25 nm左右的VLP;动物试验结果发现VLP免疫能诱导产生较高的抗体水平,并能保护免疫鸡抵抗IBDV强毒攻击,其中免疫组脾体比显著低于非免疫组(P0.05),免疫组血清和组织中病毒含量极显著低于非免疫组(P0.01),表明VLP具有良好的免疫原性。本研究为IBDV基因工程疫苗的研发提供了参考。     

牛肠道病毒VP2基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

应用RT-PCR方法扩增牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV)VP2基因,构建重组质粒pET32a(+)-VP2。转化大肠杆菌菌株BL21,IPTG诱导其表达VP2融合蛋白,Western-blot检测目的蛋白。将纯化的重组蛋白(pET32a(+)-VP2)免疫新西兰大白兔,制备VP2多克隆抗体,iELISA方法检测抗体效价,同时利用血清中和试验评估其诱导中和抗体的能力。SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白的相对分子质量为50 000,与预期值大小相符;iELISA检测其抗体效价为1∶25 600;血清中和试验表明,原核表达的VP2蛋白诱导产生的中和抗体效价为1∶107.4。结果表明,成功克隆和表达了具有免疫原性的VP2蛋白,其可诱导产生较高效价的多克隆抗体,为BEV血清学诊断方法的建立及亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒HB株VP2蛋白的表达及免疫原性测定

为了研究传染性法氏囊病病毒河北分离株(HB株)VP2蛋白的免疫原性,对VP2基因进行了表达及免疫原性测定。将传染性法氏囊病病毒HB株VP2基因亚克隆到原核表达载体pET-32a-c(+)中并对其进行了诱导表达。SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白约55ku,以包涵体形式存在。重组蛋白纯化后,免疫接种6周龄Balb/c小鼠,制备的血清ELISA效价在1∶6 400以上,说明所表达的HB株VP2蛋白免疫原性良好。     

猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株E2蛋白的表达及抗体制备

表达去除SD0803E2基因跨膜疏水区的sE2蛋白并制备其抗体,为猪源BVDV诊断奠定基础。RT-PCR扩增SD0803株sE2基因,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-sE2,转化BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。采用间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光等方法鉴定获得的抗体。结果显示,抗体效价最高可达1∶256 000;制备的抗体可与rsE2蛋白特异性结合;该抗体可特异性识别BVDV感染MDBK细胞表达的E2蛋白,显示抗体高度的特异性。成功构建pGEX-4T-1-sE2原核表达质粒,诱导其表达的蛋白免疫家兔,成功制备的猪源BVDV SD0803株E2抗体。     

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒洛阳分离株VPP2基因的原核表达及鉴定

根据GenBank公布的鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列,设计合成1对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vv IBDV)洛阳分离株LY1的VP2基因并进行克隆,构建重组质粒p MD18-T-VP2,然后连接至原核表达载体p ET32a,将阳性质粒转化至感受态细胞Rosetta中进行诱导表达。SDS-PAGE结果显示VP2基因在大肠杆菌Rosetta细胞中实现融合表达,蛋白大小约66 ku,且主要存在于细胞上清中,Western blot试验证实表达的VP2蛋白具有较好的反应原性。研究结果可为IBDV的诊断抗原及基因工程疫苗研究奠定基础。     

传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆与原核表达

根据GenBank已登录的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5基因序列,设计合成了一对VP5基因特异性引物,应用RT-PCR技术从IBDV标准毒株中扩增得到VP5基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-1-VP5,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,IBDV VP5基因在大肠埃希菌BL21中得到了正确表达,所表达的融合蛋白与IBDV阳性血清具有特异性抗原抗体反应。     

IBDV血清Ⅱ型VP5蛋白原核表达及型特异性单克隆抗体的制备

本实验构建表达了传染性法氏囊病病毒(IBDV)血清Ⅱ型23/82株VP5蛋白,并制备出能够区分不同血清型IBDV的单克隆抗体(mAb).利用EcoR I和Xho I双酶切pUC57-23/82VP5质粒,获得23/82株IBDV VP5基因片段,连接到同样处理的原核表达质粒pET-28a,经酶切鉴定获得重组质粒pET-23/82VP5,转化到宿主茵BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白,SDS-PAGE分析表明该融合蛋白分子量大小约为23 ku.Ni-NTA柱纯化重组蛋白,复性后免疫8周龄BALB/c小鼠,3次免疫后,常规方法进行细胞融合,获得1株阳性杂交瘤细胞株(5D3),IFA和western blot分析表明该细胞株分泌的mAb仅与血清II型IBDV 23/82株VP5反应,不与血清I型IBDV Gt株VP5反应.腹水抗体间接ELISA效价为1×104.该mAb的制备为研究血清II型IBDV的VP5的功能和标记疫苗的研制奠定了基础.     

IBDV地方野毒株不同毒源二价灭活油乳苗免疫效果的比较研究

对利用IBDV地方野毒株所制备的囊毒和胚毒二价灭活油乳苗免疫效果进行了比较研究。结果表明,所制备的囊毒灭活苗免疫效果显著优于胚毒灭活苗和活疫苗,在接种后各个时期所产生的抗体效价均显著高于其它两种疫苗(P<0.01),最高AGP效价可达4.8log2;胚苗的免疫效果虽然差于囊苗,但明显优于活疫苗,当活苗免疫组鸡血清中已无可测性抗体时,胚苗组仍具有1.0log2的AGP效价。在攻毒试验中,囊苗组鸡对IBDV标准毒、两株野毒株的攻击均100%地获得了保护;胚苗组也均可获得80%的保护,这两种由地方毒株所制备的疫苗均未呈现出对不同毒株抵抗性的不同,而活苗组对不同毒株的攻击则分别只有53.3%、40%和46.7%的保护率,呈现出一定的差异性。     

利用杆状病毒表达系统表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白

从GenBank下载传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列,根据昆虫细胞偏爱密码子对IBDV VP2基因进行密码子优化,化学合成优化后的VP2基因序列,然后构建杆状病毒表达载体pTri Ex-4-VP2,构建成功的重组杆状病毒pTri Ex-4-VP2转染sf9细胞,制备病毒原种,采用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定VP2的免疫原性。结果显示:细胞感染Bac-VP2后,其细胞裂解蛋白在58 ku附近有1个条带,且该条带与IBD阳性血清发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示VP2基因能在Sf9细胞中表达;动物攻毒保护试验中,2次免疫重组VP2蛋白后能诱导14日龄SPF鸡产生对IBDV强毒攻击,保护率为60%。本研究为进一步研究IBDV VP2基因工程疫苗提供了物质基础。     

Asia 1型口蹄疫病毒VP1基因的表达鉴定及其多抗制备

本研究旨在表达口蹄疫病毒(FMDV)的VP1全基因并制备特异性的多克隆抗体。利用PCR方法扩增Asia 1 IND 49197株VP1全基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为31.6ku,以包涵体的形式存在。通过Ni-NTA Purification System纯化后进行western blot和间接ELISA分析,结果显示重组蛋白能够被FMD阳性血清识别,具有良好的反应性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶20480,病毒中和试验测定抗体效价为1∶64。本研究所表达的VP1蛋白可用于开发检测Asia1口蹄疫抗体的诊断试剂,所制备的多克隆抗体为进一步研究VP1的结构、功能以及抗原表位的鉴定提供了条件。     

猪肺炎支原体168弱毒株P65基因的原核表达及鉴定

研究猪肺炎支原体168(Mycoplasma hyopneumoniae 168,Mhp168)弱毒株重组蛋白p65的免疫原性。根据GenBank中Mhp168弱毒株P65基因的开放阅读框设计特异性引物,进行PCR扩增,构建原核表达载体pET-28a-P65,经原核表达并纯化获得的重组蛋白与佐剂以体积比1∶1乳化后免疫注射小鼠,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定小鼠血清的抗体效价;选取抗体效价较高的小鼠进行攻毒试验。经间接ELISA证明,重组蛋白p65具有良好的免疫原性,血清效价为1∶12 800。攻毒试验证明,p65重组蛋白疫苗的保护率可达80%,证明重组蛋白p65具有良好的免疫原性。     

犬Ⅰ型腺病毒结构蛋白Knob的可溶性表达及免疫原性研究

为了探究犬Ⅰ型腺病毒(Canine adenovirus type 1, CAdV-1)F1301株结构蛋白Knob的免疫原性,试验采用原核表达技术将Knob蛋白基因克隆到pColdⅡ原核表达载体中进行低温诱导,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中实现可溶性表达。利用纯化后的重组蛋白Knob免疫Balb/c小鼠,监测免疫后小鼠血清中重组蛋白Knob特异性抗体ELISA效价、病毒中和抗体效价,测定脾脏T淋巴细胞增殖活性,研究重组蛋白Knob的免疫原性。结果表明:表达的重组蛋白Knob为可溶性蛋白,分子质量约为20 ku。第2次免疫后7,14天,试验组小鼠血清ELISA抗体效价分别为1∶6 400和1∶3 200,中和抗体效价分别为1∶118和1∶96。第2次免疫后7天,试验组小鼠T淋巴细胞增殖指数为1.322,显著高于对照组(P0.05)。说明试验成功表达出CAdV-1重组蛋白Knob,所表达的重组蛋白Knob具有良好的免疫原性且存在CAdV-1的中和抗原表位。     

新城疫病毒F基因在大肠杆菌中的高效表达及其免疫原性分析

应用PCR技术,以含有新城疫病毒F48E8株全长融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pVAX1-F为模板,扩增出594bp大小的F基因的部分片段.经克隆筛选和测序后,构建成重组原核表达质粒pGEX-6P-1-F.重组质粒转化表达菌BL21,获得重组菌BL21(pGEX-6P-1-F).经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,F基因在原核表达体系中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的23%.Western blotting结果显示,在相对分子质量46 ku位置有特异性条带.动物实验结果表明,F蛋白免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体效价显著高于空白对照组(P＜0.05),说明原核表达系统表达的F蛋白具有良好的免疫原性.     

鸡传染性法氏囊病病毒VP5的原核表达、多抗制备及初步应用

传染性法氏囊病（infectious bursal disease virus,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）引起的一种主要危害雏鸡的急性传染病。在IBDV编码的5个蛋白中,VP5是IBDV唯一可以缺失基因的蛋白。本研究克隆了IBDV优势流行毒株的VP5蛋白编码基因,利用原核表达系统表达了VP5蛋白,通过免疫BALB/c小鼠制备VP5多抗,并对多抗进行了鉴定和检测不同IBDV毒株的应用。结果显示,IBDV优势流行毒株的VP5蛋白实现了可溶性表达,分子质量约为17 kDa;制备的VP5多抗特异性良好,ELISA效价可达1:64 000;VP5多抗可通过IFA和Western Blot检测识别IBDV rHLJ0504-HT株,不识别VP5基因缺失株。结果表明：试验成功表达了IBDV优势流行毒株的VP5蛋白,并制备了VP5多抗;VP5多抗可对IBDV及其VP5编码基因缺失毒株进行鉴别检测。本研究对于IBDV检测方法的建立以及VP5编码基因功能的进一步研究提供了物质基础。     

鸡Akirin2和GM-CSF促进传染性法氏囊病病毒VP2基因DNA疫苗免疫效果的研究

为提高鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因DNA疫苗的免疫效力,将IBDV VP2、鸡Akirin2和鸡GM-CSF三基因编码区串联后克隆到真核表达载体pTriEx-4上,用构建的pT-VP2-Akirin2-GM-CSF重组质粒体外转染293T细胞,然后提取表达产物进行SDS-PAGE分析。结果在58、35、22ku附近各有一蛋白条带。用pT-VP2-Akirin2-GM-CSF免疫SPF鸡,加强免疫2周后,攻IBDV BC6-85强毒,4d后统计保护率。结果发现,注射14d后,pT-VP2-Akirin2-GM-CSF质粒免疫组血清中能检测到特异性IBDV抗体和IBDV中和抗体,第28天,该组鸡的抗体滴度极显著高于空白对照组(P0.01),该组鸡外周血淋巴细胞增殖能力也极显著高于空白对照组(P0.01)。说明VP2-Akirin2-GM-CSF三基因串联DNA疫苗有很好的应用前景。     

猪细小病毒VP2的原核表达与多克隆抗体制备

克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740bp,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化,接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后,采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740bp的VP2基因片段;构建原核表达载体pET-32a-VP2,经37℃,IPTG浓度1.0mmol/L诱导表达4h可得分子质量大小约为82ku目的蛋白;间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800;Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体,获得了VP2蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。     

鸡传染性贫血病毒VP2基因的原核表达及兔抗血清的制备

为了用大肠杆菌原核表达系统表达鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP2基因片段,并制备其兔抗血清,试验以CIAV M9905株基因组DNA为模板,通过PCR扩增VP2基因,与p ET28a(+)载体连接后转化DH5α获得阳性重组子,将其转化E.coli BL21(DE3)菌,IPTG诱导表达出His-VP2重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后免疫新西兰白兔制备兔抗血清,采用IFA和Western-blot检测该血清的特异性,ELISA测定其效价。结果表明:重组His-VP2融合蛋白的分子质量约为36 ku,以包涵体形式存在。制备的兔抗VP2血清效价在1∶6 400以上,可特异性结合真核表达的VP2蛋白,表明其反应原性较好。说明试验成功表达VP2蛋白,并制备出兔抗血清,可用于该蛋白与病毒其他蛋白之间的相互作用的进一步研究。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析

从辽宁省某鸡场分离到一株传染性法氏囊病病毒(IBDV)。以该毒株基因组核酸为模板,应用RT-PCR扩增得到VP2基因,构建表达质粒pET28a-VP2,再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析在48ku处出现特异性蛋白条带;经Western blot分析VP2蛋白可以与IBDV阳性血清发生特异性反应。用VP2蛋白制备的油乳剂疫苗免疫接种SPF鸡,2周后体内可以检测到特异性抗体。证明VP2蛋白具有重要的应用价值,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白VP2、VP1和VP2-VP1串联基因的原核表达及其初步应用

为获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)特异性抗体检测用抗原VP2、VP1及VP2-VP1蛋白,分别设计引物扩增IBDV野毒株NN1172的VP2和VP1基因,并扩增VP2和VP1基因中抗原性和亲水性较好的重要区域,通过PCR扩增基因串联方法对截短的VP2和截短的VP1基因进行串联,首次获得VP2-VP1串联基因,并对VP2、VP1和VP2-VP1串联基因进行了原核表达和鉴定。结果成功构建了原核表达载体pET-VP2、pET-VP1和pET-VP2-VP1;诱导表达条件显示,3个重组质粒分别转入BL21菌株后经0.05 mmol/L IPTG诱导表达,分别得到分子量为69、114和63 kDa的VP2、VP1和VP2-VP1重组蛋白,且均以包涵体形式表达,3个重组蛋白分别于诱导后5、3和6 h时表达量最多。Western blot结果显示,表达的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白与鸡抗IBDV阳性血清均具有良好的反应原性。以纯化的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白作为包被抗原对传染性支气管炎病毒(IBV)、呼肠孤病毒(ReoV)、禽白血病病毒(ALV)和新城疫病毒(NDV)4种阳性血清检测均为阴性,表明所获得的纯化蛋白具有高度的特异性;对免疫了IBD灭活疫苗,IBD基因工程疫苗和IBD弱毒疫苗的商业鸡群进行抗体检测,结果均能显示疫苗免疫后机体抗体水平的变化趋势。本研究表明利用该原核表达系统所表达的3个蛋白均具有良好的免疫反应活性,为IBDV特异性抗体的检测和新型亚单位疫苗的研发奠定基础。