木尔坦棉花曲叶病毒RPA快速检测方法的建立

木尔坦棉花曲叶病毒Cotton leaf curl Multan virus(CLCuMuV)引起的病害是世界棉花生产上的毁灭性灾害,也是我国进境植物检疫性有害生物之一。因此,建立快速检测技术对CLCuMuV的检疫和防控具有重要意义。本研究根据CLCuMuV外壳蛋白(CP)基因序列设计引物,建立了该病毒的重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)检测方法,并评价了该方法的灵敏度和特异性,进一步测定了对田间疑似病样的检测准确性。结果表明,建立的RPA检测方法仅能从感染CLCuMuV的样品中扩增出目的条带,而感染同属的其他5种病毒的样品中未扩增出目的条带。该方法检测灵敏度是常规PCR的10倍,且对田间疑似病样的检出结果与PCR试验结果一致。因此,本研究所建立的CLCuMuV RPA快速检测方法具有特异、灵敏、准确、操作简便、无需特殊设备等优点,这些为CLCuMuV的快速检测提供了一种新技术。     

梨褪绿叶斑伴随病毒的RT-PCR和巢式RT-PCR检测技术建立

 梨褪绿叶斑伴随病毒(Pear chlorotic leaf spot-associated virus,PCLSaV)是新近发现的为害梨树的欧洲花楸环斑病毒属(Emaravirus)病毒,该病毒基因组由5条负义单链RNA组成。本研究比较分析了反转录引物pd(N)6、3C和5H及基于该病毒基因组RNA3和RNA5链序列设计的4对引物用于RT-PCR检测梨样品中PCLSaV的效果,结果显示,采用与该病毒基因组RNA链3′末端互补的引物3C用于cDNA合成及基于该病毒RNA5链序列的引物5-F/R用于PCR扩增时,检测PCLSaV的灵敏度相较采用引物pd(N)6和5H合成cDNA为模板时高10~100倍;不同部位和不同发病状况的梨树组织中PCLSaV检测结果差异明显。进一步建立了具有高灵敏度的巢式RT-PCR技术,采用外侧引物5-F/R和内巢引物5-IF/IR结合可用于梨不同组织样品中PCLSaV的检测。本研究为系统分析PCLSaV在我国栽培梨树上的危害状况及无病毒梨种质培育奠定了技术基础。     

河北省番茄黄化曲叶病毒病的分子鉴定初报

双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的植物单链病毒,目前双生病毒病害已在多个国家和地区的作物上造成严重危害。近年来,我国多省报道作物上有这类病毒的发生,且有逐年加重和扩散的趋势。根据危害番茄的双生病毒DNA A序列保守区设计简并引物,对2009年4月采自河北省魏县表现叶片黄化、曲叶症状的4个番茄样品进行PCR检测,均为双生病毒阳性,对样品的扩增片断进行了克隆测序,经序列比对分析,与番茄黄化曲叶病毒（Tomato leaf curl virus,TYLCV）山东分离物（FJ646611.1）序列相似性为99.25%~99.55%,说明河北番茄黄化曲叶病由TYLCV引起。     

侵染广东甘薯的甘薯曲叶病毒分子检测与鉴定

甘薯曲叶病是广东甘薯的一种新病害,病株表现为叶片皱缩,向上卷曲,叶脉肿大等症状.PCR检测结果显示,所有病样中均存在菜豆金色花叶病毒属病毒.通过滚环扩增方法获得了3个病毒分离物的全基因组.扩增产物克隆及序列分析结果表明,这3个病毒分离物基因组均仅含有DNA-A,具有菜豆金色花叶病毒属单组分病毒基因组典型特征;其大小分别为2 829 nt (JX286653、JX286654)和2 828 nt(JX286655).三者核苷酸序列同源率为96.0％～98.4％;与已报道的甘薯曲叶病毒19个分离物的同源率均大于89.0％.因此,引起广东甘薯曲叶病的病原被鉴定为甘薯曲叶病毒.本研究是首次在广东发现甘薯曲叶病毒.     

猕猴桃植株中柑橘叶斑驳病毒实时荧光定量PCR检测技术的建立及应用

 柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus, CLBV)在陕西省栽培猕猴桃中发生普遍。为监测CLBV发生情况,本研究建立了CLBV的实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测方法。该方法特异性强,可准确检测目的病毒,标准曲线斜率为-3.378,决定系数R²=0.997 9,扩增效率为97.7%,比普通RT-PCR灵敏度高100倍,可用于猕猴桃植株CLBV的批量检测或低丰度病毒样本(如猕猴桃休眠枝条)的检测。为苗木携带CLBV病毒的早期诊断、果园病毒病预测预报和防控奠定了基础。     

番茄黄化曲叶病毒与番茄褪绿病毒复合侵染对番茄黄化曲叶病毒传播的影响

番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)是一种由烟粉虱传播的单链环状DNA病毒, 在田间可与多种病毒发生复合侵染, 如番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)等?本文对比了TYLCV单独侵染和TYLCV与ToCV复合侵染对烟粉虱获取和传播TYLCV的影响?结果表明, 与取食TYLCV单独侵染的番茄相比, 取食复合侵染番茄的烟粉虱对TYLCV的传毒率显著提高, 且番茄植株和烟粉虱体内TYLCV的病毒积累量也显著提高?试验结果说明复合侵染会提高烟粉虱的传毒率, 促进TYLCV的发生与流行?     

来源于猕猴桃的柑橘叶斑驳病毒的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)为柑橘病毒属(Citrivirus)代表种。本研究采用RT-PCR技术从我国栽培猕猴桃上首次检测到CLBV,总检出率为13.3%。测定了5个CLBV分离物的外壳蛋白基因(coat protein gene,cp)序列,全长均为1 092核苷酸(nt),分离物间cp基因核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为83.2%~99.7%和91.9%~98.9%,这些分离物与新西兰报道的CLBV猕猴桃分离物M3-A核苷酸序列相似性仅为83%左右,与来源于柑橘及近缘种的CLBV分离物cp基因核苷酸序列相似性为84%~86%。在基于该病毒cp基因核苷酸序列的系统进化树中,本研究所测定的CLBV猕猴桃分离物与新西兰报道的除M3-A外的猕猴桃分离物聚在同一组群。研究结果为进一步明确CLBV在我国猕猴桃上的侵染和危害特点及建立该病毒的分子检测技术提供了重要信息。     

甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因克隆及其实时荧光RT-PCR检测

 甘蔗黄叶病毒（Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV）引起的甘蔗黄叶病是一种新的全球性病毒病害。本文以YLSCPF1和YLSCPR591为引物,采用RT-PCR方法克隆了甘蔗黄叶病毒福建分离物（CHN-FJ1）外壳蛋白（CP）基因,编码196个氨基酸。分析不同地理来源的SCYLV病毒分离物cp基因核苷酸及其推导编码的氨基酸序列,同源性达95%以上。根据cp基因的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,建立了SCYLV的TaqMan实时荧光RT-PCR方法。结果表明,检测下限为初始质粒模板DNA 1 000拷贝/μL（约3.61 fg/μL）,比常规PCR方法的灵敏度提高100倍。检测甘蔗花叶病毒、宿根矮化病菌和黑穗病菌,没有典型的扩增曲线和无Ct值。应用实时荧光RT-PCR、常规RT-PCR和组织印迹免疫杂交（TBIA）对田间甘蔗叶片样品进行检测,阳性检出率分别为100%、61.5%和69.2%,表明该方法比常规RT-PCR和TBIA具有更高的灵敏度,适合于对SCYLV的检测。     

木尔坦棉花曲叶病毒已对我国棉花生产构成严重威胁

木尔坦棉花曲叶病毒是引起巴基斯坦和印度棉花曲叶病流行的主要病原之一,是由烟粉虱以持久方式传播。近年来,在广东和广西分别发现了严重侵染朱槿和黄秋葵的木尔坦棉花曲叶病毒。虽然广东和广西不种植棉花,但该病毒传播介体烟粉虱在广东、广西及我国棉花产区都有分布。因此该病毒的入侵,对我国棉花生产构成严重威胁。     

侵染假酸浆的泰国番茄黄化曲叶病毒全基因组结构特征

为明确假酸浆Nicandra physalodes叶片黄化、皱缩症状是否由菜豆金色花叶病毒属病毒侵染引起,本研究利用分子检测方法和生物信息学技术鉴定了假酸浆样品中的病毒种类。从采集的病样中克隆并获得了2条菜豆金色花叶病毒属病毒DNA-A全序列和1条beta卫星全序列,经全序列分析发现,该双生病毒的两条DNA-A全序列与泰国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl Thailand virus, TYLCTHV)云南分离物TYLCTHV-YN1732一致性最高,达99.3%,亲缘关系较近;beta卫星的全序列与云南番茄曲叶beta卫星(tomato leaf curl Yunnan betasatellite, TLCYnB)的分离物YN5230一致性最高,达99.3%,亲缘关系较近。重组分析显示,假酸浆上分离的TYLCTHV-YN5735-12是一个重组病毒,有两个重组事件,一个主要发生在AV1的编码区,由中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)和广西大戟曲叶病毒(euphorbia lea...     

番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染对番茄褪绿病毒传播的影响

番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)是一种由烟粉虱Bemisia tabaci传播的正义单链RNA病毒,在田间常与番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV)复合侵染而造成番茄生产上重大的经济损失。为了明确ToCV与TYLCV的复合侵染对烟粉虱传播ToCV所造成的影响,本文采用RT-PCR以及qRT-PCR检测了复合侵染的番茄对烟粉虱获取和传播ToCV的影响。研究表明,烟粉虱取食复合侵染的番茄后对ToCV的传播效率显著提高,仅25头烟粉虱的传毒率即可达到100%,ToCV在烟粉虱以及番茄体内的累积量均显著提高。说明这种复合侵染促进了烟粉虱对ToCV的传播,在田间应当及时防控烟粉虱,警惕病毒与烟粉虱的蔓延。     

河北省番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒复合侵染及分布

 番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) 及番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)是危害番茄的主要病毒。2016~2017年,在河北省18个番茄主产区调查番茄病毒病危害情况,采集262份植株矮化、叶片黄化、褪绿、卷曲的番茄样品,利用分子生物学技术对病原进行鉴定。结果表明:2016~2017年河北省番茄病毒病发生普遍,所检样品中TYLCV的侵染率为68.66%,其中与ToCV复合侵染率为19.5%;除栾城、滦南、乐亭、永年4地样品暂未检测到ToCV外,其他14个采样点的样品均检测到ToCV,侵染率为19.5%,且全部表现为与TYLCV复合侵染,河北省番茄主产区暂未发现ToCV单独侵染的样品。     

浙南菜区番茄曲叶病毒病发生规律

通过两年调查,明确了浙南菜区越冬番茄曲叶病毒病的主要侵染期在9月下旬至10月上旬,即番茄苗龄20~30 d。温州近郊常年蔬菜生产基地,番茄曲叶病毒病的侵染循环主要通过携毒烟粉虱在越冬番茄和早春番茄间传播完成。苍南、瑞安等季节性番茄生产基地,该病的侵染循环主要通过携毒烟粉虱在越冬番茄、大田番茄苗和夏季南瓜等中间寄主传播完成。随着播种期推迟,番茄曲叶病毒病发生轻,目前浙南菜区生产上‘托马雷斯’、‘好韦斯特’、‘合作903’等主栽番茄品种均表现感病。田间调查还表明,通过50目防虫网覆盖育苗栽培可以有效控制番茄曲叶病毒病发生,防控效果达到90%以上。     

番茄黄化曲叶病毒V 2基因原核表达及多克隆抗体制备

 通过PCR的方法,从番茄黄化曲叶病毒江苏分离物DNA中扩增到V2基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果显示其与报道的XH2分离物序列完全一致,核苷酸序列全长351 bp,编码115个氨基酸,推测分子量约13 kD。将该V2基因亚克隆到原核表达载体PET32a中获得重组表达载体PET32a-V2,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG可诱导1个分子量约为32 kDa的融合蛋白（含His标签）表达,经Ni⁺ NTA亲和柱纯化,获得纯化的重组蛋白,免疫家兔制备TYLCV-V2蛋白的多克隆抗体Anti-V2,间接ELISA测定Anti-V2的效价达1∶655 360,Western blot及DIBA分析结果表明Anti-V2可与V2蛋白发生特异血清反应,可为进一步研究V2蛋白的功能提供参考。     

安徽省太和县中国南瓜曲叶病毒自然侵染南瓜的检测分析

中国南瓜曲叶病毒(squash leaf curl China virus, SLCCNV)是一种植物单链DNA病毒, 属于双生病毒科Geminiviridae菜豆金色花叶病毒属Begomovirus?在自然条件下该病毒可以侵染多种葫芦科作物, 如南瓜?甜瓜等?该病毒由烟粉虱进行持久性传播, 是影响瓜类产量和品质的重要病害?2021年4月-5月, 安徽省太和县温室大棚中的南瓜叶片出现斑驳?皱缩?卷曲以及植株矮化等现象, 我们采集了具有典型病毒病症状的南瓜病叶样品以及烟粉虱虫体进行RT-PCR鉴定, 结合测序结果鉴定危害南瓜的病毒为SLCCNV?为了进一步明确安徽太和地区SLCCNV的系统进化特征, 我们测定了SLCCNV的外壳蛋白基因(coat protein, CP)序列并进行系统发育分析, 结果表明安徽太和县所检测到的SLCCNV分离物与中国广东和海南地区的分离物亲缘关系较近, 并且与越南?菲律宾?柬埔寨?泰国等一些国家的分离物处于同一个大分支, 存在较小的地域差异性, 而与印度和孟加拉国地区的分离物亲缘关系相对较远, 处于不同的大分支?本研究是安徽省SLCCNV侵染南瓜的首次报道, 期望为该病害的预警和防控提供理论依据?     

侵染西葫芦的中国南瓜曲叶病毒的检测及序列分析

2019年山东种植的西葫芦上广泛发生病毒病,症状与之前常发症状有差异,发病植株叶片向下卷曲、黄化,植株矮化。为明确引起此次西葫芦病毒病的病原,我们以田间采集的10份西葫芦病叶为材料,进行PCR扩增并测序。测序结果显示扩增片段核苷酸序列与我国广东的中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)南瓜分离物(MW389917.1)一致性最高。根据同源序列设计引物,经PCR扩增获得SLCCNV全长序列,DNA-A 全长为2 730 bp(OM692270.1)、DNA-B 全长为2 711 bp(OM692269.1),经序列比对发现DNA-A序列与已登录的SLCCNV一致性为89.65%~99.42%,其中与我国广东的SLCCNV-GDHY南瓜分离物(MW389917.1)一致性最高,为99.42%;DNA-B序列与已登录的SLCCNV一致性范围为81.82%~97.29%,其中与我国广东的SLCCNV-GDHY南瓜分离物(MW389918.1)一致性最高,为97.29%。因此推测引发山东西葫芦病毒病的病原物是SLCCNV,由于该病毒是在山东西葫芦上首次发现,将其命名为SLCCNV-SD。前人已报道SLCCNV可侵染南瓜、甜瓜、烟草、番茄等作物,但SLCCNV可侵染西葫芦在国内未见报道。     

进境大丽花种子携带大丽花花叶病毒的分子检测

通过生长性试验、症状观察、PCR扩增及序列测定,从一批进境的大丽花种子上发现大丽花花叶病毒(Dahlia mosaic virus,DMV)。序列比对结果表明,发现的DMV分离物与DMV-D10存在较近的亲缘关系。根据已报道引物P3/P4的测序结果,并将其与已有的DMV序列进行比对,设计1对预期扩增片段为750 bp的检测引物P5/P6。实验结果证实,P5/P6的扩增效率优于已报道的引物P1/P2和P3/P4,适用于DMV的分子检测。     

从福建分离的广东赛葵曲叶病毒的分子特征

 从中国福建省表现曲叶和脉突症状的赛葵上分离到病毒分离物FJ1~FJ6。利用菜豆金色花叶病毒属病毒的特异性简并引物PA/PB,在所有6个分离物中都分离到了约500bp长度的病毒部分DNA片段。这些DNA片段与已报道的广东赛葵曲叶病毒(Malvastrum leaf curl Guangdong virus,MLCuGdV)的核苷酸序列同源性高达90%-93%。随机挑选FJ3分离物进行全基因组DNA的克隆测序。结果表明,FJ3 DNA全长2765个核苷酸,具有典型的双生病毒科病毒的基因组结构特征,与MLCuGdV的同源性为92.9%,表明FJ3是MLCuGdV的一个分离物。系统进化分析表明,除了MLCuGdV,FJ3与其它赛葵上分离到的双生病毒的亲缘关系都较远,而与分离自中国南方番木瓜上的双生病毒聚成簇,有较近的亲缘关系。进一步比较分析各蛋白编码的氨基酸序列发现,FJ3可能是一个种间重组分子,它可能是由中国番木瓜曲叶病毒或广东番木瓜曲叶病毒和另外的未知病毒重组产生的。     

Tomato leaf curl geminivirus in Australia: occurrence, detection, sequence diversity and host range

The occurrence of whitefly transmitted geminiviruses in Australia was studied using a mixed DNA probe capable of detecting a range of distinct geminiviruses. The only geminivirus species detected was Tomato leaf curl virus (TLCV), which is spread across a vast geographical region of far-northern coastal Australia, an area inhabited by the Australasian-Oceania biotype of Bemisia tabaci . The newly introduced silverleaf whitefly, B. tabaci biotype B, forms high population densities in the eastern coastal region of Queensland and is currently located approximately 150 km from the nearest known TLCV-infected area. The viral host range appeared to be narrow and of 58 species of crop plants and weeds inoculated using the B biotype, only 11 became infected with the virus, including five that did not show foliar symptoms. A DNA fragment of 694 nt, including the complete C4 open reading frame (ORF), the overlapping N-terminal part of the C1 ORF and the viral iterons involved in replication, was amplified from 11 TLCV field isolates and sequenced. Sequence analysis revealed an overall sequence variation of up to 14% in this region, as well as the presence of distinct viral iterons.