H10亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

根据GenBank中H10亚型AIV的HA基因序列,选取特异性序列,设计了6条LAMP引物,用于H10亚型AIV的检测,优化反应条件,建立了H10亚型AIV RT-LAMP可视化检测方法,对该法进行特异性和敏感性验证。结果显示:该法特异性强,只与H10亚型AIV反应,与其他亚型AIV和常见的禽类疾病无交叉反应;灵敏度高,检测下限为100拷贝/μL模板;仪器简单,只需一个可控温的水浴锅在1h内即可完成全部扩增反应;结果可视化,肉眼直接观察结果。结果表明:本试验建立的H10亚型AIV检测方法简便、快速,尤其适合于养殖场和基层工作站的检测,为该病的诊断和防控提供一种有效的方法。     

口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒二重RT-LAMP鉴别检测方法的建立

LAMP技术是一种快速新型的核酸检测技术,该技术利用4条引物在恒温下扩增目的 DNA,特异性好敏感性高。本试验旨在建立一种能同时鉴别诊断FMDV和VSV的二重RT-LAMP检测方法。根据口蹄疫病毒(FMDV)3D基因和水泡性口炎病毒(VSV)N基因的保守序列,设计了2套特异性引物,在每套引物的内引物中插入酶切位置EcoRⅠ,对反应条件进行了优化,建立了恒温快速的检测方法。结果显示:该方法特异性好,能检测到口蹄疫病毒的A,O,Asia1亚型和水泡性口炎的NJ和IND亚型,并与其他对照牛病原体不发生交叉反应;敏感性高,最低能够检测个100个FMDV病毒RNA和100个VSV病毒RNA;干扰性小,能同时检测两个模板的不同浓度组合。本试验建立的口蹄疫和水泡性口炎二重RT-LAMP方法具有简便、快速、特异、敏感等优点,可用于FMDV和VSV的临床检测和流行病学调查。     

犬流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

为了建立一种便捷、灵敏的犬流感病毒(CIV)检测技术,本研究根据CIV相对保守的M片段设计3对特异性引物,建立CIV的RT-LAMP检测方法,对反应体系中的MgSO4、Betaine、Bst DNA PoLymerase、dNTP、引物浓度等分别进行了优化,并进行敏感性和特异性试验。结果表明:所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用45min即可得到其特有的阶梯状条带,而且对犬细小病毒、犬瘟病毒和犬副流感病毒的扩增结果均为阴性。该方法对CIV RNA的最小检测限为0.1pg,灵敏性高于一步RT-PCR方法。RT-LAMP和普通RT-PCR方法检测临床样品的符合率为93.02%。该方法为犬流感病毒的临床检测提供了一种简便、实用的方法,为基层检疫提供了方便。     

新城疫病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种新城疫病毒(NDV)的简便、快速、高灵敏度的检测方法,本研究根据NDV融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,在恒温水浴中进行核酸扩增反应,对反应温度、反应时间以及反应液中Mg2+浓度进行优化,获得最佳反应条件,结果经凝胶电泳分析并在可见光下直接观察.整个RT-LAMP检测用时0.5 h,检测敏感度比RT-PCR高100倍,对禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒无交叉反应.本研究建立的NDV RT-LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强,操作简单等特点,有望在核酸扩增检测方法中取代RT-PCR技术.     

鸭瘟病毒环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法的建立与应用

为建立一种简便、快速、灵敏、特异的鸭瘟病毒(DPV)检测方法,本研究根据GenBank中登录的DPV基因组序列,设计3对特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,经优化反应体系,建立了LAMP快速检测方法.结果表明,LAMP方法能够在63℃恒温下,1h内实现目的核酸的大量扩增.结果判定时只需要在扩增产物中加入SYBRGreen Ⅰ染料,就可以直接在可见光或紫外光下观察颜色变化.该方法敏感性可达0.245 μg/L,比普通PCR灵敏性高10倍;对鸭病毒性肝炎病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭副黏病毒、鸭源偏肺病毒等的核酸无交叉反应;利用建立的LAMP检测方法对40份临床样品的阳性检出率为30％.该方法简便快捷,省时省力,是一种适用于基层实验室快速、准确检测DPV的方法.     

弓形虫环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立弓形虫的快速检测方法,本研究建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——环介导等温扩增技术(LAMP)。用10倍系列稀释的DNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试,同时通过对扩增产物做内切酶验证;为证明LAMP技术的特异性,对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体进行检测。结果显示:利用LAMP技术成功检测到弓形虫基因区,此方法的灵敏度可达到能检测5个拷贝DNA分子水平,酶切分析结果正确,并且特异性强,对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体检测均为阴性。说明LAMP技术可应用于弓形虫的快速检测。     

水疱性口炎病毒RT-LAMP快速检测方法的研究

根据逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)原理,针对水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G基因序列中的6个区域设计内外各1对特异引物,建立扩增VSV糖蛋白(G)基因的RT-LAMP方法。扩增产物电泳呈特异的阶梯状条带分布,扩增产物加SYBR GREEN I染色呈特征性的黄绿色,肉眼可直接观察判定。同时,还建立了可以进行定量检测的实时RT-LAMP方法。特异性试验显示,本方法可快速检验鉴别VSV与口蹄疫病毒(FMDV)和猪水泡病病毒(SVDV)。敏感性试验显示,建立的实时RT-LAMP方法检测VSVRNA的最低检测量为0.01 PFU,比实时荧光RT-PCR显著提高。建立的LAMP方法可检测p-VSVNJ质粒DNA的最低量为6.36×10-3pg/μL(1.4×103copies/μL),比PCR也显著提高。综合表明,本研究建立RT-LAMP检测VSV的方法具有特异、敏感、快速、简便的特点,具有开发应用前景。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒反转录环媒恒温检测方法的建立

本研究利用PrimerExplorer V4软件设计了针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N基因保守区6个特异性部位的4种引物,建立了PRRSV的反转录环媒恒温检测方法.利用该方法所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用1 h即可得到其特有的阶梯状条带,而且猪细小病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和健康猪睾丸细胞的扩增结果均为阴性.本方法对PRRSV的最低检出量为1 ×100个～1×101个基因拷贝.反转录环媒恒温检测方法和普通RT-PCR方法检测临床样品的符合率为96.2%.该方法为现地开展猪繁殖与呼吸综合征的快速诊断和综合防治方案的提出提供了有力的诊断工具.     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立与应用

针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因设计LAMP引物,对反应体系的条件优化并进行特异性及敏感性等试验。结果显示:该方法在60℃下恒温扩增60min,使PEDV的M基因得到了高效率特异性扩增。本试验方法特异性好,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRSSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)等无交叉反应,同时也具有较好的灵敏性,最低检测分子拷贝数为1.0×102 copies/μL。反应结束后加入SYBR GreenⅠ在紫外灯下观察颜色变化,结果显示阳性扩增产物呈现绿色荧光。结果表明:该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作便捷,适于临床检测PEDV。     

鸡传染性法氏囊病毒反转录环媒恒温检测方法的初步建立

本研究利用Primer Explorer V4软件设计了针对鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）VP1基因保守区6个特异性部位的4条引物,建立了IBDV的反转录环媒恒温检测方法。该方法反应体系在恒温水浴锅中作用1 h即可得到其特有的阶梯状条带,加入荧光素后肉眼可直接观察结果。本方法特异性高,对IBDV的最低检出量为10-6稀释倍数,敏感性是普通RT-PCR的100倍。反转录环媒恒温检测方法和普通RT-PCR方法检测临床样品的符合率为93.8%。因此该方法可以作为IBDV的综合防治和疾病诊断的实用方法。     

Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for the detection of Mycobacterium bovis

Bovine tuberculosis caused by Mycobacterium bovis is an important zoonosis. In this study, a simple, rapid method for detecting this organism was developed based on loop-mediated isothermal amplification of the mpt83 gene. The technique will be of value in the clinical and field-based diagnosis of M. bovis and can differentiate it from other bacteria such as Corynebacterium diphtheriae, Streptococcus pneumoniae, β-haemolytic streptococci, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pseudotuberculosis, Staphylococcus aureus, and Klebsiella pneumoniae. The limit of detection was 10 copies/μL and the results were corroborated by PCR. The method was highly specific and more sensitive than PCR.     

检测蜜蜂囊状幼虫病毒环介导等温扩增技术的建立

为建立一种快速检测蜜蜂囊状幼虫病毒(SBV)的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据SBV-UK株多聚蛋白基因序列(AF092924.1)设计了4条特异性引物,通过LAMP real-time Turbidimeter仪对SBV的反应体系和反应条件进行检测和实时监控,并评价其特异性、敏感性、重复性和稳定性。结果显示,在63℃恒温扩增40 min后,仅SBV核酸扩增,而其他病毒均呈阴性。反应结束后在反应体系中加入SYBR Green I的可视化判定结果与real-time Turbidimeter仪检测结果一致;该方法具有较强的特异性和较高的敏感性,其最低检出量为3.2×10~1拷贝/μL,是普通PCR的100倍;对同一批次和不同批次提取的SBV核酸进行扩增,结果表明重复性和稳定性良好;临床样品检测结果表明LAMP法与常规PCR法检测结果一致。本研究建立的LAMP方法操作简便,适用于SBV的快速检测。     

绵羊肺炎支原体LAMP检测方法的建立及初步应用

针对绵羊肺炎支原体(Mo) 16S rRNA基因设计4条环介导等温扩增(LAMP)引物,通过优化反应条件与体系,建立了Mo检测LAMP方法,并对其进行特异性、敏感性及临床应用性检测.结果显示,于60℃保温60 min即可最优化检测Mo,且所建方法仅能特异扩增Mo,最低检出分子拷贝数为1.0×102copies/μL,具有良好的特异性和敏感性.对4份已知阳性病料进行LAMP检测均为阳性,表明所建LAMP可初步应用于临床检测,为羊Mo感染病例诊断提供了新方法.     

Development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for diagnosis of equine piroplasmosis

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a novel nucleic acid method whereby DNA is amplified with high specificity, efficiency, and rapidity under isothermal conditions using a set of four specifically designed primers and a DNA polymerase with strand displacement activity. In this study, we used LAMP primer sets designed from EMA-1 and Bc 48 genes for detection of Theileria equi and Babesia caballi infections, respectively. These primer sets specifically amplified DNA of the respective parasites. Both primer sets amplified T. equi and B. caballi up to 10(-6) dilution of 10-fold serially diluted samples. Furthermore, DNA extracted from blood collected from a horse experimentally infected with T. equi was amplified by a T. equi LAMP primer set from days 2 to 35 post-infection, demonstrating the high sensitivity of these primers. Of 55 samples collected from China, 81.8% and 56.3% were positively detected by LAMP for T. equi and B. caballi infections, respectively. In contrast, 91.8% and 45.9% of the 37 samples collected from South Africa were LAMP positive for T. equi and B. caballi, respectively. These results suggest that LAMP could be a potential diagnostic tool for epidemiological studies of equine piroplasmosis.     

贝类折光马尔太虫LAMP可视化检测方法的建立

根据折光马尔太虫的基因保守序列设计了1套特异性环介导等温扩增（LAMP）引物,建立了折光马尔太虫LAMP可视化检测方法。该方法全部反应可在1h内完成;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;检测的灵感性可达20fg,高于常规PCR方法100倍;对其他贝类常见病原体的检测结果均为阴性。结果表明,所建立的折光马尔太虫LAMP检测方法简便、快速、灵敏、特异,可用于贝类折光马尔太虫感染的快速检测。     

猪细环病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种特异和快速的猪细环病毒(TTSuV)检测方法,本研究通过比对TTSuV的全基因序列,选择其保守区域,设计了针对TTSuV检测的LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪对反应体系及条件进行了优化,建立TTSuV环介导等温扩增的检测方法.结果表明:该方法最佳反应条件为64℃恒温50 min,病毒的最低检出限为5.5拷贝/μL,并且与其他相关传染病无交叉反应.临床样品检测结果显示,猪繁殖与呼吸综合征病毒-(PRRSV)和2型猪圆环病毒(PCV2)阳性的样品中TTSuV呈高阳性率,分别为92％和87.3％,显著高于非PRRSV和PCV2阳性的猪群.该方法的建立为快速及特异性的检测猪TTSuV提供了有效的方法.     

环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒

为建立一种快速、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究针对PEDV的NP基因设计LAMP引物,对反应体系优化并进行特异性及敏感性等试验.结果表明,该方法在65℃下恒温扩增60 min,经SYBR Green Ⅰ染色后仅肉眼观察即可判定结果.该方法特异性好,与传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒及大肠杆菌等无交叉反应,对重组质粒最低检测限度为16拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR.该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作方便,适于临床检测PEDV.     

狂犬病病毒LAMP检测方法的建立及初步应用

针对狂犬病病毒基因Ⅰ型核蛋白保守区设计4条识别靶序列上6个位点的特异性引物,在链置换聚合酶(Bst酶)作用下,60℃恒温1 h内完成扩增。反应特异性强、灵敏度高。扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳、显色反应或浊度比较进行判定。通过对反应条件的优化,病毒基因的的最低检出量可达到101拷贝数。该方法可用于狂犬病病毒的实验室检测和临床初步诊断。