牙鲆变态发育过程中epigen基因的空间表达分布

细胞分裂在鲽形目鱼类变态过程中发挥了重要作用。Epigen作为表皮分裂原,通过激活MAPK通道来调控有丝分裂。以前的研究利用定量PCR表明,epigen在变态前期表达量升高,而变态后期表达量下降,表明其与变态发育相关。为了进一步调查epigen与牙鲆变态发育的关系,利用RNA整体原位杂交技术检测了epigen在变态期牙鲆体内的空间表达分布,发现在变态期的各个阶段,epigen基因表达分布均比较广泛,表皮、鳃、肝脏、肠道、鳍条、支鳍骨、肌节等组织都有表达,在牙鲆变态前和变态早期(E期)信号较强,而在变态高峰期(F期和G期)和变态后期(H期)信号逐渐变弱。Epigen空间表达分布模式提示,其作为表皮分裂原,可能广泛参与牙鲆变态发育早期事件,尤其可能与肝脏、肠道、支鳍骨和鳍条的发育有关。     

牙鲆ras-2基因cDNA全长的克隆和表达分析

Ras主要参与表皮生长因子家族调控细胞分裂的信号通路。本研究采用末端快速扩增法获得了牙鲆ras-2基因全长2384bp cDNA序列,该序列编码187个氨基酸,含有switchⅠ、switchⅡ、P-loop、CAAX box等Ras家族的结构特征,与川鲽ras-2氨基酸序列相似性最高(96.3%)。定量PCR检测显示ras-2基因在牙鲆成体的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、鳃、肠、肌肉、鳍条和皮肤组织均有不同程度的表达,其中鳍条表达量最高,肌肉的表达量最低;在牙鲆变态前和变态初较高,随着变态进行,表达水平显著降低。RNA整体原位杂交结果显示ras-2基因主要在牙鲆变态阶段的鳍条、眼眶周围、颔、鳃、鼻孔、侧线等部位的表皮组织中表达,变态前在鳍条和体侧线表达信号最强,变态阶段E期的信号稍微减弱,主要分布在鳍条和鳃,变态高峰期(F期和G期)信号主要集中在鳍条、鳃和颔,H期表达信号主要集中在鳃和鳍条。ras-2基因表达式型显示,其可以通过调控细胞分裂的方式,参与牙鲆变态过程中眼睛移动、冠状幼鳍发育、侧线发育等多种器官的发育调控。     

牙鲆ras-2基因cDNA全长的克隆和变态时期的表达分析

Ras主要参与表皮生长因子家族调控细胞分裂的信号通路。采用末端快速扩增法获得了牙鲆(Paralichthys olivaceus)ras-2基因全长2 384 bp cDNA序列,该序列编码187个氨基酸,含有switchⅠ、switchⅡ、P loop、CAAX box等Ras家族的结构特征,与川鲽(Paralichthys olivaceus)ras-2氨基酸序列相似性最高(96.3%)。定量RT PCR检测显示ras-2基因在牙鲆成体的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、鳃、肠、肌肉、鳍条和皮肤组织均有不同程度的表达,其中鳍条表达量最高,肌肉的表达量最低;在牙鲆变态前和变态初相对表达量较高,随着变态进行,表达水平显著降低。牙鲆变态阶段的RNA整体原位杂交结果显示ras-2基因主要在鳍条、眼眶周围、颌、鳃、鼻孔、侧线等部位的表皮组织中表达,变态前在鳍褶和体侧线表达信号最强,变态阶段E期的信号稍微减弱,主要分布在支鳍骨和鳃,变态高峰期（F期和G期）信号主要集中在支鳍骨、鳃和颌,H期表达信号主要集中在鳃和支鳍骨。ras-2基因表达式型表明其可以通过调控细胞分裂的方式,参与牙鲆变态过程中眼睛移动、冠状幼鳍发育、侧线发育等多种器官的发育调控。     

牙鲆纤维蛋白原相关蛋白（FREP1）基因的克隆和表达分析

利用RACE-PCR技术获得了牙鲆FREP1(fibrinogen related protein)基因1 131 bp cDNA全长序列,其中开放阅读框786 bp ,所编码的蛋白C 端含有纤维蛋白样结构域标签(WWYSRCGSAGLNG)。RNA整体原位杂交检测发现只在孵化后2 d和5 d（2 dph、5 dph）仔鱼的肠道中有FREP1基因表达,而在9 dph和13 dph仔鱼胸鳍、肠道、鳃和皮肤中均有表达。荧光定量PCR检测显示该基因主要在成鱼的肠、鳃、皮肤和鳍条上表达,而脾脏、心脏、肾脏、肝脏和肌肉表达量很低或没有表达。鳍条和皮肤较其他组织均有极显著差异（P<0.01）,鳃和肠相比其他组织具有显著差异（P<0.05）。由于该基因主要在鳍条、皮肤、肠和鳃中表达,提示FREP1基因可能和牙鲆先天性免疫相关。     

牙鲆早期发育和变态期间Pitx2基因的表达

Pitx2基因被认为是脊椎动物中调节内脏器官左右不对称的关键转录因子。为进一步探讨牙鲆变态期间的左右不对称是否也受Pitx2的左特异活性调节,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),拟在变态的牙鲆的头部组织中克隆编码Pitx2基因的部分cDNA序列,并通过以18s rRNA为内标的半定量RT-PCR研究其在牙鲆早期发育和变态期间的表达情况。克隆和测序的结果表明Pitx2在牙鲆早期发育和变态期间也存在基因表达;而半定量的结果表明它的左特异性功能很可能在变态的早期阶段发挥作用。但是,牙鲆变态期间的右眼移动是否受Pitx2的左特异活性调控,以及变态期间的左右不对称和内脏器官的左右不对称是否拥有相同的分子机制,仍需进一步研究。     

牙鲆纤维蛋白原相关蛋白(FREP1)基因的克隆和表达分析

利用RACE-PCR技术获得了牙鲆FREP1(fibrinogen-related protein)基因1 131 bp cDNA全长序列,其中开放阅读框786 bp,所编码的蛋白C端含有纤维蛋白样结构域标签(WWYSRCGSAGLNG).RNA整体原位杂交检测发现只在孵化后2d和5 d(2 dph、5 dph)仔鱼的肠道中有FREP1基因表达,而在9 dph和13 dph仔鱼胸鳍、肠道、鳃和皮肤中均有表达.荧光定量PCR检测显示该基因主要在成鱼的肠、鳃、皮肤和鳍条上表达,而脾脏、心脏、肾脏、肝脏和肌肉表达量很低或没有表达.鳍条和皮肤较其他组织均有极显著差异(P＜0.01),鳃和肠相比其他组织具有显著差异(P＜0.05).由于该基因主要在鳍条、皮肤、肠和鳃中表达,提示FREP1基因可能和牙鲆先天性免疫相关.研究亮点:FREP在鱼类免疫方面的报道很少,本研究所克隆的牙鲆FREP1,不管是牙鲆仔鱼还是成鱼,其仅在与外界直接接触的皮肤、鳃、肠道等组织中表达,提示其与牙鲆的先天免疫相关.     

LEPR基因在贵州白山羊组织中的表达

为探究瘦素受体基因(LEPR)在贵州白山羊组织中的表达规律,利用实时荧光定量PCR技术检测LEPR基因在贵州白山羊心、肝、脾、肺、肾、肠、背肌、腿肌和皮下脂肪9个组织的表达量。结果表明:目的基因LEPR和内参基因GAPDH的熔解曲线均呈单一峰形,说明所选条件可准确定量LEPR基因在贵州白山羊各组织中的相对表达量。具体表达量为脂肪脾肺背肌肠肝肾心腿肌。     

文心兰OnRR10基因的克隆及表达分析

为了鉴定控制文心兰花瓣衰老的关键基因,从文心兰花瓣中提取总RNA,利用RACE技术,得到OnRR10基因（登录号:MN337795）。该基因全长630 bp,编码209个氨基酸大小的蛋白质。蛋白质二级结构分析表明,OnRR10蛋白为亲水性蛋白,定位于细胞核中。同源序列比对及系统进化分析显示,OnRR10基因属于YesN家族。兰科中,OnRR10蛋白与小兰屿蝴蝶兰OnRR10亲缘关系最近。实时荧光定量分析表明,OnRR10基因在文心兰花发育的A时期（花苞期）和F时期（衰老早期）表达量达到最高值;基因表达似不受生物钟控制;细胞分裂素处理后表达分析表明,短时间内受6-BA刺激基因表达量急速上升。结果表明,OnRR10基因可能通过细胞分裂素作用而参与文心兰花瓣衰老过程。     

Tbx5基因在牙鲆变态初期的表达

鲽形目鱼类仔鱼经过变态后形成眼睛和偶鳍等器官左右不对称的稚鱼。Tbx家族成员参与脊椎动物心脏、肢体和眼等器官的发育,而Tbx基因与鲽形目鱼类变态的关系目前尚无报道。运用扫描电镜和软硬骨染色等方法对出膜后2 d（变态早期）和26 d（变态前期）的牙鲆仔鱼的形态进行观察,牙鲆出膜后2 d胸鳍原基出现,出膜后26 d胸鳍发育成熟,而在出膜后26 d胸鳍和腹鳍仍左右对称。我们克隆了牙鲆Tbx5基因的CDS序列,该序列编码的多肽具有部分T-box保守结构域,与斑马鱼Tbx5同源性高达93%。系统进化分析显示：这段CDS序列与硬骨鱼的Tbx5基因聚为一支,但与四足动物Tbx5相分离。整体原位杂交显示出膜后26 d的牙鲆仔鱼中,Tbx5基因不仅在胸鳍、眼背侧、脊柱和尿囊表达,且在胸鳍和眼背侧的表达呈现左右不对称,左侧面（有眼侧）的表达量均高于右侧面（无眼侧）的表达量。综上结果显示,牙鲆Tbx5基因可能参与了变态过程中眼睛与胸鳍左右不对称的形成。     

甲状腺激素受体TRαA基因在牙鲆不同变态发育阶段中的表达差异

为了探讨甲状腺激素受体TRαA基因在牙鲆不同变态发育阶段中的表达差异,以及甲状腺激素T4和硫脲处理对TRαA基因表达的影响,采用了半定量RT-PCR法测定牙鲆不同发育阶段头部甲状腺激素受体TRαA mRNA水平。结果显示,牙鲆不同变态发育阶段甲状腺激素受体TRαA基因表达存在明显差异,从受精卵到变态期TRαA表达量呈缓慢增加趋势,到24日龄出现第一个表达高峰,随后表达量下降,30日龄之后随日龄增加表达量又逐渐增加,至变态高峰期38日龄出现第二个表达高峰,而且高于第一个表达高峰,至成鱼表达量再次下降至较低水平。甲状腺激素T4处理组和硫脲处理组与同日龄正常组相比,TRαA的表达也有明显差异,在甲状腺激素T4处理组中TRαA表达降低,而在硫脲处理组中TRαA表达反而增高。甲状腺激素T4对变态期牙鲆TRαA基因转录可能有下降调节作用。     

牙鲆继饥饿后的摄食和生长的研究

对牙鲆Paralichthys olivaceus（体重5.93 g±1.20 g）继饥饿后的摄食和生长进行了研究。牙鲆饥饿5d（S5）、10 d（S10）和15 d（S15）后恢复喂食20 d,对照组持续喂食20 d,测定恢复喂食期间牙鲆的摄食率（FR）、食物转化效率（FCE）、吸收率（AE）和排粪率（DR）,同时测定饥饿和恢复喂食期间牙鲆的全长、体重、特定生长率（SGR）、比肝重（HSI）、肝胰脏和肌肉中的RNA/DNA。结果表明：恢复喂食过程中,牙鲆的FR先升高后下降,而FCE则均先下降后升高;S5和S10组牙鲆的总吸收率（TAE）高于对照组,而S15组则低于对照组;S5组牙鲆的全长和体重接近对照组,而S10和S15组则不如对照组;饥饿处理组牙鲆的SGR在恢复喂食后先升高后降至对照组水平;饥饿时间越长,牙鲆的HSI越小,在恢复喂食过程中HSI逐渐接近对照组;饥饿时间越长,肝胰脏和肌肉中的RNA/DNA越小,在恢复喂食过程中RNA/DNA迅速升高,接近或超过对照组;在20 d的恢复喂食过程中,S5组出现完全补偿生长,S10和S15组出现部分补偿生长。研究表明,牙鲆在恢复喂食过程中,通过先提高FR后再提高FCE的方式产生补偿生长。     

雌核发育牙鲆家系的生长比较和形态分析

跟踪测定9个雌核发育牙鲆Paralichthys olivaceus家系后裔150、240、360 d时的生长资料,对体重、体长、绝对增重率、绝对增长率和体型指数（头长/体长、尾柄长/尾柄高）进行方差分析,对体重和体型指数进行相关分析,并建立了体重-体长的回归方程。结果表明：家系C11847的体重、体长及头长/体长与尾柄长/尾柄高指标在各阶段均有明显的生长优势,可作为重点家系加强选育。不同生长阶段绝对增重率和绝对增长率最优家系不一致,且家系间的生长差异主要发生在240 d前。各日龄体型指数均与体重呈极显著负表型相关（P〈0.01）。不同日龄体型指数间差异显著（P〈0.05）。雌核发育牙鲆的体重与体长之间呈曲线相关关系,且该关系在不同日龄间无显著差异（P〉0.05）。     

牙鲆Follistatin cDNA的克隆与序列分析

为研究海水鱼中Follistatin基因的序列特征,从受精后67 h的牙鲆受精卵中克隆获得牙鲆Follistatin基因cDNA序列,并对其进行序列分析.结果表明,在牙鲆中并没有发现Follistatin基因的可变式剪切现象;牙鲆Follistatin基因cDNA序列全长963 bp.序列分析结果显示:牙鲆与Takifugu rubripes的亲缘关系最近.Follistatin蛋白中高度保守的半胱氨酸和甘氨酸残基的生物学功能可能是维持蛋白空间结构的稳定.     

甲状腺激素受体TRαA基因在牙鲆不同变态发育阶段中的表达差异

为了探讨甲状腺激素受体TRαA基因在牙鲆不同变态发育阶段中的表达差异,以及甲状腺激素T4和硫脲处理对TRαA基因表达的影响,采用了半定量RT-PCR法测定牙鲆不同发育阶段头部甲状腺激素受体TRαA mRNA水平。结果显示,牙鲆不同变态发育阶段甲状腺激素受体TRαA基因表达存在明显差异,从受精卵到变态期TRαA表达量呈缓慢增加趋势,到24日龄出现第一个表达高峰,随后表达量下降,30日龄之后随日龄增加表达量又逐渐增加,至变态高峰期38日龄出现第二个表达高峰,而且高于第一个表达高峰,至成鱼表达量再次下降至较低水平。甲状腺激素T4处理组和硫脲处理组与同日龄正常组相比,TRαA的表达也有明显差异,在甲状腺激素T4处理组中TRαA表达降低,而在硫脲处理组中TRαA表达反而增高。甲状腺激素T4对变态期牙鲆TRαA基因转录可能有下降调节作用。     

牙鲆Follistatin基因启动子克隆与分析

为研究海水鱼中Follsitatin基因的组织表达特异性,利用PCR方法获得牙鲆Follistatin基因启动子并进行序列分析,用RT-PCR和显微注射方法研究Follistatin基因与肌肉发育的关系.结果表明,所获得的启动子含有USF、F47、MyoD、NF-Y等多种转录因子结合位点;在牙鲆成体组织中,Follistatin基因在体肾、肠、心脏、头肾、脾中有表达,而在肌肉和肝脏中没有表达;显微注射证明Follistatin基因参与了肌肉的早期发育.     

周期性饥饿-再投喂对牙鲆幼鱼生长和饲料利用的影响

于2003年5~6月,在(18±1)℃条件下对牙鲆Paralichthys olivaceus幼鱼(初始体重为4.21±0.28g)分别进行了周期性饥饿-再投喂的生长试验。对照组连续饱食投喂36 d,处理组S2F4、S3F6、S4F8分别周期性饥饿2 d再投喂4 d,饥饿3 d再投喂6 d和饥饿4 d再投喂8 d。结果表明:S2F4组牙鲆幼鱼的终末体重、特定生长率、摄食率和饲料转化率均显著高于对照组(P<0.05);S3F6组牙鲆幼鱼的终末体重、特定生长率、摄食率和饲料转化率与对照组无显著差异(P>0.05);S4F8组牙鲆幼鱼的终末体重、特定生长率和摄食率显著低于对照组(P<0.05),而饲料转化率与对照组无显著差异(P>0.05)。试验结束时,各处理组鱼体生化组成与对照组没有显著差异(P>0.05)。     

显微注射抗冻剂对牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎毒性及冷敏感性的影响

摘要 鱼类胚胎冷冻保存经过多年研究,尽管有所突破,但目前仍未达到应用水平,其主要原因是由于鱼类胚胎体积大、卵膜通透性差等特点,导致传统的平衡法,无法使抗冻剂足够、有效的进入胚胎内部起到保护胚胎的作用。而在鱼类胚胎冷冻保存中利用显微注射技术,可直接将抗冻剂注射到鱼类胚胎卵黄囊内,这一定程度上弥补了普通平衡法的不足,提高抗冻剂对胚胎的保护程度。本研究主要对抗冻剂的选择、抗冻剂对牙鲆胚胎的注射剂量、注射浓度、以及注射后牙鲆胚胎的冷敏感性进行了比较分析。结果表明：1、牙鲆胚胎较适宜的显微注射剂量为750pl。2、几种抗冻剂注射牙鲆胚胎后的毒性大小相对排列为PVP>蔗糖,DMSO > MeOH > PG,其中注射PG获得的胚胎成活率和孵化率最高,注射PVP获得的胚胎成活率和孵化率最低,而PG与MeOH组成混合抗冻剂PM毒性更低获得的胚胎成活率和孵化率更高。而任何一种抗冻剂均随着浓度的增加其毒性随之增加。3、另外,在冷敏感实验中,显微注射6M的PM的胚胎胚胎,应用程序化法处理,以2℃/min的速率降至-20℃,平衡10min后解冻处理,发现注射PM的胚胎低温处理后成活率为25.07±1.57%,而6M的PM五步平衡法同步处理的对照组胚胎成活率为20.88±2.84%,说明显微注射的胚胎冷敏感性一定降低。     

牙鲆正常个体与白化个体脂肪酸组成的比较

采用毛细管色谱法对牙鲆Paralichthysolivaceus正常个体和白化个体肌肉、皮肤和肝脏的脂肪酸组成及含量进行了检测。结果表明:两者相对应组织的脂肪酸种类没有区别,但脂肪酸的含量存在若干差异。1)两者肌肉的脂肪酸组成基本相似,特征为多不饱和脂肪酸(PUFA)>饱和脂肪酸(SFA)>单不饱和脂肪酸(MUFA),PUFA以n-3系列为主,但两者肌肉中有13种脂肪酸的含量差异显著(P<0 05),正常个体PUFA含量显著高于白化个体(P<0 05),而MUFA含量显著低于白化个体(P<0 01);2)两者皮肤中有7种脂肪酸的含量差异显著(P<0 05),正常个体SFA含量显著高于白化个体(P<0 01),而PUFA和MUFA的含量,两者差异均不显著(P>0 05);3)两者肝脏中只有3种脂肪酸的含量差异显著(P<0 05);4)正常个体的n-3/n-6比值高于白化个体,尤其在肌肉和肝脏中。