‘忠薯1’薯皮过氧化物酶分离纯化及其理化性质研究

经表皮组织匀浆抽提,无水乙醇分级沉淀, DEAE-Sepharose离子交换层析, Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯度的过氧化物酶.该酶比活力、纯化倍数及回收率分别为571 975.93 U/mg, 51.72, 33.80%.该酶总分子量约为37.2 kDa,且为单聚体.该酶最适温度, pH值分别为65℃, 6.2,具有耐酸耐热特性.‘忠薯1’过氧化物酶K_m值为52.833 mmol/L,且属于乒乓反应. Mg~(2+),Cu~(2+),Co~(2+),Fe~(3+)对该酶有较强激活作用; Pb~(2+)是甘薯过氧化物酶的有效抑制剂.     

环状芽孢杆菌A6产生的果胶酶和木聚糖酶分离纯化及酶学性质

寄生于南方亚麻茎杆上的环状芽孢杆菌发酵产生的果胶酶和木聚糖酶经采用(NH4)_2SO_4沉淀与半透膜透析,CM-Sephadex C-50凝胶离子交换柱层析,Sephadex G-100凝胶柱层析分离纯化.经鉴定果胶裂解酶和木聚糖酶基本达电泳纯,果胶裂解酶两个亚基的相对分子质量分别为32253,27400,木聚糖酶两个亚基的相对分子质量分别为86 489,57422;果胶裂解酶和木聚糖酶最适反应温度为45℃;果胶裂解酶最适反应pH值为10.5,木聚糖酶最适反应pH值为7;对果胶裂解酶而言,K~ ,Mg~(2 )有轻度的抑制作用.Fe~(2 ),Cu~(2 )有强抑制作用,Ca~(2 )有一定的激活作用;对木聚糖酶,K~ ,Mg~(2 )有轻微抑制作用,Cu~(2 )有强抑制作用,Ca~(2 )和Fe~(2 )有一定的激活作用.     

藜麦麸过氧化物酶分离纯化及酶学特性研究

经浸提、硫酸铵分级沉淀和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,从藜麦麸中纯化得到了电泳纯的过氧化物酶(peroxidase,POD),其纯化倍数、比活力和回收率分别为23.78,22 753.09 U/mg和19.36%。经SDS-PAGE鉴定,该酶相对分子质量为57.1 ku。在催化愈创木酚与过氧化氢的反应中,酶的最适温度为60℃,最适pH值为6.0,在40～60℃及pH值4～8范围内具有较好的稳定性。以H_2O_2为底物,测得该酶的Km值为5.61 mmol/L。尿素、Mg~(2+)和Fe~(3+)对酶有激活作用,当其浓度为50 mmol/L时,酶活力被分别激活至119%,117%,161%;K~+,Ca~(2+)对藜麦麸POD无显著影响;甲醇,乙醇,异丙醇,正丁醇,KSCN,SDS,Zn~(2+),Cu~(2+),Mn~(2+)对酶有抑制作用,其中,正丁醇和SDS对酶的抑制作用很强,当正丁醇体积分数为20%,SDS浓度为10 mmol/L时,酶的活性完全丧失。     

毕赤酵母表达罗氏耶尔森氏菌(Yersinia rohdei)植酸酶和酶学特性研究

按毕赤酵母偏爱密码子,将来自Yersinia rohdei的植酸酶基因(YrAPPA)进行了化学合成,并成功在毕赤酵母GS-115中异源分泌表达,重组植酸酶分泌量能达到72μg/mL。酶学特性研究结果表明:酶比活达到1 500 U/mg,重组植酸酶的最适反应温度和pH分别为55℃和4.5;纯化的重组植酸酶能耐受60℃高温,且pH 3—7.5范围内重组植酸酶有良好的稳定性;Cu~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(3+)对植酸酶活性有抑制作用;重组植酸酶有抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解特性。     

木聚糖酶的分离纯化及性质研究

采用硫酸铵盐析、Phenyl—Sepharose CL-4B疏水层析、Sephadex G-50凝胶层析和DEAE- Sepharose fast flow阴离子交换层析等分离技术,从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)固态培养物浸出液中分离出一种SDS—PAGE电泳纯木聚糖酶组分,其最终的收率为19．0％,纯化倍数为26．9。该木聚糖酶的相对分子质量20．7 ku,等电点pl5．0,含糖量0．42％;该酶的最适作用温度为50 C,在50 C以下较稳定;最适作用pH 5．0,在pH 5．5～9．0时较稳定;Ca2+对该酶活性有一定的激活作用,而Pb2+,Sn2+,Cu2+,Al3+则有较强的抑制作用。以桦木木聚糖为底物,测得该酶的Km值和Vmax分别为3．5 mg／mL和5000 μmol／(min·mg)。     

鲢内源性转谷氨酰胺酶的纯化及其性质

以鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌肉为原料,采用硫酸铵盐析、凝胶过滤层析(Sephacryl S-300HR)和阴离子交换层析(DEAE-Sepharose FF)对鲢内源性转谷氨酰胺酶(TGase)分离纯化,并对其酶学性质进行研究。结果表明,酶液经多步纯化后可得单一酶蛋白,其分子质量为100ku,比活力为126.7U/mg,纯度提高34.2倍,该酶适宜的反应pH和温度分别为8.0和50℃。鲢内源性TGase具有Ca~(2+)依赖性,最适Ca~(2+)浓度为3mmol/L。DTT在低浓度(0~5 mmol/L)范围能增加酶的活性,而高浓度的DTT、EDTA及Mg~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、Ba~(2+)、Sn~(2+)、Fe~(3+)等金属离子则表现出抑制作用。鲢内源性TGase对鲢和草鱼肌球蛋白有较强的催化交联作用,能够诱导鲢、草鱼肌球蛋白交联形成多聚体,且对鲢肌球蛋白的催化交联作用更强。     

β 淀粉酶的分离纯化及酶学性质研究

以"渝薯17"为实验材料,从淀粉生产废水中分离纯化β-淀粉酶.去皮、1∶10(m/V)匀浆抽提,经过乙醇分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析获得电泳纯β-淀粉酶并对其酶学性质进行了研究.结果表明:该酶的比活力高达333.15U/mg,显著高于市售枯草杆菌来源酶活(50U/mg);纯化倍数9.93倍,回收率66.60%;亚基分子量约为55.12kD,全酶分子量约为223.54kD;最适温度50℃,最适pH值6.2;50℃以下,pH值6~8具较好的稳定性.在最适条件下以可溶性淀粉为底物,测得Km为0.001 36g/mL,V_(max)为0.112mg/mL·min;Mn~(2+),Pb~(2+),Li~+,Zn~(2+),K~+,Cu~(2+),草酸,SDS对该酶有不同程度的抑制作用,Co~(2+)有激活作用,有机物作用不明显.     

短小芽孢杆菌阿魏酸酯酶的分离纯化及性质研究

通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水层析,对短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)发酵液中的阿魏酸酯酶进行分离纯化,并测定其部分酶学性质。结果表明,阿魏酸酯酶的纯化倍数为5.06,回收率达到14.8%。该酶的相对分子质量约为28.6 ku;最适反应温度为50℃,最适pH为5.8,在40~45℃和pH 5.8~8.2都能保持很高的稳定性。K~+、Co~(2+)、Ca~(2+)和DTT对酶活有明显的促进作用,而Cu~(2+)、乙醇和苯甲基磺酰氟严重抑制了其酶活。以阿魏酸甲酯为底物,测得Km为0.25 mmol/L,Vmax为6.27 U/(min·mg)。     

Bacillus mycoides磷脂酶C纯化制备研究

通过离子交换吸附(pH7.2)、超滤、离子交换层析(pH8.5)、疏水层析及凝胶层析等多步纯化过程对Bacillus mycoides 970 发酵所产胞外磷脂酶C的分离纯化进行了研究.纯化倍率为40.8倍,纯化酶活收率为25%.纯化样品比活力达到15370 U/mg.样品纯度经过SDS-PAGE检测达到电泳纯.     

海洋弧菌中褐藻胶裂解酶Alg的克隆表达及酶学性质

褐藻胶裂解酶是制备功能性寡糖的关键酶,以基因工程手段构建重组褐藻胶裂解酶,为实现褐藻胶裂解酶向商业酶转化奠定重要基础。以海洋弧菌SS-1总DNA为模板,运用PCR技术克隆得到褐藻胶裂解酶基因Alg,构建重组表达菌株E.coli BL21(DE5α)/p ET28a(+)-Alg,进行诱导表达,产物通过Ni-NTA resin亲和层析柱纯化,研究其酶学性质及酶解产物。结果表明,重组酶的最适pH为8.0,在pH 4.0~9.0范围内,30℃条件下保温2 h,仍能保持60%以上的相对酶活力;最适温度30℃,热稳定实验显示在高于30℃保温2 h其残余酶活力损失40%以上;在添加浓度1 mmol/L离子K~+、Na~+和Mg~(2+)显示对重组酶有明显的促进作用,Cu~(2+)、Fe~(3+)、Ba~(2+)、Fe~(2+)、Al~(3+)、SDS和EDTA等对该酶抑制作用明显;动力学参数Km为5.93 mg/mL,Vmax为826.44 mg/(mL·min);电离喷雾质谱(ESI-MS)分析其降解褐藻胶产物主要为小分子寡糖。重组酶是具有良好的酶学特性及有效的作用poly(M)降解产生低聚寡糖的双功能酶,可用于褐藻寡糖的制备。     

南极磷虾羧肽酶的分离纯化及酶学性质

南极磷虾生活在极寒环境,其体内特殊的蛋白酶系统是其维持正常新陈代谢的关键因素。羧肽酶是南极磷虾蛋白酶系统中一类主要且关键的蛋白酶,酶学性质研究对其后续基础研究开展及商业利用都具有指导意义。本研究以南极磷虾为原料,采用缓冲液提取、硫酸铵分级盐析,DEAE-琼脂糖凝胶FF阴离子层析和Sephadex G-100凝胶层析,从南极磷虾匀浆液中分离纯化出一种羧肽酶,SDS-PAGE结果显示其分子量为30 ku。酶学性质研究结果显示:该酶最适温度为30℃;最适pH为8.0。热稳定性较差,即使在4℃下保温超过2 h酶活性会急剧下降。金属离子Ni~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)和Mg~(2+)具有激活作用,且激活作用依次增强;而Ca~(2+)、Fe~(3+)和Cu~(2+)起抑制作用,Cu~(2+)抑制效果最明显。对巯基有修饰作用的抑制剂DTT和β-巯基乙醇对其有抑制作用,推测该酶活性中心存在二硫键;金属蛋白酶抑制剂EDTA和1,10-菲罗啉对该酶活性有明显的抑制作用,说明了其具有金属蛋白酶特性;而丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对该酶抑制作用并不强烈。以脲酰-L-苯丙氨酸为底物溶液,测得该酶K_m为0.005 9 mg/mL、V_(max)为4.909 1 U/min。     

灰绿青霉阿魏酸酯酶的分离纯化和酶学性质研究

[目的]研究青霉(Penicillium glaucum)XGY36胞外产阿魏酸酯酶的纯化和酶学性质。[方法]菌株胞外产酶发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE-cellulose DE52离子交换柱层析、Sephadex-G75分子筛层析进行纯化,得到纯度较高的酶蛋白,并对其酶学性质进行研究。[结果]从菌株发酵液中分离纯化到电泳纯的阿魏酸酯酶,纯化倍数6.54,酶活性回收59.7%。阿魏酸酯酶经SDS-PAGE获得1个条带,其表观分子量为36.5 ku。催化底物阿魏酸乙酯的最适反应温度为50℃,最适p H为5.0。阿魏酸酯酶在60℃以下和p H 3.0~7.0范围内稳定。金属离子Zn~(2+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)对酶有明显的激活作用,而Pb~(2+)、Hg~(2+)和Ag+对阿魏酸酯酶有强烈的抑制作用,Na+、K+、Mn~(2+)、Cu~(2+)和Fe~(2+)对酶活的影响不大。[结论]青霉阿魏酸酯酶具有潜在的应用价值,适合应用于食品、医药及生物等领域。     

高产木聚糖酶的紫色红曲霉菌株筛选及酶学性质研究

[目的]筛选紫色红曲霉木聚糖酶,并研究其酶学性质。[方法]采用平板筛选和固体培养方法获得了产木聚糖酶较高的紫红曲霉（Monascus pupureus）533。采用50%~70%硫酸铵盐析、Sephadex G-25凝胶层析、DEAE Sepharose fast flow阴离子交换层析和SephacrylS-200凝胶层析进行纯化。最后,研究温度、pH、金属离子和化学物质对酶活性的影响。[结果]经分离纯化后得到相对分子质量约为46.0 kD的木聚糖酶。木聚糖酶最适反应温度为47℃;最适反应pH为5.5,pH稳定范围为4.5~5.5;Ca2＋、Fe2＋、Na＋和Tween 80对酶活力有激活作用;Mn2＋、Tris、EDTA、尿素和SDS对酶活力有抑制作用;Cu2＋和K＋对酶活力影响不大。[结论]该研究筛选到1株高产木聚糖酶的紫色红曲菌株,扩大了产木聚糖酶的菌株范围。     

枯草芽孢杆菌C-36纤维素酶的纯化及酶学性质

枯草芽孢杆菌C-36纤维素酶经硫酸铵、SephadexG-75、SephadexG-100分离纯化后,得到一个电泳纯的葡聚糖内切酶。SDS-PAGE结果表明,该酶分子量约为35kD。最适反应温度和pH分别为65℃和pH6.8,Zn2 、Pb2 、Fe3 对酶有抑制作用,Ba2 、Fe2 对酶有激活作用,在50℃,pH6.8条件下,酶对CMC-Na的米氏常数Km为0.34g/L,最大反应速度Vmax为0.17mg/(min.mL)。     

柠檬烯转化酶的提取条件优化及酶学性质研究

以指状青霉(Penicillium digitatum) DSM62840为研究对象,采用高压细胞破碎法破碎菌体,对其转化柠檬烯生成α-松油醇过程中的相关酶的提取条件进行优化。以柠檬烯转化酶活性为指标,在单因素试验的基础上结合响应面试验法,确定最佳提取条件;同时,对柠檬烯转化酶的酶学性质进行了初步探索。结果显示,最佳提取条件为:破碎压力100 MPa、破碎6次、液料比15∶1 (mL/g),在此条件下,α-松油醇的质量浓度为855.75 mg/L,酶活力达到71.31 U。柠檬烯转化酶最佳转化时间为4 h,在磷酸盐缓冲液中获得的酶活性最高;该酶可能为细胞色素P450,且不同的金属离子对酶活性的影响不同:Fe~(2+)对酶有轻微的抑制作用,而Ca~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Co~(2+)、Ba~(2+)、Na~+、K~+、Fe~(3+)、Ni~(2+)则对酶有不同程度的激活作用。粗酶液SDS-PAGE电泳结果表明优化后的提取工艺效果较好。     

一株产α-淀粉酶菌株的分离、鉴定及酶学特性分析

【目的】筛选α-淀粉酶高产菌株,并对其酶学性质进行研究.【方法】从富含淀粉的土壤中筛选出1株高产淀粉酶的菌株,命名为LZ-1.通过观察菌落形态、表征生理生化特性、测定16SrDNA序列及构建系统发育进化树对其进行鉴定.采用硫酸铵盐析、DEAE-52阴离子交换法纯化蛋白,SDS-PAGE检测蛋白相对分子质量.【结果】LZ-1鉴定为土生拉乌尔菌(Raoultella terrigena),所产淀粉酶最大酶活力为40.6U/mL,纯化后的淀粉酶比活力为121.3U/mg,纯化倍数为6.4,回收率为69.3%,相对分子质量为43ku.菌株LZ-1所产淀粉酶最适温度为50℃,在50~70℃其稳定性较高;最适pH值为7.0,在pH 5.0~7.0的条件下稳定性较高;Ca~(2+)、Mg~(2+)、Na~+、K~+对淀粉酶有激活作用;EDTA、Fe~(2+)、Zn~(2+)对淀粉酶有抑制作用.【结论】该菌株所产α-淀粉酶稳定性较高,具有一定的应用前景.     

枯草芽孢杆菌C-36纤维索酶的纯化及酶学性质

枯草芽孢杆菌C-36纤维素酶经硫酸铵、SephadexG-75、SephadexG-100分离纯化后,得到一个电泳纯的葡聚糖内切酶。SDS-PAGE结果表明,该酶分子量约为35kD。最适反应温度和pH分别为65℃和pH6.8,Zn2+、Pb2+、Fe3+对酶有抑制作用,Ba2+、Fe2+对酶有激活作用,在50℃,pH6.8条件下,酶对CMC-Na的米氏常数Km为0.34g/L,最大反应速度Vmax为0.17mg/(min.mL)。     

不同微量元素对斑玉蕈菌丝生长及酶活的影响

通过在PDA加富培养基和生产培养基中添加6种微量元素,探索不同条件下微量元素对斑玉蕈菌丝生长及基质降解有关酶的酶活的影响.结果表明:PDA加富培养基中添加100、60、500、100 mg·L~(-1)的微量元素Mn~(2+)、Ca~(2+)、Mo~(6+)、Fe~(2+),显著促进菌丝生长;生产培养基中添加100 mg·kg~(-1)的Fe~(2+)和Cu~(2+)对菌丝生长有明显的促进作用,添加100 mg·kg~(-1)Zn~(2+)对菌丝生长有抑制作用;生产培养基中添加100 mg·kg~(-1)的Cu~(2+)显著提高漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的酶活,其酶活分别达到39.83、19.17和9.58 U·m L~(-1).表明每种微量元素对纤维素酶和木聚糖酶酶活的影响不显著,在不同培养基中不同微量元素对斑玉蕈的菌丝生长及酶活的影响不同.     

枯草芽孢杆菌86315α-淀粉酶的研究 Ⅱ.分离提纯、性质及动力学

采用壳聚糖絮凝、淀粉吸附、乙醇沉淀等步骤,从枯草芽孢杆菌86315发酵液中提取了α-淀粉酶,然后用Sephadex G-100凝胶过滤、DEAE-纤维素柱层析进一步提纯,得到DISC-电泳一条带的α-淀粉酶制剂。用SDS-PAGE测出其分子量为54000。用等电聚焦测出其p~1为5.2。动力学实验表明:最适温度60℃;最适pH5.6;对可溶性淀粉的Km值是3.0mg/ml;Ca~(2+)、Mg~(2+)、Ba~(2+)对α-淀粉酶活性稍有激活作用;Mn~(2+)不影响酶活性;Fe~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)、Ag~(1+)、甲醛、EDTA以及戊二醛都明显抑制酶活性。该酶在50℃以下是稳定的,pH稳定范围是5.6～8.8,对60％乙醇有高度的稳定性,易被尿素变性。     

米曲霉葡聚糖酶基因(AoEGLAI)在毕赤酵母中的表达研究及其酶学特性分析

采用PTDS方法人工合成米曲霉葡聚糖酶基因(AoEGLAI),通过电击将其转化到毕赤酵母中表达,并采用DNS法对重组酶的酶学性质进行分析。结果表明:该酶耐酸但不耐热,最适反应温度为50℃,最适pH为3.0,在30—45℃和pH4—8时内切葡聚糖酶可保持90%以上酶活力,在底物CMC存在时其热稳定性有一定的提高。10 mmol/L的金属离子Cu~(2+)、Ca~(2+)、Zn~+、Gr~(3+)、Fe~(2+)和Fe~(3+)对酶有激活作用,Mn~(2+)对酶则起抑制作用。该酶对胰蛋白酶有一定的抗性,对胃蛋白酶抗性相对较差。