SRAP分子标记及其在蔬菜作物上的应用

SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism)是一种基于PCR技术的新型分子标记,具有简便、产率中等、稳定、测序方便等优点。它利用独特的引物设计对ORFs（open reading frames）进行扩增,其上游引物长17bp,下游引物长18bp,分别对外显子和内含子进行扩增,因个体不同及内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。该文在介绍SRAP标记技术和特点的同时,还对其在蔬菜作物遗传图谱构建、遗传多样性分析、比较基因组学、分子标记与基因定位等方面的应用进行了综述。     

甜椒胞质雄性不育恢复系SRAP及SCAR标记

以甜椒胞质雄性不育恢复系5-2R1和相应的保持系5-2为试材,利用SRAP分子标记技术筛选与甜椒恢复基因相关的分子标记。128对SRAP引物共扩增获得了3796条从100bp至800bp大小不同的条带,平均每对引物组合可扩增出30条清晰的条带,检测到4个多态性位点,其中恢复系材料仅有1个。对该特异片段进行回收、克隆和测序,结果表明该片段全长为259bp。经数据库比对分析表明,该片段与线粒体中的NADH脱氢酶第5亚基(GenBank:EF151914.1)具有81%的同源性;同时,该片段与辣椒BAC克隆PEPBAC 158K24(GenBank:FJ597540.1)的部分序列高度同源。根据序列特点设计特异SCAR引物,对恢复系和保持系进行扩增验证,仅在恢复系中扩增出目的条带,表明已成功地将此SRAP标记转化为简单、稳定的SCAR标记。我们推测本研究获得的SCAR标记可能与胞质雄性不育恢复性状连锁。     

苦瓜性别相关SSR和SRAP分子标记的筛选及分析

为揭示苦瓜雌雄花芽基因组间的分子差异,参照BSA法原理,构建了普通苦瓜雌雄花芽的DNA池和不同性型苦瓜雌雄花芽的DNA池,从26对SSR引物和30对SRAP引物中筛选特异引物对这些基因池进行差异性扩增。分析结果发现,两种标记分别筛选得到9对SRAP特异引物和8对SSR特异引物,引物有效率为30%和30.8%。苦瓜雌花芽和雄花芽DNA序列存在差异,SSR标记在分析普通苦瓜花芽DNA池和不同性型苦瓜花芽的DNA池时,多态性比率分别是10.7%和22.5%,SRAP的多态性比率则是7.4%和24.7%。SRAP扩增的雌性花芽的特异条带数较多,SSR分析雌雄花芽却只扩增出雄花芽的特异条带。但这些条带是否与性别表达基因紧密连锁,还需利用不同苦瓜的雌雄花芽DNA进行验证。这一研究结果为揭示苦瓜性别表达的分子机理奠定了基础。     

一个与亚洲百合无花粉性状紧密连锁的SRAP标记

为了探讨亚洲百合无花粉性状的分子遗传机制,筛选与该性状紧密连锁的分子标记,实现分子辅助选择。本研究以无花粉与有花粉亚洲百合杂交创制的F1单株为试验材料,采用BSA法,对亚洲百合无花粉性状进行SRAP标记分析。在无花粉基因池和有花粉基因池之间共筛选了108对SRAP引物组合,获得了1对在两基因池间扩增存在显著差异的引物组合EM2/ME3,并成功对两基因池间扩增出的差异片段进行回收、克隆和测序,得到了该片段375 bp的碱基序列,并将该特异标记命名为E2M3-375。     

香牙蕉与枯萎病4号小种抗性相关的SCAR分子标记开发

香蕉枯萎病是香蕉的一种毁灭性病害,采用抗病品种是控制病害的有效途径。目前香蕉抗病或耐病品种选育效率低,需要长期的田间观察和表征。分子标记辅助选择可以大大的提高传统育种的效率和准确性。香牙蕉是香蕉贸易中的主要类型,也是中国主栽的香蕉类型。本研究从100对SRAP分子标记中筛选出一对引物me9-em5,其在感病香牙蕉扩增出一条约400 bp的特异条带,抗病香牙蕉没有该条带的扩增。通过回收测序,设计并获得引物SC11-SC12,将SRAP分子标记成功转化为可以鉴定香牙蕉对枯萎病的抗感病性的SCAR标记。该标记可以鉴定本研究中涉及的香牙蕉的枯萎病抗感病性,且准确率达到96.875%。在香蕉抗枯萎病育种中具有较高的应用价值。     

山西冬小麦品种Waxy蛋白分析及分子标记研究

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法分析了山西100份小麦品种(系)Waxy蛋白的缺失类型,筛选出缺失Wx-B1蛋白亚基的材料8份。利用2个STS标记和1个SSR标记对不同Waxy蛋白缺失类型进行鉴定,验证其在分子标记辅助育种中的有效性,结果表明:Wx-7A位点的STS引物在野生型中扩增出1条450 bp的特异带,而在缺失Wx-A1蛋白亚基的突变材料中扩增出1条327 bp的特异带;Wx-4A位点的STS引物在野生型中扩增出1条440 bp的特异带,缺失Wx-B1蛋白亚基的突变材料中没有该扩增片段;Wx-7A,Wx-7D位点的SSR引物在野生型中分别扩增出1条265 bp和1条204 bp的特异带,在缺失Wx-A1和Wx-D1蛋白亚基的突变材料中没有扩增出该特异带。这3个标记可以用于分子标记辅助育种。     

红花草莓红花基因RAPD标记转化为SCAR标记

红花草莓不但具有经济价值,还具有很高的观赏价值。本研究将3个与红花基因连锁的RAPD标记即AW65679（1031bp）、S484（620bp）与S1383（500bp）进行了克隆与核苷酸测序,并根据测序结果设计4对SCAR引物,将这4对引物对红花草莓品种粉红熊猫、白花草莓品种鬼怒甘及它们的杂交后代进行PCR扩增程序优化和鉴定,筛选出一对SCAR引物可扩增出与红花基因连锁的特异片段AW65679（1038bp）,这就是与红花基因连锁的SCAR标记。SCAR标记因其稳定性好,重复性高将为草莓分子育种开辟一条新的有效途径。     

利用SRAP标记分析玉米遗传多样性

相关序列扩增多态性(SRAP)是一种基于PCR的新型分子标记技术.本研究的目的在于探讨利用该标记进行玉米种质资源遗传多样性分析和杂种优势群划分的价值及可行性.利用22对SRAP引物对16个玉米自交系进行了遗传多样性分析,共扩增出197条具多态性的条带,平均多态性信息量为0.8847,平均多态性比率为59.8%.通过聚类分析将16个自交系分为5个群,其划分结果与系谱分析基本一致.该结果表明SRAP标记是一种适合于玉米种质遗传多样性研究的分子标记.     

SRAP标记分析甘蓝型油菜多态性

采用SRAP标记对甘蓝型油菜品种1141B、垦C1、32B和32C的多态性进行了分析。每对引物组合产生13~36对比较清晰的扩增带,20对引物组合共产生419条扩增带,平均每对引物组合产生20.95条。20对引物组合共产生多态性带116条,每对引物组合产生3~10条,平均5.8条。每对引物组合产生的多态性带的比例为18.75%~38.89%,平均为28.23%。用24对引物组合对组合1141B×垦C1构建的F2群体各单株多态性进行了分析,F2群体多态性标记75条,平均为3.12条。用卡平方测验检测F2群体各单株标记基因型频率是否偏离了期望比例1∶2∶1(共显性标记)和3∶1(显性标记)的分离规律,结果表明,仅有1个SRAP标记偏离了1∶2∶1分离规律,仅占1.33%。试验结果表明,SRAP标记适于进行油菜品种的多态性分析和图谱构建,是一种经济、有效的分子标记。     

豇豆种质资源遗传多样性和亲缘关系的SRAP和SSR分析

为从分子水平上揭示豇豆种质资源间的亲缘关系,为其种质资源搜集、鉴定、利用和遗传改良提供一定的理论基础,利用SRAP和SSR分子标记对41 份来自中国和马来西亚的豇豆种质资源进行遗传多样性研究。从65 对SRAP引物和10 对SSR引物中分别筛选获得稳定清晰且多态性强的31 对SRAP引物和5 对SSR引物,对41 份栽培豇豆资源的DNA进行SRAP-PCR和SSR-PCR扩增。2 种PCR扩增共获230 条扩增条带,其中SRAP检测到196 条扩增条带,平均每对引物扩增等位基因数为6.3 条,多态性 片段为161 条,多态性比例为82.14%;SSR检测到34 条带,平均每对引物扩增等位基因数6.8 条,多肽性片段为25 条,多态性比例为73.53%,表明本研究搜集的豇豆种质间的遗传多样性比较丰富。基于SRAP 和SSR 标记的结果,利用UPGMA 构建了41 份豇豆资源的聚类树状图,其遗传相似系数为0.1667~0.9516,大多在0.674 以上。结果表明,SRAP和SSR分子标记能有效地将41 份豇豆资源分开,且部分种质间的遗传距离较远,这为豇豆资源的开发利用及新品种的选育提供科学依据。     

SRAP构建玉米杂交种指纹图谱的研究

摘 要：【研究目的】SRAP（相关序列扩增多态性）是近年来发展起来的一种新型的DNA标记技术,本文旨在探讨SRAP技术用于玉米品种鉴定的可行性,并建立相应技术体系。【方法】采用25个引物组合对19个玉米杂交种进行了SRAP扩增。【结果】19个引物组合扩增出了多态性条带,共扩增出152条多态性条带,平均每个引物组合产生8条多态性带,多态性频率从44.4%（me4/em3）～91.7%(me4/em1)。19个引物组合检测到的平均PIC为0.879,而引物组合me4/em1可区分供试的所有19个玉米品种。进一步筛选了5对引物,构建了供试材料的指纹图谱,为SRAP用于玉米鉴定奠定了基础。【结论】SRAP具有很高的分辨率,而且操作简便、稳定可靠,具备了用于作物品种鉴定的条件,用于玉米品种鉴定是可行的,可作为SSR技术的重要补充。     

利用SRAP标记分析彩色棉与白色棉的遗传差异

利用SRAP分子标记技术对彩色棉遗传多样性进行研究,应用NTSYS软件对30种供试棉花材料的SRAP-PCR结果进行分析,从中筛选得到29对条带清晰的多态性引物,共产生1067条清晰条带,多态性条带132条,平均每个引物组合得到4.55条多态性条带。聚类分析29对引物组合的扩增结果,Jaccard’s相似系数在0.5405-0.9109之间,利用SRAP标记可以判明彩色棉和白色棉的遗传差异,可有效地应用于彩色棉的遗传多样性及亲缘关系的研究。     

结缕草属植物杂交后代的SRAP分子标记鉴定

相关序列扩增多态性（sequence—related amplified polymorphism,SRAP）是基于PCR技术的一种新型分子标记技术。本文通过SRAP分子标记技术对结缕草属植物种间杂交的5个组合44份杂交后代进行了真假杂种的鉴定,拟为杂交后代的进一步研究奠定基础。首先通过5个杂交组合的亲本材料分别筛选10对SRAP引物组合,然后应用具有父本特征带的多态性引物组合对各个杂交组合亲本及其所有后代进行PCR扩增、电泳。结果表明,5个杂交组合的44个杂交后代中有39个后代具有父本特征带,被鉴定为真杂种,其余5个后代因不具有父本特征带,被鉴定为自交种。杂种真实性的鉴定结果为杂交后代的进一步研究及应用奠定了良好的基础,本研究结果也表明SRAP分子标记技术是比较稳定可靠的标记系统,可有效应用于结缕草属植物杂种真实性的鉴定和遗传分析。     

陆两优996种子纯度的SRAP指纹图谱鉴定

利用270对SRAP引物对陆两优996和2个亲本的DNA指纹图谱，获得能在父、母本间表现出多态性的特异SRAP标记引物有54对，其中差异性条带136个。利用Me3Em8引物，条带在杂交种完全互补，对200株样本进行了纯度鉴定，结果鉴定纯度为97.50%，与田间种植鉴结果97.50%(海南鉴定)一致，表明SRAP标记技术适用于种子纯度鉴定。     

龙眼SRAP反应体系的建立和优化

采用分步优化的方法对影响龙眼SRAP-PCR反应的模板DNA用量、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、TagDNA聚合酶用量等进行了研究。确立了适合龙眼SRAP分析的反应体系,即体系总体积25μl,包含1×PCR Buffer ,Mg2+ 2.0mmol/L,dNTPs 0.5 mmol/L,引物0.3μmol/L,模板DNA 10ng, TaqDNA聚合酶1.5 U。结果表明,该体系能很好地满足龙眼基因组SRAP扩增的要求,SRAP标记应用于龙眼遗传研究是可行的。     

木薯SRAP扩增体系的建立与优化

建立适宜木薯DNA的SRAP扩增体系,为木薯分子标记和基因图谱的构建打下基础。以木薯基因组DNA为模板,采用序列相关扩增多态性(sequence related amplified polymorphism,SRAP)技术对木薯DNA进行PCR扩增,逐级优化反应参数。最佳SRAP-PCR反应体系(10Ll)为：DNA (50ng/μl) 0.5μl、10×PCR buffer (Mg2+) 1.0μl、dNTPs (20mM) 0.2μl、primer (50ng) 0.3μl、Taq polymerase (5U/μl) 0.2μl。该程序和体系能很好地满足木薯基因组SRAP扩增的要求,SRAP标记能够很好应用于木薯遗传研究。     

Genetic diversity and population structure of four Iranian alfalfa populations revealed by sequence-related amplified polymorphism (SRAP) markers

In the present study, genetic diversity of 48 individual plants from four Iranian cultivated populations of alfalfa (Medicago sativa L.) was evaluated using sequence-related amplified polymorphism (SRAP) markers. Fourteen SRAP primer combinations produced 193 fragments of which 95 were polymorphic. The number of polymorphic fragments detected per primer combination ranged from 3 to 10 bands with an average of 6.78 bands. Average polymorphic information content (PIC) was 0.343 for all primer combinations. Although the AMOVA (analysis of molecular variance) results showed a significant difference in the genetic diversity among the populations (P < 0.0001), the genetic variation mainly caused by the variation of intra population accounted for 93.17% of the total genetic variation. Unweighted pair-group method arithmetic average (UPGMA) analysis of the marker data clearly separated the populations of subtropical (Yazdi) and semi-cold (Hamadani and Nikshahri) as well as Kodi, an improved population. It can be concluded that SRAP markers are useful for studying diversity and relationships among and within alfalfa populations.     

7个粳稻SSR和SRAP分子标记遗传距离比较及其与产量性状杂种优势的关系

本研究选用产量性状有显著差异的7个粳稻品种,按照Griffing双列杂交方法Ⅳ配制21个杂交组合,用SSR和SRAP分子标记分析亲本遗传距离及其与粳稻产量性状杂种优势问的关系,并比较分析两种分子标记在估算遗传距离时的差别.结果表明,每对SSR引物产生1～11条多态性带,平均3.8条,而每对SRAP引物组合产生1～15条多态性带,平均5.2条.SRAP引物所扩增的条带数和多态性何点数分别是SSR引物的3.3倍和1.3倍.两种分子标记对遗传相似系数较小的品种进行聚类分析时可获得一致的结果,但对遗传相似系数较大的品种进行聚类分析时所得结果并不一致;粳稻产量性状杂种优势的表现大小因件状和杂交组合不同而异;F_1杂种产量性状的表现与亲本自身的性状特点和互补关系密切,用SSR和SRAP分子标记遗传距离难以预测粳稻杂种后代的产量表现和杂种优势强弱.