利用SSR分子标记技术揭示"硬粒小麦-节节麦"人工合成六倍体小麦的遗传差异

为引入小麦近缘属种的优良基因和遗传变异、扩宽普通小麦的遗传基础,本文选用36对小麦A,B和D基因组的微卫星引物,对135份人工合成六倍体小麦的遗传多样性进行了评价。36对引物共检测到193个等位变异,每个位点等位变异数在2~14个之间,平均每个位点检测到5.36个等位变异;A,B和D 3个基因组检测到的等位变异数D>A>B,遗传多样性指数D>A>B。综合平均遗传丰富度和香浓指数两个指标分析结果表明,人工合成六倍体小麦第1和6同源群遗传多样性水平较高,第4和7同源群遗传多样性水平较低;21条染色体中,6D和2D染色体的遗传多样性最高,7D和4B染色体的遗传多样性最低。135份人工合成六倍体小麦遗传相似系数在0.36~0.85之间,平均遗传相似系数A>B>D基因组。人工合成六倍体小麦变异类型丰富,是改良普通小麦的重要基因资源。     

小麦TaSnRK2.10的多态性及与农艺性状的关联

【目的】蔗糖非发酵蛋白激酶（SnRK）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物信号传递途径中发挥着重要作用。研究小麦TaSnRK2.10的多态性,开发其功能标记,并进行标记-表型性状关联分析,为利用分子标记进行遗传改良和种质创新提供依据。【方法】以30份多态性较高的六倍体普通小麦及其野生近缘种的二倍体和四倍体为材料,通过测序分析TaSnRK2.10-A的序列多态性;利用中国春缺-四体材料对该基因进行染色体定位;利用RIL群体（偃展1号×内乡188）对基因进行遗传定位;根据TaSnRK2.10-A序列多态性,开发分子标记,以262份普通小麦构成的自然群体为材料分析基因单倍型与表型性状的关联特性。【结果】克隆了小麦TaSnRK2.10的A、D基因组序列,在由30份多态性较高的小麦材料组成的自然群体中,没有检测到来自D基因组的TaSnRK2.10-D序列多态性;TaSnRK2.10-A全长4 688 bp,包括启动子1 934 bp、5′-UTR 343 bp、编码区2 319 bp及3′-UTR 92 bp。在基因全长序列中共检测到15个SNP、2个InDel。其中,启动子区有8个SNP,5′-UTR有2个,编码区有5个。位于编码区的5个SNP中,2个存在于外显子,其中一个是非同义突变。2个InDel均位于编码区。根据序列多态性分别设计了启动子区的分子标记PM1和PM2,以及基因编码区的分子标记GM1和GM2。利用中国春缺-四体材料将TaSnRK2.10-A定位于小麦染色体4A,利用RIL群体将TaSnRK2.10-A定位在染色体4A的标记Xwpt7001和WMC48之间,与2个侧翼标记的遗传距离分别为5.1 cM和25.7 cM。利用开发的4个分子标记,将自然群体的262份材料分为4种单倍型,分别与千粒重、单株穗数和每穗小穗数显著相关或极显著相关,HapⅡ和HapⅢ是提高千粒重的优异单倍型。4 184 bp位点为C时,为高千粒重的优异等位变异。【结论】小麦TaSnRK2.10-A位于染色体4A。HapⅡ和HapⅢ是提高千粒重的优异单倍型,HapⅣ是提高单株穗数的优异单倍型,4 184 bp位点的胞嘧啶（C）是优异等位变异。     

小麦‘Fielder’ ω-醇溶蛋白基因及启动子的克隆与序列分析

为研究六倍体小麦中ω-醇溶蛋白基因簇的启动子差异,以普通小麦品种‘Fielder’为试验材料,利用同源克隆的方法,克隆ω-醇溶蛋白基因的编码区和启动子序列,并进行生物信息学相关分析。结果表明:1)共克隆得到11条不同的基因序列(MN441496～MN441506),其中6条(MN441496～MN441497和MN441503～MN441506)编码ARE/Q型ω-醇溶蛋白,5条(MN441498～MN441502)编码SRL型ω-醇溶蛋白。2)ARE/Q型ω-醇溶蛋白基因编码区长度范围在972～1 158bp,SRL型ω-醇溶蛋白基因编码区长度范围在1 303～1 419bp,这种差异主要由中间重复区的Indel类型和数量不同造成。3)ARE/Q型ω-醇溶蛋白基因启动子在-300bp含有1个典型的endosperm box,而SRL型ω-醇溶蛋白基因启动子在-300和-600bp处各含有1个endosperm box。这些ω-醇溶蛋白基因启动子上的差异,可能引起表达水平的差异。     

小麦TaGA20ox2基因的克隆及分析

 【目的】克隆小麦中的GA20-氧化酶基因并进行遗传定位,为深入研究小麦中的GA20-氧化酶基因作用机理奠定基础,同时为改良小麦的重要农艺性状提供理论依据。【方法】采用同源克隆结合BAC文库筛选的方法克隆基因,利用中国春缺失体以及国际作图群体对该基因进行遗传定位。【结果】从普通小麦中国春中分离得到TaGA20ox2的gDNA与cDNA序列,利用中国春缺失体材料将TaGA20ox2定位于3A、3B、3D染色体上,序列分析表明分别位于3A、3B、3D染色体上的TaGA20ox2-A1、TaGA20ox2-B1和TaGA20ox2-D1与水稻GA20ox2为直向同源基因,具有GA20ox2家族保守结构域;利用国际作图群体W7984×Opata85将位于3D上的基因TaGA20ox2-3定位于xfba330与xgwm664标记之间。【结论】分离获得小麦中分布于第三同源群的GA20ox2;分子标记结果结合QTL作图信息可以初步推测TaGA20ox2-3在小麦中可能是控制株高的基因。     

小麦抗旱相关基因TaCRT-D单核苷酸多态性分析

 【目的】钙网蛋白（CRT）是细胞内质网膜上的钙结合蛋白,参与多种细胞功能的调节。研究小麦钙网蛋白基因TaCRT-D单核苷酸多态性,并分析其与抗旱性的关系。【方法】以苗期抗旱性不同的37份六倍体普通小麦和3份普通小麦D基因组供体种粗山羊草为材料,通过直接测序分析TaCRT-D基因的单核苷酸多态性（SNP）及其与抗旱性的关系。【结果】TaCRT-D基因DNA长度为4 001 bp,在长达160 040 bp的核苷酸序列中共检测到105个单核苷酸变异位点,包括84个SNP和21个InDel,二者出现的频率分别为1/1 905和1/7 621,编码区的核苷酸多样性值（π）小于非编码区,说明编码区所承受的选择压力较大,遗传变异小于非编码区。单倍型分析表明,40份供试材料分为8种单倍型,其中单倍型H1中11份材料包括4份中等抗旱材料和7份干旱敏感材料;单倍型H3、H4和H7既有抗旱性强的材料也有干旱敏感材料;单倍型H5只包括3份小麦D基因组供体种材料。【结论】普通小麦TaCRT-D基因中SNP频率较低,TaCRT-D基因单核苷酸多态性与小麦苗期抗旱性之间没有明显的对应关系。     

小麦TaDREB1基因的单核苷酸多态性分析

 TaDREB1是一种转录因子，调控抗旱等抗逆相关基因的表达。以抗旱性不同的20份六倍体小麦和3份小麦的二倍体近缘种为材料，用直接测序法筛查TaDREB1基因DNA序列的单核苷酸多态性，在23份材料的38 038bp序列中发现了271个SNP和14个InDel，平均140 bp中有1个SNP，2 717 bp中有1个InDel。核苷酸多样性（Л）分析表明，小麦二倍体近缘种的Л值（0.02188）明显大于六倍体小麦的Л值（0.01029），说明该基因在二倍体种中的变异程度大于六倍体小麦，可能原因是六倍体小麦长期承受强大的人工选择压力。单倍型分析揭示了TaDREB1基因单核苷酸多态性与抗旱性表型的相关性，但同时也发现在个别单倍型里既有抗旱型材料又有对水分比较敏感的材料，揭示了抗旱性的复杂性，说明仅用TaDREB1基因的单核苷酸多态性还不能完全解释抗旱性复杂的表现型。     

TAPHS1基因序列多态性与小麦生殖发育稳定性的相关分析

TAPHS1基因是MFT-like基因,可调控小麦成熟期的籽粒休眠(影响穗发芽抗性)且与开花的发育控制相关,位于小麦3A染色体短臂上。为探究该基因序列多态性与小麦生殖发育稳定性的关系,设计PCR引物扩增TAPHS1基因的2个高频变异区,获得86个品种相应基因区段的DNA序列信息;以不同播期之间抽穗期相差时间为指标调查评价各品种的生殖发育稳定性。结果表明:在TAPHS1基因的高频变异区存在5种多态性,将其命名为A类、B类、C类、D类、E类;A类、B类、C类属非编码区多态性,D类及E类同时涉及编码区和非编码区多态性;D类及E类序列多态性与生殖发育稳定性相关,并根据D类序列信息开发了分子标记。     

鹅Apo A1,CD36和DGAT2基因的cDNA克隆与序列分析

利用RACE技术,克隆获得了鹅Apolipoprotein A-1(Apo A1),Fatty acid translocase(CD36)和Diacylglycerol O-acyltransferase 2(DGAT2)基因的c DNA序列,包括全长的编码区序列(coding sequence,CDS)。结果表明,获得的鹅Apo A1基因的c DNA序列长度为1 106 bp(Gen Bank accession:KF460562),包括135 bp的5’UTR(untranslated region,UTR)序列,795 bp编码区和176 bp的3’UTR序列,编码265个氨基酸。获得的鹅CD36基因的c DNA序列长度为2 262 bp(Gen Bank accession:KF460563),包括196 bp的5’UTR序列,1 416bp编码区和650 bp的3’UTR序列,编码472个氨基酸。获得的鹅DGAT2基因的c DNA序列长度为1 341 bp(Gen Bank accession:KF460564),包括93 bp的5’UTR序列,1 077 bp编码区和171 bp的3’UTR序列,编码359个氨基酸。同源性分析结果表明,鹅这3个基因c DNA与鸭的同源性最高,达到90%以上,与人等哺乳动物的同源性均较低。     

大麦幼穗MLOC-14401基因编码区的同源克隆和序列分析

【目的】编码区序列是基因作用机制、遗传多样性和进化关系等研究的重要资源。【方法】以盐城红茎大麦、青田红大麦、淳安六棱胭脂大麦和北青7号为材料,采用同源克隆技术分离、克隆MLOC-14401基因CDS序列,利用ORF Finder、BLAST和Clustal X等软件分析所克隆的CDS序列。【结果】MLOC-14401基因CDS序列全长1 248 bp、包含3个外显子、GC含量为62.82%,位于大麦3H染色体的609 892 778~609895 303 bp区间,起始密码(ATG)和终止密码序列(TAA)分别位于119 bp和1 366 bp位点。所编码多肽链包含415个氨基酸、2个MYB结构域,与普通小麦等9个物种的MYB基因编码多肽链具有不同程度的氨基酸序列相似性,保守序列位于105氨基酸与237氨基酸之间。【结论】MLOC-14401基因属大麦转录调控基因R2R3-MYB,所克隆的CDS序列对于大麦MYB基因作用机制等研究具有一定指导作用。     

高亲和力玉米转磷蛋白基因B103-Zm5473电子克隆及其生物信息学分析

采用电子克隆技术,从玉米自交系B103中克隆出1个高亲和力转磷蛋白基因B103-Zm5473。测序及生物信息学分析结果表明:从B103中克隆的目标DNA序列长度为2 218bp,包含1 608bp构成的开放阅读框(ORF),编码由535个氨基酸组成的蛋白;与玉米标准基因组上注释的基因GRMZM2G045473相比,在DNA序列上存在1个碱基差异,但所编码的蛋白完全相同。生物信息学分析结果表明:来自B103的目的基因编码的B103-Zm5473P蛋白含有转运蛋白FMS超基因家族的高亲和力转磷蛋白Pht1家族蛋白的特征序列GGDYPLSxxIxSE,具有由12个跨膜区和13个亲水区;在13亲水区中,包括N-末端亲水区和C-末端亲水区在内的7个亲水区伸入细胞内部,另外6个亲水区伸出细胞的外部,在第6和第7跨膜区之间存在1个大的亲水区的特征。故该研究中克隆的基因B103-Zm5473,初步推断为Pht1家族的高亲和力转磷蛋白基因。     

小麦细胞分裂素氧化/脱氢酶基因（TaCKX5）的克隆及其染色体定位

【目的】克隆小麦的TaCKX基因并对其序列进行生物信息学分析,明确TaCKX基因在小麦基因组中的分布情况,以期为今后深入研究小麦CKX基因以及利用该基因进行小麦重要农艺性状的遗传改良奠定基础。【方法】采用同源克隆结合BAC文库筛选的方法克隆基因,通过小麦缺体-四体对其进行染色体定位。【结果】从普通小麦中国春中分离得到TaCKX5基因的gDNA和cDNA序列。分析表明,TaCKX5基因的开放阅读框为1 596 bp,编码531个氨基酸,含有CKX基因家族典型的功能位点FAD-binding domain,预测属于分泌蛋白,并具有糖基化位点。使用中国春缺体-四体将TaCKX5定位于小麦第三同源群。系统发育分析表明,CKX基因在植物中较为保守,禾谷类作物中直向同源的CKX基因很可能具有相似的特性与功能。【结论】分离获得了普通小麦TaCKX5基因全长,TaCKX5分布于小麦染色体3A、3B、3D上,与水稻OsCKX5基因直向同源。     

新疆冬小麦地方品种高分子量麦谷蛋白亚基的地理分布及其新发现亚基的特性

[目的]和方法]为了揭示新疆小麦地方品种高分子量谷蛋白亚基( HMW - GS)的遗传多样性,对新疆北部地区(北疆)、东部地区(东疆)和南部地区(南疆)小麦地方品种HMW - GS的分布进行了研究.[结果]研究表明:新疆小麦地方品种HMW - GS等位变异的分布与其地理来源具有密切关系,除Glu - B1位点外,Glu -A1和Glu - D1位点等位变异在北部地区、东部地区和南部地区的分布频率存在显著差异.在Glu - A1位点,Glu - A1c编码的亚基出现的频率最高,其次是Glu - A1b编码的2*亚基;但在北部地区,几乎所有品种都含有Glu -A1c编码的亚基,仅有1个品种含有Glu-A1b编码的2*亚基.在Glu - B1位点,新疆大多数小麦地方品种含有Glu -B1b编码的7+8亚基.在Glu - D1位点,新发现的等位基因Glu -D1bp(t)编码的2.6亚基在东疆和南疆出现的频率较高,但在北疆出现的频率最低,分别为91;(东疆),61;(南疆),19;(北疆);等位基因Glu - D1bp(t)在南疆冬小麦地方品种中普遍存在.然而,北疆是以等位基因Glu - D1a编码的2+12亚基为主,其频率为83;.关于Glu - D1bp(t)的起源,推测可能是在南疆地区自然突变产生,然而由于南疆和东疆荒漠化造成的地理阻碍使其向北疆传播的概率较低,同时抑制了该基因向东亚地区的迁移.[结论]基于DNA序列的氨基酸序列比对,发现Glu -D1bp(t)编码的2.6亚基与Glu - D1al编码的2.2*亚基非常相似.     

绵羊LDHAL6A基因的电子克隆与生物信息学预测

以人LDHAL6A基因的cDNA序列为探针,利用生物信息学方法,对绵羊LDHAL6A基因进行了电子克隆,并对推导出LDHAL6A基因编码的蛋白结构与性质进行了预测。结果表明：绵羊LDHAL6A基因的cDNA序列全长为1798bp,包括999 bp的编码区和149bp的5ˊ非翻译区（5ˊUTR）、650 bp的3ˊ非翻译区序列（3ˊUTR）,编码合成332个氨基酸的多肽;其编码蛋白属疏水性蛋白,不存在信号肽及跨膜结构,定位于内质网上;无规则卷曲、琢-螺旋是绵羊LDHAL6A蛋白主要的二级结构元件。绵羊LDHAL6A基因编码蛋白可能在精子生成过程中起重要作用。     

小麦TaPAT1-2D基因的克隆与表达分析

GRAS(GIBBERELLIN-INSENSITIVE, repressor of ga1-3 and SCARECROW)基因家族作为重要的植物转录因子在调控植物生长发育、抵抗逆境胁迫的各种信号转导途径中发挥重要作用。为进一步挖掘该家族小麦抗赤霉病相关基因,从禾谷镰刀菌诱导的小麦转录组测序数据筛选出差异表达基因TaPAT1-2D(TraesCS2D02G198200.1),克隆该基因的全长序列,并对其进行生物信息学和表达模式分析,以及亚细胞定位和酵母转录激活活性研究。生物信息学分析结果表明：TaPAT1-2D序列全长1 668 bp,编码555个氨基酸,分子量约为61.34 ku; TaPAT1-2D蛋白含有典型GRAS功能结构域,在进化关系上与水稻OsCIGR2(LOC＿Os07g39470.1)关系较近;TaPAT1-2D启动子区包含茉莉酸甲酯、脱落酸、生长素等植物激素响应元件与光应答元件等。实时荧光定量PCR结果显示,接种禾谷镰刀菌孢子液72 h后,TaPAT1-2D基因在4个不同赤霉病抗性小麦品种中的相对表达水平明显上调,表明该基因参与赤霉病的响应过程。农杆菌介导的烟草中瞬...     

乌骨绵羊NR5A2基因编码区序列克隆及特征分析

为了研究NR5A2基因在乌骨绵羊中的序列特征,利用PCR和克隆测序技术获得乌骨绵羊NR5A2基因的外显子序列,用DNAMAN软件和DNAStar软件对序列进行比对和拼接、运用Clustal软件与其他物种相应序列进行同源比对分析,MEGA5.1软件用来构建哺乳动物NR5A2蛋白质系统进化树,用DNA池方法对其编码区序列的SNPs位点进行筛选。结果显示:乌骨绵羊NR5A2基因编码区全长1 488 bp,共编码495个氨基酸;乌骨绵羊的NR5A2基因编码区核苷酸序列与湖羊和牛的同源性分别为99.87%和85.51%;氨基酸序列的一致性分别为99.41%和89.66%。与湖羊相比,乌骨绵羊NR5A2基因编码区共发现3个单碱基突变(C1069A、C1419T和G1485A),其中C1069A位点突变引起了氨基酸的改变,从亮氨酸变为异亮氨酸。在乌骨绵羊的编码区现了一个单核苷酸突变位点G999C。     

民猪CIRP基因的克隆与冷诱导研究

采用生物信息学结合RT-PCR的方法,克隆民猪的冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducible RNA-binding protein,CIRP)基因,获得3个变异体序列。猪CIRP变异体1基因cDNA长1 278 bp(GenBank登录号:HQ908794),编码172个氨基酸;变异体2基因cDNA长1 653 bp(GenBank登录号:HQ908795),编码182个氨基酸;变异体3基因cDNA长1 765 bp(Genbank登录号:HQ908796),编码144个氨基酸。CIRP变异体2与变异体1相比,在其编码区的第501碱基处,出现了一段375 bp的插入片段,该插入片段的第46～48个碱基为TAG,使翻译提前终止;变异体3与变异体2相比,在其编码区的第428碱基处,出现一段115 bp插入片段,该插入片段的第5～7个碱基为TGA,使翻译提前终止。3种转录变异体的核苷酸序列同源性为86.45%,氨基酸序列同源性为87%。冷诱导后,CIRP基因在肌肉中的表达水平出现显著升高(P<0.05)。     

澳冰草中一个新型α-gliadin基因的克隆与序列分析

以澳冰草(Australopyrum retrofractum)基因组DNA为模板,用小麦种子醇溶蛋白的保守引物进行PCR扩增,对扩增产物进行克隆测序。结果表明,获得的扩增片段总长度为936 bp,包含一个完整的262个氨基酸的编码区,基因库登录号为EF536330,序列比对表明该序列为α-gliadin基因家系成员。利用α-gliadin基因的编码氨基酸序列建立系统树分析表明,序列EF536330不能与源于普通小麦的A、B和D染色体组的α-gliadin基因序列聚在一起,而单独聚为一类,推测所获得的来自澳冰草W染色体组的序列EF536330为麦类α-liadin基因家系的新类型。     

小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基基因TaBβ-1的克隆及其在非生物胁迫下的表达特性

【目的】克隆小麦蛋白磷酸酶2A(PP2A)调节亚基(PR55)基因TaBβ-1,分析其在非生物胁迫下的表达特性,为小麦抗逆育种提供候选基因。【方法】以小麦品种旱选10号为材料,通过电子克隆和RT-PCR获得TaBβ-1的全长cDNA序列,采用生物信息学软件分析TaBβ-1及其编码蛋白TaBβ-1的序列特征,预测其功能,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术分析该基因在小麦孕穗期不同组织中、不同生育时期新叶中的表达情况,以及在PEG、NaCl、低温及外源激素ABA等非生物胁迫下的表达模式,检测不同水分条件下成株期转基因拟南芥的叶片细胞膜稳定性。【结果】获得TaBβ-1的全长cDNA序列1931bp,其开放阅读框(ORF)为1539bp。该基因编码512个氨基酸,预测TaBβ-1蛋白分子量为57.1kD,等电点为5.87,含有PP2A调节亚基的1个CDC55保守结构域、1个alpha/beta结构域、2个PR55保守结构域和6个WD重复子。TaBβ-1在小麦孕穗期的根、穗、叶中均有表达,表达量依次为根穗叶;在不同生育时期的新叶中,苗期叶片的表达量最高。TaBβ-1的表达明显受PEG、NaCl、低温以及外源ABA的诱导。【结论】小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基家族基因TaBβ-1在小麦苗期叶片中的表达量明显高于根、穗以及其它时期的叶片;TaBβ-1参与对高渗、高盐、低温等多种胁迫以及ABA处理的应答反应,但表达模式不同;在水分胁迫条件下,转基因拟南芥比野生型具有较高的细胞膜稳定性。     

绒山羊RORα基因2种亚型的结构与进化分析

为深入研究绒山羊RORα基因的结构及功能,利用cDNA末端快速扩增法（RACE）结合转录组获得了绒山羊（Capra hircus）维甲酸相关孤核受体（retinoic acid receptor-related orphan receptorα,RORα）基因的2个亚型:RORα1和RORα2（GenBank登录号分别是HM₀61155和HM₃58053）。序列分析表明,RORα1序列全长1 620bp,包括5′端非翻译区（untranslated region,UTR）29bp、3′端非翻译区211bp和开放阅读框（open reading frame,ORF）1 380bp,共编码459个氨基酸,分子质量约为52.3ku,理论等电点6.25。RORα2序列全长1 694bp,包括5′UTR 76bp、3′UTR 211bp和ORF 1 407bp,共编码468个氨基酸;与人RORα4的长度相同,相似性达99%,分子质量约为53.4ku,理论等电点为6.37。结果显示:1)RORα1氨基酸序列缺少大多数核受体具有的调节区（A/B区）,预测的二级结构少一个β-折叠基序（YFV）;2)RORα的DNA结合区到配体结合区部分属于纯化选择,A/B区在长度和序列方面变异都很大。     

人工合成小麦RSP的LMW-GS基因克隆

 RSP是用抗穗发芽的节节麦与圆锥小麦合成的人工六倍体小麦Triticum turgidum-Aegilops tauschii），其抗穗发芽特性在维持小麦面粉加工品质方面有着潜在的重要价值。为了了解其低分子量谷蛋白这一对小麦加工品质有直接重要影响的蛋白组分情况，本研究采用PCR法从合成小麦RSP中克隆得到3个低分子量谷蛋白亚基（LMW-GSs）基因，命名为LMWRSP-1、LMWRSP-2和LMWRSP-3。基因序列GenBank登录号分别为AY676681、AY676682和AY676683。其中，LMWRSP-1和LMWRSP3的编码区长度分别为825 bp和915 bp，可分别编码274和304个氨基酸。LMWRSP-2由于在编码区内有1个提前终止密码子，推测为不编码成熟蛋白的假基因。与已知LMW-GS基因进行比较发现，LMWRSP-1与Glu-A3位点基因的相似性最高，LMWRSP-3与Glu-D3位点的基因相似性最高。