Isolation and Identification of the Arthritis Pathogen from Dairy Cow

This study was aimed to avoid the dairy cow arthritis,which could caus huge economic losses to cattle farms.Joint effusion was collected from diseased dairy cows,and the pathogens was isolated and cultured using tryptone broth agar followed by morphological,biochemical tests and PCR amplifying 16S rRNA gene fragments and TA cloning and sequencing to identify it.It was found that the bacteria could form beta hemolytic ring on blood AGAR;And it appeared a single individual or short catenation gram-positive by optical microscopy;The results of biochemical identification showed that esculin sesquihydrate,maltose,sucrose,glucose,and hydrogen peroxide enzyme tests all presented positive;It was sensitive to cefazolin,enrofloxacin,ciprofloxacin,ampicillin,streptomycin,chloramphenicol,neomycin and cefepime,while was resistant to tetracycline,erythromycin,doxycycline and amikacin.The nucleic acid homology of this strain with Staphylococcus aureus was 91%,and with the Staphylococcus carnosus was 92%.According to the 16S rRNA gene fragment sequencing results,and the biological characteristics analysis,the initial isolates were identified as similar to Staphylococcus spp bacteria.The results of this study could provide necessary experimental basis for future diagnosis,prevention as well as treatment of arthritis in cattle farm.     

云南猪关节炎细菌性病原的分离鉴定

本试验旨在了解云南4个猪场猪关节炎的细菌性病因及其耐药性.通过分离培养、生化试验、药敏试验、动物致病性试验及16S rRNA鉴定,对4个猪场出现猪关节炎症状的样品进行了分析.结果显示,A、B、C和D 4个猪场共96份样品中,检出金黄色葡萄球菌55份,阳性率分别为20.8%、83.3%、91.7%和33.3%;检出链球菌56份,阳性率分别为95.8%、21.7%、25.0%和83.3%;混合感染阳性率分别为20.8%、21.7%、25.0%和33.3%.因此,金黄色葡萄球菌是导致B、C两猪场猪关节炎的主要细菌性病原;链球菌是导致A、D两猪场猪关节炎的主要细菌性病原;两种细菌对菌必治、米诺环素和环丙沙星较敏感,对多种抗生素产生了耐药性.     

1株奶牛源松鼠葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析

为确定奶牛垫料中是否含有病原菌并深入了解垫料中优势生长菌的类型、耐药性及致病性等情况,本试验进行了细菌分离培养、革兰染色镜检、生化试验鉴定、16S rDNA序列分析及同源性比对、药敏试验、小鼠致病性试验。结果显示,分离菌在普通营养琼脂平板上形成圆形、表面光滑的白色菌落,血琼脂平板上形成黏稠、较大的白色菌落。革兰染色镜检结果显示,分离菌为革兰阳性,球型,呈葡萄串状排列,或单个散落。生化试验结果显示,分离菌对木糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、硝酸盐还原等呈阳性反应,而蜜二糖、木糖醇、山梨醇、尿素、V-P反应等呈阴性反应。16S rDNA序列分析结果显示,扩增的16S rDNA序列长度为1 298 bp,与松鼠葡萄球菌的核苷酸同源性达99.85%~100%;系统进化树结果显示,分离菌与松鼠葡萄球菌处于同一分支。动物试验结果表明,分离菌株对试验小鼠有较强的致病性,以0.2 mL/只（7.9×10⁸ CFU/mL）菌液的剂量接种小鼠,在48 h内死亡率为60%（3/5）。药敏特性分析结果显示,分离菌株对复方新诺明、氨苄西林等7种药物敏感,对克林霉素、头孢噻肟和头孢呋辛中度敏感,对青霉素、红霉素和林可霉素耐药。本研究为奶牛源松鼠葡萄球菌的分离鉴定及防控提供了参考依据。     

锦鲤溃疡病病原菌的分离及16SrRNA鉴定

为寻找引起养殖锦鲤(Ornamental carp)病害的致病因子,从北京地区自然患病的锦鲤体内分离疑似致病菌,再将此菌人工感染健康锦鲤,确定致病菌。采用生理生化鉴定与16S rRNA基因序列的系统发育学分析相结合的方法确定该致病菌株的系统发育地位,同时采用琼脂扩散法测定该菌对抗菌类药物的敏感性。试验结果表明,从病鱼体内分离得到革兰氏阴性杆菌CL0901,人工感染健康锦鲤后,能够引起鱼生病甚至死亡,症状与自然发病症状一致。菌株CL0901与Aeromonas veronii ATCC 35624T的16S rRNA基因序列相似性达99.9%,构建系统发育树,并结合形态特征与生理生化测定结果,将该致病菌鉴定为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。在21种抗菌类药物对该菌的抑菌试验中,左氧氟沙星、诺氟沙星和洛美沙星等10种药物的抑菌效果较好。本研究为进一步防制锦鲤养殖病害提供依据。     

奶牛隐性乳房炎病原菌的分离鉴定

为了解河北省昌黎县某奶牛场荷斯坦奶牛隐性乳房炎的主要致病菌,随机无菌采集29头奶牛乳样,做细菌分离培养,37℃培养24 h后观察细菌生长状况,对细菌经革兰染色镜检、生化试验等实验室检查,确定引起该牛场引发隐性乳房炎的致病菌。结果表明,葡萄球菌为50.54%,链球菌为20.87%,杆菌为28.57%,认为葡萄球菌是引发该牛场隐性乳房炎的主要致病菌,且以金黄色葡萄球菌为主。     

经久不愈奶牛临床型乳房炎病例的病原菌分离鉴定

为了研究全身及局部应用抗生素治疗临床型乳房炎后病原菌的构成及比例,本试验对全身及局部灌注治疗后仍未痊愈的奶牛进行基本信息汇总并对乳样中病原菌进行形态学分离鉴定及16S r DNA基因序列分析。结果表明,经过治疗仍可分离到大量大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及绿脓假单胞菌等易产生耐药性的细菌。本试验为临床上经久不愈的乳房炎病例的治疗提供了参考方法。     

广西猪丹毒杆菌分离鉴定及生物学特性研究

试验收集2013年6月至2014年2月广西南宁、桂林、柳州、玉林、贵港、钦州等6个市送检的疑似猪丹毒发病的材料,用鲜血琼脂平板对病料进行细菌分离,37℃恒温箱培养24~48 h,观察分离细菌的菌落形态,并进行革兰氏染色观察,初步确定其为革兰氏阳性的细小杆菌。为进一步确定分离出的是否为猪丹毒杆菌,试验进一步纯化细菌,提取细菌DNA用16S rRNA随机引物进行扩增,将扩增出来的目的片段连接到p MD18-T载体上,进行克隆、酶切鉴定及序列测定;最终将测序获得16S rRNA序列在NCBI上进行BLAST,结果表明试验最终分离出5株猪丹毒杆菌,为进一步确定分离出来猪丹毒杆菌的生物学特性,试验做了进一步深入研究：药物敏感性试验、小白鼠攻毒试验、耐药基因的检测、免疫攻毒保护性试验。     

奶牛乳房炎无乳链球菌的分离及PCR鉴定

利用THB(Todd-Hewitt Broth)固体培养基和色素试验培养基选择培养无乳链球菌,参照GenBank中无乳链球菌参考菌株(Accession:AF015927.1、JQ289582.1)16SrRNA和种属特异性基因cfb(CAMP因子)序列设计引物,对奶样中分离的12株疑似无乳链球菌进行鉴定。结果显示,经PCR扩增后,被检测的12株细菌均可扩增出预期大小的16S rRNA基因序列,而12株中有8株可以扩增出预期大小的cfb基因序列,条带单一,特异性好。序列BLAST显示,12株菌的16S rRNA基因序列与NCBI上报道的无乳链球菌相应序列高度同源(>99.0%),各分离菌株间的16S rRNA基因序列也高度同源(99.0%～100.0%);cfb基因序列与NCBI上已报道的无乳链球菌相应序列具有高度同源性(>99.0%),各菌株间cfb基因序列也高度同源(100.0%)。经选择培养与PCR鉴定结果可以确定12株疑似菌株中有8株为无乳链球菌。     

牛源金黄色葡萄球菌16SrRNA分子鉴定与随机多态性扩增分型

利用16S rRNA保守序列对引起内蒙古地区奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌进行分离鉴定,并且建立引物随机多态性扩增(RAPD)体系对金黄色葡萄球菌分离株进行基因分型研究.结果表明,共分离出金黄色葡萄球菌35株,RAPD结果显示这35株菌均可得到清晰的RAPD指纹图谱,扩增产物在1～8条带之间,产物大小在350～4 500bp之间.菌株分为6个基因型,Ⅳ型为该地区的流行优势菌群.不同牛场各基因型菌株分布有明显差异,这与牛场的环境和病原菌在牛场间流行传播情况有关.研究结果为地区性奶牛乳房炎的防治及新疫苗的研制提供了可靠的理论依据.     

贵州地区牛源金黄色葡萄球菌分离株16S rRNA分子鉴定及RAPD分型研究

利用16S rRNA保守序列对引起贵州地区奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌进行分离鉴定,建立随机多态性扩增体系对金黄色葡萄球菌分离株进行基因分型研究。结果表明,69份奶样中共分离出金黄色葡萄球菌37株,DNA随机多态性扩增（random amplified polymorphic DNA,RAPD）结果显示这37株金黄色葡萄球菌扩增产物在1～7条带之间,产物大小为400～4500 bp。菌株可分为7个基因型,其中Ⅰ型7株（18.9%）、Ⅱ型2株（5.4%）、Ⅲ型2株（5.4%）、Ⅳ型1株（2.7%）、Ⅴ型19株（51.4%）、Ⅵ型1株（2.7%）、Ⅶ型5株（13.5%）,Ⅴ型为该地区的流行优势菌群。地理和气候环境对病原菌流行传播的影响是病原菌基因型分布差异的重要原因。     

Isolation and Identification of Bacterial Pathogen of Pig Arthritis in Yunnan

This experiment was conducted to investigate the bacterial causes and drug resistance of pig arthritis of four farms in Yunnan.Through isolation and culture,biochemical test,drug sensitive test,animal pathogenicity experiment and 16S rRNA identification,we analyzed the samples from four farms with pig arthritis symptom.The results showed that in all 96 samples,55 samples were Staphylococcus aureus positive,the positive rates were 20.8%,83.3%,91.7% and 33.3% in A,B,C and D farms,respectively;56 samples were Streptococci positive,the positive rates were 95.8%,21.7%,25.0% and 83.3%,respectively;Mixed infection rates were 20.8%,21.7%,25.0% and 33.3%,respectively.Therefore,Staphylococcus aureus was the major bacterial pathogen which caused pig arthritis in B and C farms;Streptococci was the major bacterial pathogen which caused pig arthritis in A and D farms;Two kinds of bacteria were more sensitive to ceftriaxone,minocycline and ciprofloxacin,and resistant to multiple antibiotics.     

奶牛源化脓隐秘杆菌的分离鉴定及其毒力基因的检测

本研究旨在分离鉴定来自北京某奶牛场死亡奶牛肺脏的1株疑似病原菌CVCC 3982,并测定其致病性。通过分离培养获得疑似病原菌,采用Biolog鉴定系统和16S rDNA序列分析对其进行了鉴定,人工接种CD-1小鼠测定了其致病性,合成引物对其主要毒力基因进行了检测。结果显示,该疑似病原菌为革兰氏阳性杆菌,β溶血,Biolog鉴定结果显示其为化脓隐秘杆菌,其16S rDNA序列与化脓隐秘杆菌模式菌株NCTC 5224的同源性达100%,系统发育分析显示其与化脓隐秘杆菌处于同一分支。腹腔注射该菌可致小鼠死亡。分离菌株基因组中含有溶血素(PLO)基因,神经氨酸酶H(NanH)基因,神经氨酸酶P(NanP)基因,菌毛基因(fimA、fimC和fimE),但缺失胶原结合蛋白(CbpA)基因和菌毛fimG基因。结果表明该分离菌株为化脓隐秘杆菌且具有致病性。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验

[目的] 了解泰州市某奶牛场乳房炎中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染情况及其对常用药物的敏感性。[方法] 试验选用Baird-Parker培养基分离、生化鉴定、PCR检测等方法,对采集的9份奶牛乳房炎奶样进行分离鉴定和药敏试验。[结果] 共分离到6株葡萄球菌,进一步通过凝固酶试验和16S rDNA测序等方法鉴定其中3株为金黄色葡萄球菌。药敏试验结果显示,3株金黄色葡萄球菌对青霉素G均耐药,2株对四环素耐药,2株对红霉素和苯唑西林表现为中介。[结论] 该次分离的金黄色葡萄球菌主要对青霉素G和四环素耐药,对其他常用抗生素表现为敏感。     

锦州地区奶牛布鲁氏菌的分离鉴定

[目的]为了查明锦州地区奶牛布鲁氏菌病的流行现状。[方法]对锦州地区两家奶牛场所采集的126份血清进行试管凝集试验(SAT)检测。[结果]表明阳性率分别为31.6%、27.4%,平均为29.5%,然后再采集阳性牛的全血15份和奶样71份,进行病原分离与鉴定,共得到7株布鲁氏菌。[结论]布鲁氏菌病应当引起足够重视。     

青海地区奶牛乳房炎葡萄球菌的分离鉴定与药敏试验

为了掌握导致青海地区奶牛乳房炎的最主要病原菌——葡萄球菌流行情况及其对常用药物的敏感性,从而为奶牛乳房炎的治疗提供参考依据,本试验在青海地区18个奶牛场共采集243份乳房炎乳样。应用传统方法进行葡萄球菌的分离培养;通过试管法血浆凝固酶试验与生化鉴定方法,本次共分离出金黄色葡萄球菌43株,木糖葡萄球菌与产色葡萄球菌各6株,腐生葡萄球菌5株,松鼠葡萄球菌、表皮葡萄球菌和人葡萄球菌各4 株,头葡萄球菌和模仿葡萄球菌各2株;经K-B纸片扩散法对葡萄球菌耐药性检测结果显示,该地区葡萄球菌主要对头孢类、林可霉素、阿米卡星比较敏感,部分菌株对恩诺沙星与庆大霉素敏感,从而为该地区奶牛乳房炎的有效预防和治疗提供科学依据。     

牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分离鉴定

从奶牛分离得到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methieillin—resistant Staphylococcus aureus,MRSA）。按常规方法复苏菌株,用血浆凝固酶试验鉴定SA。用KB法、琼脂筛选法、生化鉴定法（VITEK32）、聚合酶链反应等鉴定MRSA。常规分离鏊定的葡萄球菌468株,其中凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase negative Staphylococcus,CNS）361株,检出率为77．149,6,金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SA）105株,检出率为22．44％,MRSA36株检出率为34．29％,2株未定型,占0．42％。而MRSA在乳房炎奶样中检出率高达34．29％,表明新疆兵团部分垦区牛场MRSA已经呈蔓延趋势。     

青海地区奶牛无乳链球菌的分离与鉴定

无乳链球菌是导致奶牛乳房炎的常见病原菌之一,为了掌握青海地区无乳链球菌的流行情况及常用药物的敏感性,从而为本地区更好的预防与治疗奶牛乳房炎提供保障。本试验在青海地区16个奶牛场共采集258份乳房炎乳样,经革兰氏染色与绵羊鲜血琼脂培养基培养纯化,获得疑似链球菌137株;随后经玻片法血浆凝固酶试验、CAMP试验、生化试验与动物致病性试验对无乳链球菌进行鉴定,结果显示,137株链球菌中含有无乳链球菌42株,分离率为30.7%;经K-B纸片扩散法对无乳链球菌耐药性检测结果显示,该地区无乳链球菌主要对头孢类高度敏感,对氧氟沙星、磺胺类、氨苄青霉素与阿米卡星中度敏感。