Establishment of Fetal Large-tailed Han Sheep Fibroblasts Cell Line Transfected with Lipofectamine 2000 Vector Containing TLR4 Gene

Exploiting the method of liposome transfection to obtain modified Toll-like receptors 4(TLR4) gene fibroblast cells as competent donor, build reconstructed embryos, which finally produced transfected TLR4 gene and gender controllable Large-tailed Han sheep by somatic cell nuclear transfer technology.In this study, through primary culturing the fetus dermal fibroblasts from Large-tailed Han sheep, to identify the SRY gene gender.Using the method of liposome transfection transferred TLR4 gene into fibroblast cells, then detected whether TLR4 gene expression stably or not in morphology level and molecular level respectively, transplanting fibroblast cells which stably expressed TLR4 gene into oocytes without nucleus from Large-tailed Han sheep for building reconstructed embryos.To harvest 5 positive clones by fibroblast cells with stable expression level of TLR4.According to the identification of the SRY gene gender, the cell lines were female.The analysis of Real-time fluorescent quantitative PCR, the fourth generation of transfected cells had the highest expression level of TLR4, which were higher than control group in 7.4816 times (P<0.01).The cleavage reconstructed embryos had stable expression level of EGFP.We succeeded in building reconstructed embryos with TLR4 gene and lay the foundation for producing the disease-resistant and gender controllable transgenic sheep in the future.     

大尾寒羊皮肤组织的生长发育规律

大尾寒羊是一个优良的肉裘兼用型绵羊品种，素以肉质好，制裘价值高而著称，早在明代已更为宫庭贡品。自60年代以来，国内一些专家虽就大尾寒羊的生产性能、营养需要等方面研究做出系列报道，但对其皮肤组织结构的研究仍是空白。为科学合理地利用和开发这一优良的品种资源，作者就不同生长阶段的大尾寒羊羔皮的组织结构进行了系统的研究。     

大尾寒羊生长期蛋白质需要及代谢规律的研究

选用生长期大尾寒羊６只，公母各羊，采用饲养试验和消化代谢试验，研究其蛋白质营养需要量，结果表明，大尾羊体重随生长期直线上升，而日增重则下降，大尾寒羊生长期可消化粗蛋白的维持需要量，生长前期为２．７４Ｗ＾０．７５ｇ／ｄ，生长后期为２．４２Ｗ＾０．７５ｇ／ｄ；每克增重需要可消化粗蛋白，生长前期为０．２９ｇ，后期为０．３３ｇ，大尾寒羊生长期可消化粗蛋白的总需要量（ＲＤＣＰ）可按上式示得：生长前期：ＲＤＣ     

大尾寒羊公羔断尾效果的研究

<正> 关于肥尾羊断尾对产肉性能的影响,国外研究报道结果不一。国内关于肥尾羊断尾资料还未见报道。 大尾寒羊为我国优良地方品种,分布在黄河下游的河北、山东、河南3省相邻的平原农业区,以其成熟早、繁殖性能高、产肉脂多、皮毛品质好和肥尾硕大而闻名于全国。但是,近年来随着商品生产和人们生活水平的不断提高,人们多食用瘦肉和植物油,羊尾脂不好销售,价格也低。因此,我们对大尾寒羊公羔进行了断尾试验,以探讨其生长发育、胴体结构、产肉性能和体内脂肪分布的变化规律,为大尾寒羊的羊     

宝丰县大尾寒羊品种资源的调查报告

大尾寒羊是主产我县的地方优良品种，具有性情温顺、生长速度快、抗病能力强、耐粗饲的特点。为了科学合理地保护、开发、利用这一地方优良品种，发展当地经济，我们对大尾寒羊品种资源进行了调查，现将调查数据报告如下：１品种来源及发展大尾寒羊是宝丰县地方优良品种，多年来，该品种经过精心培育，选优淘劣，保种选配，提纯复壮工作。生产性能大大提高、品种数量有较大发展，据统计，２００１年底大尾寒羊存栏已达１００００多只，数量增长较快。其中成年公３００多只，成年母羊３０００多只。２主产区的自然条件及分布宝丰县位于平顶山…     

河南大尾寒羊繁殖性能的调查与分析

河南大尾寒羊是我国优良绵羊品种之一 ,属肉脂兼用品种 ,它具有耐粗饲 ,常年发情、多胎多产、生长发育快、产肉性能高、羊毛品质较好等优点。自 2 0世纪 6 0年代初期开展绵羊杂交改良以来 ,纯种羊分布区域急剧缩小 ,数量锐减 ,最低潮存栏只有 2千余只。 1989年被联合国粮农组织公布为频危家畜品种〔1〕。 90年代大尾寒羊的保种选育工作受到河南省有关部门的重视 ,并取得阶段性成果。为了更好地开展本品种的保种选育工作 ,我们于 2 0 0 2年 2月对大尾寒羊的繁殖性能进行了相应的调查研究 ,以期为保种选育提供相应的科学依据 ,现将调查结果报…     

河南大尾寒羊主要血液生化指标的测定

对41只河南大尾寒羊(母19只,公22只)血清总蛋白,血清白蛋白,血清球蛋白,血清总胆固醇,血糖,血清钾,血清钠,血清钙,血清尿素氮和肌酐共10项血液生化指标进行了测定.结果表明除血清胆固醇指标公羊极显著高于母羊外(P<0.01),其它各项指标公母羊均无显著差异(P>0.05)     

小尾寒羊和大尾寒羊能量与蛋白质代谢规律研究

选用小尾寒羊和大尾寒羊200只．分妊娠期、泌乳期、哺乳期和生长期4个不同生理阶段．系统研究了蛋白质和能量代谢规律。研究过程采用了饲养对比试验8次．消化代谢试验16次．低氮日粮平衡试验4次，气体能量代谢试验6次．比较屠宰试验4次，并采用瘤胃瘘管技术、血液生理生化指标测定等技术。制定出小尾寒羊和大尾寒羊的能量维持需要、各级有效能转化效率、畜体总产热和绝食代谢产热等基础代谢参数89个．粗蛋白质和可消化粗蛋白质维持需要、不同生理状态和生产水平下的粗蛋白质、可消化粗蛋白质生产需要、以及内源尿氮和代谢粪氮等蛋白质代谢参数58个。     

河南大尾寒羊血液生理指标的测定

对河南大尾寒羊的血液生理指标进行了测定,结果表明大尾寒羊公母间RBC、WBC、PCV、Hb、MCV、MCH、MCHC均无显著性差异.大尾寒羊的红细胞脆性较大,而ESR值较小.     

滩羊成纤维细胞系的建立及其生物学特性研究

试验以滩羊耳缘组织为材料,采用组织块贴壁培养法和细胞冷冻保存技术构建了35个滩羊成纤维细胞系,并对其进行了形态学、生长动力学、细胞活力测定、核型分析、微生物检测和荧光蛋白报告质粒(PEGFP-N3)基因转染等生物学特性的研究。结果表明,细胞群体倍增时间(PDT)约为36h,细胞冻存后活力为95.8%,细胞染色体中二倍体(2n=54)占主体,镜检细胞的百分比约为97.5%。细菌、真菌、病毒和支原体检测结果为阴性,该细胞库的各项指标均达到ATCC细胞系鉴定标准。     

湖羊FecB基因在新疆细毛羊胎儿成纤维细胞中的表达

为培育携带FecB多胎基因的高繁殖率新疆细毛羊,本研究提取了湖羊卵巢的总RNA,在此基础上反转录为cDNA,通过PCR扩增得到了湖羊的FecB基因,再与pMD19-T载体连接,构建了pMD19-T-FecB重组质粒。通过双酶切与真核表达载体pEGFP-N1连接,得到了pEGFP-N1-FecB真核表达载体。经测序与酶切证明,成功构建了pEGFP-N1-FecB真核表达载体,并转染新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,通过药物筛选获得了表达湖羊FecB基因的阳性新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,为培育高繁殖率的新疆细毛羊奠定基础。     

小尾寒羊高繁殖力候选基因RBP4的研究

以视黄醇结合蛋白4（retinol binding protein 4，RBP4）基因为候选基因，采用PCR-SSCP技术分析了RBP4基因在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊、湖羊）以及低繁殖力绵羊品种（多赛特羊、萨福克羊）中的单核苷酸多态性，同时研究这个基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明：RBP4基因扩增片段在4个绵羊品种中存在PCR-SSCP多态性。BB基因型只出现在高繁殖力绵羊品种中，而低繁殖力绵羊品种则没有BB基因型；AB基因型频率随着绵羊繁殖力的降低而升高；AA基因型只出现在小尾寒羊、多赛特羊中。BB基因型小尾寒羊产羔数分别比AA和AB基因型多0．52只（Pd0．05）和0．67只（Pd0．05），AA和AB基因型小尾寒羊产羔数没有显著差异（P〉0．05）。本研究检测的绵羊RBP4基因座位与小尾寒羊高繁殖力相关。     

孕酮受体基因外显子 4作为小尾寒羊多胎候选基因的研究

试验采用53只小尾寒羊母羊（山东梁山和泰安）、25 只无角陶赛特羊母羊（甘肃永昌肉用种羊场）、35只蒙古羊母羊（甘肃武威）。分别采集颈静脉血样提取DNA,利用GenBank中人孕酮受体基因外显子4和绵羊孕酮受体基因 mRNA序列,设计绵羊孕酮受体基因外显子4限制性片段特异性引物,进行PCR扩增,对其PCR产物克隆、测序验证。用PCR-SSCP检测多态性,通过DNA测序确定单核苷酸多态位点（SNPs）。经过研究分析表明,小尾寒羊由野生型AA型、杂合AB型、突变纯合BB型3种基因型组成,蒙古羊由AA型、AB型两种基因型组成,无角陶赛特羊只有AA型一种基因型,不存在突变;在基因型分布上小尾寒羊与无角陶赛特羊和蒙古羊之间存在极显著差异（P<0.01）,而无角陶赛特羊和蒙古羊之间差异不显著（P>0.05）;小尾寒羊突变纯合基因型BB和杂合AB中存在4个突变位点,此外在发现的4个突变位点中,只有第4个突变位点246碱基T→C引起氨基酸突变。      

Myostatin基因沉默绵羊成纤维细胞系的建立

旨在获得肌肉生长抑制素( Myostatin,MSTN)基因沉默的成纤维细胞系,为进一步探索Myostatin的调控机理,获得Myostatin的基因沉默的转基因羊奠定基础.针对小尾寒羊Myostatin的基因序列,设计4条siRNA干扰序列,构建pSilencer干扰载体,转染成纤维细胞,采用RT-PCR进行筛选;构建慢病毒干扰载体,包装病毒,感染成纤维细胞,采用流式细胞技术分选阳性细胞,阳性细胞予以测序鉴定并检测沉默效果.结果,获得Myostatin基因沉默效率约90％的RNA干扰片段PSL1,包装病毒获得滴度为1×108的病毒颗粒,流式细胞技术分选得到纯度达99％的Myostatin基因沉默成纤维细胞系.采用慢病毒感染接合流式细胞术分选,能较快获得无抗性标记的转基因阳性细胞系,为培育Myostatin基因沉默的转基因羊及探索Myostatin的调控机理奠定基础.     

小尾寒羊雌激素受体基因外显子4的克隆与序列分析

根据GenBank发表的人、鸡、大鼠雌激素受体(estrogen receptor,ESR)基因外显子4的序列设计1对引物,采用PCR 技术扩增出小尾寒羊ESR基因外显子4的DNA片段,将该片段克隆到pGEM-T Easy 质粒中,重组质粒用PCR 扩增进行阳性克隆鉴定,然后测定其核苷酸序列并推导氨基酸序列,同时将测定的小尾寒羊ESR基因外显子4序列与人、牛、猪、大鼠、鸡的外显子4序列进行比较。结果表明：克隆测序所得的核苷酸和翻译后的氨基酸序列与人、牛、猪、大鼠、鸡相比,同源性分别为77.68%～97.28%和71.82%～98.18%,显示了很强的保守性;小尾寒羊的核苷酸序列与人、牛、猪、大鼠、鸡相比存在1处特有变异,氨基酸序列23～36存在高变异区。     

中国美利奴羊TLR2基因多态性及其与布鲁氏菌病的相关性分析

试验旨在研究Toll样受体2（Toll-like receptor,TLR2）基因的多态性及其与中国美利奴羊布鲁氏菌病易感性的相关性。利用生物信息学方法对NCBI上公布的绵羊TLR2基因序列进行比对,选出多态位点丰富的片段进行扩增,运用PCR-SSCP的方法对206个中国美利奴布鲁氏菌病阴性样本和80个中国美利奴羊布鲁氏菌病阳性样本进行TLR2基因的多态性检测,然后对不同等位基因的PCR产物进行测序,确定该基因的多态性位点,经卡方检验分析每个SNP位点的等位基因频率、基因型频率及其多态性与布鲁氏菌病易感性的相关性,利用生物信息学软件分析RNA二级结构及蛋白质的二级结构。结果表明,在279 bp的序列中共检测到3个SNPs,分别为：C1731T、G1737C和G1749T,均未引起对应氨基酸的改变,属于无义突变。这些位点在病例组和对照组之间的等位基因频率及基因型频率均不存在显著差异（P>0.05）。各突变位点均能引起RNA二级结构和最小自由能的改变,而蛋白质的二级结构均未改变。由此得出,中国美利奴羊TLR2基因的3个SNPs位点（C1731T、G1737C和G1749T）与中国美利奴羊布鲁氏菌病易感性无相关性。     

牛TLR4基因生物信息学分析

为了更加深入地了解牛TLR4基因的功能、结构及与该基因有关联的疾病识别及其致病机理,利用牛TLR4基因的氨基酸序列对其编码蛋白的基本理化性质、蛋白质译后的磷酸化位点和糖基化位点以及跨膜结构域和蛋白质结构进行预测。结果显示,牛TLR4基因一共编码841个氨基酸,负电荷残基总和(Asp+Glu)为84,正电荷残基总和(Arg+Lys)为76,不稳定指数小于40,表明该基因编码产物稳定性较好。在该基因整个编码产物中,亲水氨基酸占比较多,平均分值为-0.011,由此得知TLR4基因编码的蛋白质是一种易溶蛋白。有9个潜在的N-糖基化位点;78个磷酸化位点以及存在一个跨膜蛋白和存在信号肽,其切割位点在第25和第26个氨基酸之间。蛋白质的二、三级结构预测结果显示,二级结构和三级结构均由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成,其在生物合成、基因表达与调控等方面有重要作用。本研究结果可为牛TLR4基因深入研究提供理论基础。     

Construction of Eukaryotic Expression Vector of Sox2 Gene and Establishment of Sheep Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Lines Transfected with Sox2 Gene

Sox2 is one important marker of pluripotent stem cells, a study found that neural stem cells with high expression of Sox2 as donor cells showed higher reprogramming ability in nuclear transplantation.In this study, through enhancing exogenous Sox 2 gene expression of sheep bone marrow mesenchymal stem cells, in order to raise their reprogramming ability, and improve the efficiency of somatic cell cloning in animal.Total RNA was extracted from sheep testicular tissue, and with this template, Sox2 cDNA sequence was amplified and inserted into the eukaryotic expression vector pEGFP-N1 to build a recombinant vector pEGFP-N1-Sox2.The vector was transfected into the sheep bone marrow mesenchymal stem cells by liposome method, and through G418 and fluorescence screening to obtain and amplify monoclone.DNA sequencing showed that sheep Sox 2 gene CDS sequence was obtained, and recombinant plasmid was successfully constructed.Identification of fluorescence confirmed that stable sheep bone marrow mesenchymal stem cell lines transfected with Sox2 were established.This study obtained the sheep bone marrow mesenchymal stem cell lines with high expression of Sox2, and provided a new idea for raising reprogramming efficiency in the process of somatic cell cloning.