鸡基质蛋白3核定位信号的预测与鉴定

本研究旨在预测和鉴定鸡基质蛋白3(matrin 3,MATR3)的核定位信号(nuclear localization signal,NLS)。通过核定位信号在线预测软件预测鸡MATR3蛋白中存在的假定NLS(putative NLS,pNLS),根据预测结果构建鸡MATR3蛋白pNLS缺失的重组真核表达载体,转染细胞后通过观察缺失体重组蛋白的亚细胞定位来确定其NLS。根据鸡MATR3蛋白NLS邻近碱性氨基酸序列特征,构建NLS邻近氨基酸缺失的重组真核表达载体,转染细胞后通过荧光观察和亚细胞定位分析来确定NLS邻近碱性氨基酸是否参与鸡MATR3蛋白的细胞核定位。另外,对鸡MATR3蛋白NLS在不同物种间的保守性以及对外源蛋白的核输入能力进行分析和检测。结果表明,鸡MATR3蛋白中存在4个pNLS,其中pNLS2(~(596)PSDKKSK~(602))缺失导致鸡MATR3蛋白丧失细胞核定位特征。将构建的鸡MATR3蛋白NLS邻近碱性氨基酸缺失的重组真核表达载体转染细胞,通过荧光观察和亚细胞定位分析,发现鸡MATR3蛋白NLS邻近的碱性氨基酸不参与NLS介导的MATR3蛋白细胞核定位。此外,笔者发现该NLS基序在不同物种的MATR3蛋白中均保守,并且与SV40大T抗原NLS具有相同的核输入能力。鸡MATR3蛋白中存在一个高度保守的NLS(~(596)PSDKKSK~(602)),其邻近的碱性氨基酸位点不参与MATR3蛋白的细胞核定位。     

蓝舌病病毒NS4重组蛋白的纯化及多克隆抗体的制备

蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)非结构蛋白4(Non-structural protein 4,NS4)拮抗宿主天然免疫。为研究BTV NS4蛋白的功能及基于BTV NS4的检测方法,本研究采用pET-32a-NS4在37℃,0.8 mmol/L IPTG,诱导6 h,超声破碎裂解菌体后纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。经Ni柱亲和纯化后获得大小约27 kD的蛋白,获得的NS4抗体效价在1∶512 000以上;纯化后的抗体浓度为1.0 mg/mL,体积为12 mL,抗体纯度大于85%,纯化抗体得率达到8.0 mg以上;Western blot分析可知纯化NS4蛋白多克隆抗体与pET-32a-NS4重组蛋白能产生特异性反应。本研究对BTV NS4重组蛋白进行表达纯化,并成功制备BTV NS4多克隆抗体,为BTV NS4的功能研究及临床应用奠定了基础。     

EHV-1皮层蛋白VP22生物信息学分析及亚细胞定位研究

为了研究马疱疹病毒(EHV-1)皮层蛋白VP22的生物学功能,试验通过克隆测序获得VP22基因并构建系统进化树,采用生物信息学软件分析其生物学特征,并将其编码基因的PCR扩增产物亚克隆至p DsRed2-N1真核表达载体,构建重组质粒pDsRed-VP22,研究VP22在BHK-21细胞中定位。结果表明:EHV-1新疆本地株的VP22由304个氨基酸组成,其序列与欧洲分离株Ab4的同源性为100%,与其他分离株的同源性为97%~99%; VP22是一种无信号肽、跨膜区及核定位信号(NLS)的磷酸化蛋白质,具有1个核输出信号(NES)序列及14个蛋白结合位点; VP22的二级结构主要由α-螺旋及β-折叠构成,三级结构及表面电荷分布情况显示该蛋白质正反两面的电荷分布差异较大;生物学功能预测显示EHV-1 VPP22是一种多功能蛋白质;此外,试验成功构建出重组质粒p DsRed-VP22,并证实EHV-1 VP22定位于BHK-21细胞的内质网-高尔基体(ER-Golgi)膜系附近。     

蓝舌病病毒NS3蛋白抑制细胞Ⅰ型干扰素的产生

蓝舌病病毒(bluetongue virus, BTV)是一种双链RNA病毒,能感染多种细胞诱导强烈的Ⅰ型IFN效应,而BTV非结构蛋白NS3对IFN-β的生成有强烈抑制作用,但目前BTV感染与诱导IFN-Ⅰ产生的关联仍不清楚,BTV NS3蛋白如何影响IFN-Ⅰ合成也有待研究。为此本研究通过BTV-1和BTV-16感染人非小细胞肺癌细胞(A549)和犊牛原代肾细胞(MDBK)探索不同血清型、不同病毒载量、不同作用时间的BTV对细胞IFN-Ⅰ产生的影响,通过构建BTV NS3真核表达质粒,探索NS3蛋白对细胞IFN-Ⅰ转录及表达水平的调控和影响。qPCR结果表明BTV-1和BTV-16能感染A549和MDBK并诱发强烈的IFN-β效应,双荧光素酶报告基因结果显示BTV NS3对BTV诱导的IFN-β启动子活性具有抑制作用,且表达量与抑制作用呈正相关。本研究揭示了BTV增殖与细胞产生IFN-Ⅰ的关系,阐明了BTV NS3蛋白对IFN-β转录和表达水平的影响,其结果有助于了解BTV的致病机理及其干扰宿主的天然免疫应答机制,对BTV疫苗研发及抗病毒治疗具有科学意义。     

重组新城疫病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的研究

为构建表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap)的重组新城疫病毒(NDV),本研究利用NDV LaSota弱毒疫苗株为活病毒载体,通过反向遗传操作系统构建出表达PCV2 Cap的重组病毒(rLa-PCV2/Cap),以及表达删除核定位信号(NLS)的Cap(Cap△41)的重组病毒(rLa-PCV2/Cap△41),并对外源蛋白的表达效果进行了检测.通过间接免疫荧光试验证明,两种重组病毒感染的BHK-21细胞中,PCV2 Cap蛋白以及删除NLS的Cap△41蛋白均获得正确表达;其中,完整的Cap蛋白定位于核内,而删除NLS的Cap△41蛋白则定位于胞浆中,本研究结果为研究新型PCV2疫苗奠定基础.     

基于NS4蛋白的蓝舌病病毒间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

旨在建立蓝舌病病毒（BTV）血清学ELISA抗体检测方法,本研究以原核表达并纯化的BTV NS4重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种BTV重组NS4蛋白的间接ELISA抗体检测方法。SDS-PAGE结果显示,获得大小约52 ku的NS4重组融合蛋白,主要在上清中存在,Western blot显示,纯化后的重组蛋白具有良好的抗原性。通过方阵试验进行了ELISA反应条件优化,确定了重组蛋白抗原最佳包被量为3.0 μg·孔^-1;血清最佳稀释倍数为1：200,酶标二抗最佳工作浓度为1：4 000,临界值分别为0.29和0.35。上述以NS4蛋白作为包被抗原建立的BTV抗体间接ELISA方法检测敏感性可达1：1 600;批内和批间重复性变异系数均小于10%;检测76份重庆地区牛群血清样品,阳性符合率为98%,阴性符合率为100%。本研究建立的间接ELISA方法为临床BTV血清抗体检测及BTV血清流行病学调查奠定了基础。     

蓝舌病病毒反向遗传操作系统的建立

为建立蓝舌病病毒(BTV)的反向遗传操作系统,本研究构建了分别表达血清1型BTV SZ97/1株VP1、VP3、VP4、VP6、VP7、NS1和NS2蛋白的7个真核表达质粒,同时又构建了含有SZ97/1株BTV的全部10个基因节段的T7聚合酶体外转录重组质粒。并利用T7 RNA聚合酶对酶切线性化的10个体外转录质粒进行体外转录,制备BTV全部10个基因的体外转录RNA。将已构建的7个真核表达质粒和体外转录获得的RNA产物依次共转染BHK-21细胞,拯救出含有分子标记的BTV。本研究首次在我国建立了BTV的反向遗传操作系统,为我国深入开展该病毒致病机理、传播机制、基因组功能的研究以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

蓝舌病毒NS4基因真核表达对IFN-β信号通路基因mRNA表达的影响

通过构建蓝舌病毒(BTV)NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,转染HEK-293T细胞,利用Western blot及荧光显微镜分析NS4蛋白的表达与亚细胞定位特征;pcDNA3.1-NS4-eGFP转染的HEK-293T细胞添加20 HAU/mL仙台病毒(SeV)刺激后,qRT-PCR法分析NS4基因表达对SeV诱导的上游识别基因RIG-Ⅰ、MDA5、VISA、TBK1、IKKε、IRF3、TRAF3、TRAF6、IRF9、干扰素基因(IFN-α、IFN-β)以及干扰素刺激基因ISG15和USP18的mRNA表达水平的影响。在HEK-293T细胞内转染pcDNA3.1-NS4-eGFP质粒24 h后,分别添加20 HAU/mL SeV刺激24,48 h,qRT-PCR结果表明,细胞内表达NS4-EGFP后,RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15及IFN-β基因mRNA表达极显著下降,随着SeV诱导时间的延长,VISA、TBK1、IKKε、USP18基因mRNA表达差异呈不显著趋势。本研究成功构建BTV NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,NS4-EGFP融合蛋白在HEK-293T细胞中主要分布于细胞核周围及细胞核内。BTV NS4基因在HEK-293T细胞内的表达显著下调SeV诱导的IFN信号通路相关基因RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15和IFN-β的表达,为进一步探究NS4基因在BTV拮抗宿主细胞免疫应答中的机制奠定基础。     

猫泛白细胞减少症病毒北京株NS1基因克隆与生物信息学分析

为分析猫泛白细胞减少症病毒(FPV)北京株(FPV-BJ 05株)NS1基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本研究对FPV-BJ 05株NS1基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学软件分析FPV-BJ 05株与GenBank上登录的11株FPV参考株NS1基因的同源性,并预测NS1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构、B细胞抗原表位、磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白结构与功能、高级结构等。结果显示,NS1基因全长2 007bp,编码668个氨基酸,且与其他FPV分离株NS1基因核苷酸序列同源性为98.8%～99.3%,氨基酸序列同源性为97.9%～98.8%。系统进化树分析结果显示,FPV-BJ 05株NS1蛋白与GenBank上登录的3株FPV参考株处于同一大分支,但由于氨基酸的突变导致其属于独立的一小分支。NS1蛋白既无信号肽也无跨膜结构域,属于非分泌型的疏水性蛋白。B细胞抗原表位预测结果显示,NS1蛋白柔韧性较好,抗原性及表面可及性较高,预测该蛋白含有13个优势抗原位点。修饰结构预测表明,NS1蛋白含有62个潜在磷酸化位点,27个O-糖基化位点和2个N-糖基化位点。亚细胞定位结果显示,NS1蛋白在细胞质和细胞核的概率较高,分别为69.6%和17.4%。NS1蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角分别占39.37%、15.42%、39.37%和5.84%。应用在线软件SWISS-Modle对NS1蛋白进行建模,预测其三级结构,结果发现NS1蛋白主要以α-螺旋为主。本试验结果将为北京地区FPV免疫诊断及核酸疫苗研究提供理论依据。     

蓝舌病毒结构与组装机制研究进展

蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)是一种以媒介昆虫为传播媒介侵染野生反刍动物和家畜的世界范围流行的病原微生物。BTV颗粒是由10个基因片段组成的双股RNA病毒,分别编码7个结构蛋白(VP1-VP7)和至少4个非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/3a和NS4)组成的连续蛋白质层的复杂结构,BTV已被作为大型无囊膜dsRNA病毒研究的模型系统。近年来,通过反向遗传学(RG)、低温电子显微镜(Cryo-EM)、蛋白晶体结构解析等研究分析方法,为BTV病毒蛋白结构、病毒蛋白之间功能关系、病毒组装/拆卸等方面取得了相当大的研究进展,该文对BTV病毒衣壳蛋白结构、核心蛋白的组装、基因组RNA组装等方面机制进行了综述。     

布鲁菌分泌蛋白BspG的亚细胞定位分析

本研究旨在确定布鲁菌分泌蛋白BspG在宿主细胞中的亚细胞定位.通过生物信息学分析预测BspG蛋白序列特征及功能域,构建立体模型;使用常规分子克隆技术以布鲁菌16M株为模板进行目的基因扩增,构建pMD19-T-BspG克隆载体及pDsRed2-C1-BspG重组真核表达载体,真核载体转染HEK293T细胞,RT-PCR检...     

Establishment and Preliminary Application of Indirect ELISA Based on Recombinant NS4 Protein for Detection of Bluetongue Virus Antibodies

This study was conducted to establish an indirect ELISA method for the detection serological antibody of bluetongue virus (BTV). The purified BTV recombinant NS4 protein obtained from the prokaryotic express system was used as the coated antigen, and then an indirect ELISA antibody detection method of BTV was developed by optimizing the reaction conditions. SDS-PAGE results showed that the recombinant NS4 protein with a size of about 52 kDa was obtained, which mainly existed in the supernatant. Western blot results showed that the purified recombinant NS4 protein had good antigenicity. The ELISA reaction conditions were optimized by the square matrix test. The optimal coating amount of recombinant NS4 protein antigen was determined to be 3.0 μg per well, and the optimal dilution ratio of serum to be tested was 1:200, and the optimal dilution concentration of HRP-labeled rabbit anti-cow IgG secondary antibody was 1:4 000, and the critical values were 0.29 and 0.35, respectively. The detection sensitivity of the BTV antibody was up to 1:1 600. The intra-assay repeatability and the inter-assay repeatability coefficient of variation were less than 10%. The positive coincidence ratio and negative coincidence ratio were 98% and 100% respectively. The indirect ELISA method established in this study laid a foundation for clinical serum antibody detection and serum epidemiological investigation of BTV.     

猫泛白细胞减少症病毒北京株NS1基因克隆与生物信息学分析

为分析猫泛白细胞减少症病毒（FPV）北京株（FPV-BJ 05株）NS1基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本研究对FPV-BJ 05株NS1基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学软件分析FPV-BJ 05株与GenBank上登录的11株FPV参考株NS1基因的同源性,并预测NS1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构、B细胞抗原表位、磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白结构与功能、高级结构等。结果显示,NS1基因全长2 007 bp,编码668个氨基酸,且与其他FPV分离株NS1基因核苷酸序列同源性为98.8%~99.3%,氨基酸序列同源性为97.9%~98.8%。系统进化树分析结果显示,FPV-BJ 05株NS1蛋白与GenBank上登录的3株FPV参考株处于同一大分支,但由于氨基酸的突变导致其属于独立的一小分支。NS1蛋白既无信号肽也无跨膜结构域,属于非分泌型的疏水性蛋白。B细胞抗原表位预测结果显示,NS1蛋白柔韧性较好,抗原性及表面可及性较高,预测该蛋白含有13个优势抗原位点。修饰结构预测表明,NS1蛋白含有62个潜在磷酸化位点,27个O-糖基化位点和2个N-糖基化位点。亚细胞定位结果显示,NS1蛋白在细胞质和细胞核的概率较高,分别为69.6%和17.4%。NS1蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角分别占39.37%、15.42%、39.37%和5.84%。应用在线软件SWISS-Modle对NS1蛋白进行建模,预测其三级结构,结果发现NS1蛋白主要以α-螺旋为主。本试验结果将为北京地区FPV免疫诊断及核酸疫苗研究提供理论依据。     

抗蓝舌病病毒VP7和NS2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为建立蓝舌病病毒(BTV)的检测方法和研究该病毒蛋白的功能,本研究利用BTV血清8型(BTV8)免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,制备单克隆抗体(MAb).并以BTV8作为包被抗原建立间接ELISA方法,经筛选获得了8株稳定分泌抗BTV8 MAb的杂交瘤细胞株(1B2、1F6、2B1、2D10、3B6、3D9、4D4和4D12).Western blot结果显示,MAb 1F6、2B1、2D10、3B6、3D9与BTV8 VP7蛋白反应,MAb B2、4D4、4D12与BTV8 NS2蛋白反应.间接免疫荧光结果显示,该8株MAb与24型BTV血清型呈不同的反应论系.本研究所获得的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究提供了实验依据.     

猫importin基因生物信息分析及其在犬细小病毒感染F81细胞表达的动态变化

试验旨在系统研究猫源不同亚型importin（importin α1、importin α3、importin α4、importin α5、importin α6、importin α7、importin α8和importin β）基因序列和蛋白基本特性,探讨其在犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）感染F81细胞表达的动态变化。本研究利用RT-PCR方法扩增F81细胞中improtin基因全长序列,应用生物学软件预测其氨基酸序列及编码蛋白的结构及功能;进一步利用实时荧光定量RT-PCR技术检测importin基因在CPV感染F81细胞后24、48和72 h表达水平。结果显示,不同亚型importin α基因全长约在1 500 bp,而importin β基因全长为2 600 bp;预测importin亚型蛋白序列发现,其等电点均在4.60左右,且发现importin α1、importin α5、importin α6、importin α7和importin β为不稳定蛋白;分析发现这些importin蛋白均无信号肽、无跨膜区、无细胞定位;采用Predictprotein软件预测蛋白二级结构,结果显示importin亚型蛋白序列主要以α-螺旋和无规则卷曲形式存在。实时荧光定量RT-PCR结果显示,CPV感染F81细胞后随着感染时间的延长importin α1（P<0.01）和importin β表达量逐渐降低,而importin α3、importin α4、importin α5、importin α6（P<0.01）、importin α7（P<0.01）和importin α8（P<0.01）表达量逐渐提高,其中importin α8在病毒感染细胞后表达量最高。本研究结果为进一步分析CPV进入细胞核的转运机制及开发治疗药物相关研究奠定基础。     

African horse sickness virus structure

African horse sickness virus (AHSV), of which there are nine serotypes (AHSV-1, -2, etc.), is a member of Orbivirus genus within the Reoviridae family. Both in morphology and molecular constituents AHSV particles are comparable to those of bluetongue virus (BTV), the prototype virus of the genus. The two viruses have seven structural proteins (VP1–7) organized in two layered capsid. The outer capsid is composed of VP2 and VP5. The inner capsid, or core, is composed of two major proteins, VP3 and VP7, and three minor proteins, VP1, VP4 and VP6. Within the core is the virus genome. This genome consists of 10 double-stranded (ds)RNA segments of different sizes, three large, designated L1–L3, three medium, M4–M6, and four small, S7–S10. In addition to the seven stuctural proteins that are coded by seven of the RNA species, four non-structural proteins, NS1, NS2, NS3 and NS3A, are coded by three RNA segments, M5, S8 and S10. The two smallest proteins (NS3 and NS3A) are synthesized by the S10 RNA segment, probably from different in-frame translation initiation codons. Nucleotide sequences of eight RNA segments (L2, L3, M4, M5, M6, S7, S8 and S10) and the predicted amino acid sequences of the encoded gene products are also available, mainly representing one serotype, AHSV-4. In this review the properties of the AHSV genes and gene products are discussed. The sequence and hybridization analyses of the different AHSV dsRNA segments indicate that the segments that code for the core proteins, as well as those that code for NS1 and NS2 proteins, are highly conserved between the different virus serotypes. However, the RNA encoding NS3 and NS3A, and the two segments encoding the outer capsid proteins, are more variable between the AHSV serotypes. A close phylogenetic relationship between AHSV, BTV and epizootic haemorrhagic disease virus (EHDV), three Culicoides-transmitted orbiviruses, has been revealed when the equivalent sequences of genes and gene products are compared. Recently, the four major AHSV capsid proteins have been expressed using recombinant baculoviruses. Biochemically and antigenically these proteins are similar to the authentic proteins. Since the AHSV VP7 protein is highly conserved among the different serotypes, it has been utilized as a diagnostic reagent. The expressed VP7 protein has also been purified to homogeneity and crystallized for three-dimensional X-ray analysis. The expressed outer capsid proteins, VP2 and VP5, have been purified and used to raise antisera in rabbits. The VP2 antisera neutralize virus infections in vitro indicating the importance of this protein for vaccine development.     

猪链球菌4型GalR蛋白的生物信息学分析及原核表达

试验旨在了解猪链球菌4型（Streptococcus suis serotype 4,SS4）转录调控因子GalR蛋白生物学信息并对其进行原核表达。使用相关生物信息学分析网站对SS4 SH1510菌株GalR蛋白进行序列同源性和功能结构域检索,并对信号肽、跨膜区和等电点进行预测;同时,对SS4 SH1510菌株GalR基因进行扩增、原核表达、纯化,并用SDS-PAGE分析重组蛋白的可溶性,用Western blotting鉴定重组蛋白的反应原性。氨基酸序列比对显示,SH1510菌株GalR蛋白与变形链球菌、无乳链球菌、绿脓杆菌、马链球菌兽疫亚种、肺炎链球菌、口腔链球菌及李斯特菌的GalR家族蛋白的氨基酸序列分别具有57%、56%、55%、55%、52%、52%和49%的同源性;结构域检索发现GalR蛋白N-末端具有螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix,HTH）基序的小DNA结合结构域,C-末端具有Ⅰ型周质结合蛋白折叠的调节配体结合域,在这两个功能结构域的中间含有一个约18-氨基酸的连接子;GalR蛋白无信号肽,无跨膜区,等电点为5.10。SDS-PAGE分析显示,GalR蛋白绝大部分表达在上清,分子质量为56 ku;Western blotting鉴定结果显示,His单克隆抗体和粗制SS4多克隆抗体兔血清能特异性识别可溶性GalR蛋白。本研究对GalR蛋白进行了生物信息学分析并成功地表达和纯化了GalR蛋白,为进一步研究GalR蛋白在SS4中的作用奠定了基础。