Prokaryotic Expression,Polyclonal Antibody Preparation and Subcellular Localization of Theileria annulata GAPDH

In order to study the function of the Theileria annulata (T.annulata) glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH),the T.annulata GAPDH (TaGAPDH) gene was amplified by PCR from the cDNA of T.annulata,and cloned into the pET-30a(+) vector and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3).After purification,the fusion protein was injected into rabbits to produce polyclonal antibodies.Specificity and titers of the polyclonal antibodies were determined by ELISA and Western blotting,and subcellular localization of TaGAPDH protein was observed by confocal fluorescence microscope.The results showed that TaGAPDH gene was approximately 1 020 bp;SDS-PAGE analysis showed that the fusion protein was expressed in BL21(DE3) with 44 ku in molecular mass,and highest expressed level was detected in the inclusion.The titer of the polyclonal antibodies was more than 1:12 800.The results of western blotting indicated that the polyclonal antibodies possessed good specificity,and TaGAPDH protein was predominantly present on the cytoplasm of T.annulata schizont by subcellular localization.This study laid the foundation for screening and identifying candidate antigens of vaccination and drug targets as well as studying the energy metabolism of T.annulata.     

环形泰勒虫裂殖体表面蛋白基因高免疫原性区片段的克隆及其表达

根据环形泰勒虫TaA1272-1株裂殖体表面抗原(TaSP)基因的序列设计了1对引物，用PCR扩增出该基因长为393bp的高免疫原性区片段(SBxp)。将扩增产物连接到pGEM-T Easy载体上，转化入大肠埃希氏菌JM109中进行克隆。随后将重组质粒pGEM-SBxp和表达载体pGEX-4T-1分别以BamHⅠ、XhoⅠ酶切后，将酶切的目的片段SBxp亚克隆到原核表达载体中构建了重组表达载体pGEX-4T-1-SBxp，并将其转化到BL21宿主菌中。提取重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ酶切、PCR鉴定和测序确证后，阳性克隆用IPTG诱导表达。收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blotting检测。结果，SBxp基因在大肠埃希氏菌中成功表达，其表达产物为分子质量43ku的融合蛋白，该产物能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别。     

环形泰勒虫spm-N蛋白的原核表达及鉴定

子孢子与裂殖体2(spm2)是环形泰勒虫重要的表面抗原。为了深入研究环形泰勒虫spm2主要抗原区域spm-N蛋白的功能,利用大肠杆菌表达系统表达重组spm-N蛋白并进行纯化及鉴定。通过序列设计合成特异性引物,利用PCR扩增环形泰勒虫spm-N基因片段,将目的片段定向克隆至表达载体pET30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌,用IPTG诱导表达重组蛋白。结果显示:重组spm-N蛋白以可溶性的形式表达,获得了较高纯度的spm-N蛋白,且该蛋白的反应原性和特异性均较好。本研究成功表达了重组spm-N蛋白,为深入揭示spm-N蛋白的功能提供了依据。     

新疆牛环形泰勒虫Tams1基因的克隆与表达

采用PCR方法扩增环形泰勒虫Tams1基因,将扩增产物与pUcm-T载体连接,重组质粒经PCR和双酶切鉴定、测序确认后被亚克隆于pGEX-4T-2表达载体中.构建的表达重组质粒经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析.结果显示,克隆的Tams1基因片段长846 bp,为一个完整的开放阅读框,编码281个氨基酸,与GenBank中的Tams1基因核苷酸同源性在93.6%～99.8%之间;系统进化树分析表明新疆分离株与印度株、毛利塔尼亚株和北非共和国株进化途径一致,与苏丹株、巴林株进化途径相差较远;推测的蛋白质抗原决定簇预测表明,Tams1基因编码的氨基酸具有13个交叉的抗原决定簇;表达的融合蛋白为56 ku,能够被环形泰勒虫多克隆血清所识别,表明该融合蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,为进一步开展牛环形泰勒虫的分子生物学诊断、亚单位疫苗和核酸疫苗的研究奠定了可靠的基础.     

顶复门原虫3-磷酸甘油醛脱氢酶功能及其应用研究进展

糖酵解途径广泛存在于各类生物中,是顶复门原虫的主要供能方式。3-磷酸甘油醛脱氢酶是糖酵解途径的重要酶,与顶复门原虫的生存密切相关,可以作为抗寄生虫药物研发的重要靶标。文章主要从顶复门原虫糖酵解途径、3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因分析、作用机理及应用等方面进行综述。     

牛瑟氏泰勒虫HSP70基因的克隆及原核表达

根据GenBank(D12692.1)上发表的牛瑟氏泰勒虫HSP70基因序列设计、合成1对特异性的引物,采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫HSP70基因片段,将扩增产物与pMD18-Tsimple载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序;用pGEX-4T-1表达载体构建重组质粒pGEX-HSP70,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE、Western-blot分析。结果表明:扩增的HSP70基因与D12692.1序列同源性为99.3%;表达的融合蛋白分子质量约为68ku,而且可与牛瑟氏泰勒虫阳性血清发生特异性反应。     

牛环形泰勒虫enolase基因的原核表达及生物信息学分析

【目的】获得牛环形泰勒虫(Theileria annulata)新疆株enolase基因,并分析其生物学特性及反应原性。【方法】对牛环形泰勒虫enolase基因进行扩增和克隆,构建原核表达载体pGEX-4T-1-enolase,诱导表达enolase重组蛋白并进行蛋白纯化,通过Western blotting验证enolase重组蛋白反应原性。利用生物信息学方法对enolase基因编码蛋白的理化性质、亲疏水性、跨膜区、信号肽、磷酸化、亚细胞定位及蛋白互作网络进行预测分析。【结果】PCR扩增出大小为1 248 bp的牛环形泰勒虫enolase基因片段,enolase重组蛋白大小约70 ku; Western blotting结果表明,该重组蛋白与牛环形泰勒虫阳性血清发生反应。enolase基因编码416个氨基酸,理论等电点为5.91,有38个磷酸化位点;二级结构主要由α-螺旋(43.03%)和无规则卷曲(33.17%)组成;具有17个B细胞抗原表位,亚细胞定位主要位于细胞质中;enolase蛋白与磷酸甘油酸变位酶(PGAM)、二磷酸核苷激酶(NDK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、热休克蛋白...     

猪NLRP3蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

为了获得猪源NLRP3重组蛋白以及针对猪NLRP3蛋白的多克隆抗体,本试验采用原核表达技术对猪源NLRP3蛋白的主要抗原区域进行了截短表达与鉴定,并以重组蛋白为免疫原免疫兔制备兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体。结果显示,经RT-PCR方法扩增到大小为864 bp的NLRP3蛋白的主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-32α原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导获得了大小为50 000的重组蛋白;重组蛋白经纯化后Western blot检测其可与抗His标签单克隆抗体发生特异性反应;以纯化蛋白为免疫原制备的兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体的抗体效价达1∶25 600,Western blot检测其可与NLRP3重组蛋白发生特异性反应。结果表明,获得了具有良好反应活性的NLRP3重组蛋白与多克隆抗体,为研究NLRP3蛋白的结构与功能、NLRP3蛋白与猪炎症性疾病的相互作用机制奠定了基础。     

环形泰勒虫HSP90原核表达与中药单体筛选

旨在克隆、表达环形泰勒虫HSP90基因并筛选与其结合的中药单体。对新疆地方环形泰勒虫株HSP90基因进行PCR扩增、克隆测序,并构建系统进化树。对HSP90蛋白理化特性、高级结构与亚细胞定位进行预测分析。构建原核表达载体HSP90-pET32a,筛选诱导表达条件,经镍株纯化重组蛋白并用Western blot检测其免疫原性。使用DrugRep服务器对靶向环形泰勒虫HSP90的中药单体筛选。结果显示,HSP90基因编码的蛋白序列与小泰勒虫序列(登录号：XP 766455)同源性较高。HSP90蛋白编码223个氨基酸,理论pI为8.4,具有28个磷酸化位点。HSP90蛋白二级结构以α-螺旋(66.37%)和无规则卷曲(19.28%)为主,存在多个B细胞抗原表位,亚细胞定位主要分布于细胞质。HSP90-pET32a蛋白相对分子质量约50 ku, 0.2 mmol/L IPTG诱导3 h蛋白表达较好。Western blot结果显示,该蛋白具有较好的免疫原性。经虚拟筛选,发现了5种与环形泰勒虫HSP90有较好结合力中药单体,其中圣草次甙结合力最强(affinity=-8.5 kJ/mol),作...     

牛白细胞介素2基因原核表达及多克隆抗体制备

根据GenBank发表的牛白细胞介素2(BoIL-2)基因序列,设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增出重组牛白细胞介素2(rBoIL-2)基因。将克隆片段与pMD18-T载体连接,并经过酶切及PCR鉴定,测序结果显示,克隆的BoIL-2基因与GenBank发表的BoIL-2基因序列同源性为98.7%。将测序正确的克隆片段与pET30a(+)载体连接,构建重组表达质粒pET30a(+)-rBoIL-2,通过双酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒进行序列测定后在大肠杆菌的表达,分子质量约为23.49 ku;表达产物主要分布在包涵体中。Western blotting证实所得到的重组蛋白为BoIL-2重组蛋白。用镍离子亲和树脂对所得的BoIL-2重组蛋白进行纯化,并免疫新西兰兔成功制备兔抗rBoIL-2多克隆抗体,为下阶段的研究提供了重要的试验材料。     

Prokaryotic Expression,Polyclonal Antibody Preparation and Identification of Mouse Osteopontin Protein

In order to explore the function of osteopontin (OPN) regulated bone metabolism and the relationship between OPN and tumor, DNAMAN and Mega 5.02 softwares were used to analyze phylogenetic relationships of OPN protein, the OPN expression vector was prepared by RT-PCR and molecular clone; OPN was purified by SDS-PAGE gel slices, renatured by urea concentration gradient, and immunized mice to prepare the polyclonal antibody; The antibody titer and specificity were detected by ELISA and Western blotting, respectively.The homology comparison result of OPN sequence showed that it existed short repeat sequenc Arg-Gly-Asp (RGD) in different animals with evolution levels.Phylogenetic tree of OPN sequence showed that OPN had obvious evolution trend among animals.RNA was extracted, OPN recombinant vector had been digested and sequenced to confirm the correct construction, and strip lengths of OPN expression and purification were agreed with the prediction.The OPN antiserum titer was 1:1 600 detected by ELISA, and Western blotting proved that the antiserum had good specificity.We had successfully analyzed genetic evolution relationship of OPN sequence, gotten OPN expression vector, purified and renatured OPN, and prepared and identified the polyclonal antibody against OPN.     

小鼠骨桥蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

为探索骨桥蛋白(OPN)调控骨代谢及与肿瘤的关系,本试验利用DNAMAN与Mega 5.02软件分析OPN蛋白系统进化关系;采用RT-PCR与分子克隆方法制备OPN蛋白表达载体;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素浓度梯度复性获得OPN蛋白,免疫小鼠制备OPN蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度,Western blotting检测抗血清特异性。OPN序列的同源性比对分析发现,在不同进化层次动物中均存在Arg-Gly-Asp(RGD)短肽重复序列;OPN序列系统进化分析显示,OPN在动物间具有明显的进化趋势;提取小鼠肝脏RNA,OPN重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果及蛋白表达、纯化条带大小均与预测一致;ELISA法确认OPN抗血清滴度达1:1 600;Western blotting证实抗血清具有很好的特异性。结果表明本试验对OPN序列进行了遗传进化分析,成功克隆、表达、纯化及复性OPN蛋白,并制备、鉴定了小鼠多克隆抗体。     

牛IRF7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究旨在通过原核表达系统表达牛干扰素调节因子7（interferon regulatory factor 7,IRF7）蛋白,并对其进行纯化,进而制备高纯度的牛IRF7兔多克隆抗体。使用生物信息学软件预测并分析牛IRF7潜在的生物学功能,参考GenBank已公布的牛IRF7基因序列（登录号：NM_001105040.1）设计引物,利用PCR技术从牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染的MDBK细胞中扩增牛IRF7基因,连接至pMD19-T克隆载体,提取质粒连接至原核表达载体pET-28a （+）,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建重组质粒pET-28a-IRF7。将重组质粒pET-28a-IRF7转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE进行表达产物的分析与鉴定。通过Western blotting鉴定多克隆抗体的特异性,间接ELISA测定兔抗牛IRF7多克隆抗体效价,经BVDV感染细胞后,实时荧光定量PCR检测抗病毒因子IRF7的表达。生物信息学分析发现,IRF7蛋白不存在跨膜结构域,无信号肽,存在较多磷酸化位点,二级结构主要以无规则卷曲为主,与三级结构的三维模型一致,说明该蛋白可能存在很好的抗原潜力。PCR成功扩增出大小为1 497 bp的IRF7基因片段,成功表达牛IRF7蛋白,分子质量约为60 ku,间接ELISA测得兔抗牛IRF7多克隆抗体效价为1∶128 000,并可与牛IRF7蛋白发生免疫反应,感染BVDV毒株的MDBK细胞中IRF7表达量下降;BVDV感染过表达IRF7后的细胞发现,IRF7能显著促进干扰素-β（IFN-β）的表达（P<0.05）。综上,本研究成功表达纯化了牛IRF7蛋白,并制备兔抗牛IRF7多克隆抗体,为阐明牛IRF7在先天免疫抗病毒应答的分子机制提供了材料。     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号：XM_003124236.4）设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a（+）连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

猪细小病毒NS基因原核表达与多克隆抗体制备

旨在制备抗猪细小病毒(PPV)非结构蛋白共有氨基酸的NS多肽多克隆抗体。根据GenBank(MK993540)公布的PPV基因组序列,克隆其非结构蛋白NS1、NS2共有基因序列(NS基因),并进行生物信息学分析。进而将NS基因克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-NS,转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达,利用镍柱亲和层析技术纯化表达的重组多肽,用重组多肽免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,PPV杨凌株NS基因长258bp,编码86个氨基酸的多肽,是具有亲水性的非跨膜NS多肽,具有大量的B细胞线性表位。NS多肽在37℃、0.8mol/L IPTG条件下,诱导6h有大量的可溶性表达。免疫印迹试验结果显示,该多肽具有较好的抗原性。用纯化NS多肽免疫小鼠后获得鼠抗NS多肽的血清抗体效价为1∶12800。用制备的NS多克隆抗体检测纯化的NS重组多肽及真核表达的NS1蛋白,均能检测出相应特异性条带,为进一步研究NS蛋白在PPV致病过程中的作用奠定了基础。     

猪硒蛋白W的原核表达及IgY多克隆抗体制备

试验旨在优化硒蛋白W （selenoprotein W,SelW）的原核表达系统,并评估SelW的免疫原性和基于IgY抗体检测猪体内SelW的可行性。将获得的猪SelW基因序列密码子进行优化、合成并连接至pET-32a （+）表达载体中,构建原核表达重组质粒pET32a （+）-SelW,转化E.coli BL21（DE3）宿主菌中,进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定重组猪SelW的表达情况,并免疫产蛋鸡制备抗SelW的IgY多克隆抗体,通过间接ELISA检测IgY抗体滴度,采用Western blotting检测IgY识别抗原的特异性。SDS-PAGE结果显示,SelW基因在原核细胞中成功表达,得到了大小约为33 ku的重组蛋白,IPTG最佳诱导浓度及时间分别为0.5 mmol/L和6 h;可溶性分析结果显示,重组蛋白SelW主要以包涵体形式存在。间接ELISA检测结果显示,免疫后45 d的IgY多克隆抗体的效价可达1：51 200。Western blotting检测结果显示,重组蛋白具有良好的免疫原性,所制备的IgY抗体与SelW的亲和力较高。本试验成功构建并优化了SelW蛋白的原核表达系统,提高了SelW蛋白的表达量,获得了具有良好免疫原性的SelW蛋白,制备的IgY抗体能特异性识别猪肌肉组织中的SelW,可用于检测猪组织中SelW的表达、预防硒中毒和缺硒性疾病的监测等,为进一步探究SelW的生物学功能奠定基础。     

鸭补体调节因子H的原核表达及多克隆抗体制备

为制备鸭补体调节因子H(CFH)的多克隆抗体,从健康雏鸭的肝脏组织中提取总RNA及反转录合成cDNA,PCR扩增补体调节因子H基因的2个片段H1和H2,插入到载体pMD19-T,测序正确后,将目的基因分别克隆至原核表达载体pCold-TF,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达蛋白,重组蛋白经SDS-PAGE检测,镍柱亲和层析纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果表明,成功构建重组表达质粒pCold-TF-H1和pCold-TF-H2,SDS-PAGE检测重组蛋白为可溶性表达,TF-H1和TF-H2多克隆抗体效价均超过1∶10000。所制备的多克隆抗体可以为进一步研究鸭CFH的功能奠定基础。