北极狐及乌苏里貉抑制素α亚基基因克隆及生物信息学分析

试验旨在克隆北极狐及乌苏里貉抑制素α（inhibin α,INHα）亚基基因并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中犬科INHα预测mRNA序列（登录号：XM_545660.5）设计1对引物,用RT-PCR技术从北极狐及乌苏里貉的卵巢组织中扩增出INHα亚基基因,同时将其插入到克隆载体中,进行测序及生物信息学分析。测序结果表明,北极狐及乌苏里貉的INHα亚基基因CDS序列全长为1 107 bp,编码369个氨基酸。北极狐及乌苏里貉的INHα亚基基因与犬的同源性最高,分别为97.9%与97.6%。系统进化树分析表明,北极狐及乌苏里貉与犬亲缘关系较近,同时也说明INHα亚基基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性。对INHα亚基蛋白的高级结构预测发现,由于半胱氨酸间形成的二硫键导致其采用"蝴蝶形"或"开放手"构型,其中α-螺旋形成分子的"手腕"结构,β-折叠形成分子的"手指"结构。本研究成功克隆了北极狐及乌苏里貉的INHα亚基基因,同时进行了系统的生物信息学分析,为今后研究抑制素在卵母细胞-颗粒细胞同步发育过程中的生物学功能奠定了基础。     

乌苏里貉TLR8基因的分子克隆、序列分析及组织表达分析

为了解乌苏里貉TLR8基因特点及其在不同组织中的表达水平,本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆其c DNA全长序列,应用生物学软件分析该基因及预测其编码蛋白的特征,并对该基因在乌苏里貉不同组织中的表达水平进行检测。结果显示该基因全长3 191 bp,ORF全长3 117 bp,编码1 038 aa,含有Toll-like受体家族典型的结构域特征。同源性分析显示乌苏里貉TLR8基因核苷酸序列与犬同源性最高,达99.3%,与其他食肉目哺乳动物也具有较高的同源性,在89.2%~92.9%。组织表达分析显示TLR8基因在乌苏里貉各组织中广泛表达但表达量存在差异。本研究结果为进一步研究乌苏里貉抗病毒免疫及育种相关研究奠定了基础。     

北极狐及乌苏里貉抑制素α亚基基因克隆及生物信息学分析

试验旨在克隆北极狐及乌苏里貉抑制素α(inhibinα,INHα)亚基基因并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中犬科INHα预测mRNA序列(登录号:XM_545660.5)设计1对引物,用RT-PCR技术从北极狐及乌苏里貉的卵巢组织中扩增出INHα亚基基因,同时将其插入到克隆载体中,进行测序及生物信息学分析。测序结果表明,北极狐及乌苏里貉的INHα亚基基因CDS序列全长为1 107bp,编码369个氨基酸。北极狐及乌苏里貉的INHα亚基基因与犬的同源性最高,分别为97.9%与97.6%。系统进化树分析表明,北极狐及乌苏里貉与犬亲缘关系较近,同时也说明INHα亚基基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性。对INHα亚基蛋白的高级结构预测发现,由于半胱氨酸间形成的二硫键导致其采用"蝴蝶形"或"开放手"构型,其中α-螺旋形成分子的"手腕"结构,β-折叠形成分子的"手指"结构。本研究成功克隆了北极狐及乌苏里貉的INHα亚基基因,同时进行了系统的生物信息学分析,为今后研究抑制素在卵母细胞-颗粒细胞同步发育过程中的生物学功能奠定了基础。     

赤狐EDNRB基因编码区序列分析及启动子预测

为了研究赤狐内皮素受体B基因(EDNRB)编码蛋白的结构、功能及预测其5′端上游2 000 bp的候选启动子区的核心启动子区与转录因子的结合位点,从NCBI数据库中获得赤狐EDNRB基因的数据,利用生物信息学方法分析其编码区及候选启动子区。结果表明:赤狐EDNRB基因编码氨基酸的总数为443个,编码产物为不稳定的疏水蛋白。二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,存在信号肽和二硫键。该编码蛋白存在于内质网、细胞质膜和线粒体中。该编码蛋白含有7次跨膜G蛋白偶联受体超家族结构域。赤狐与乌苏里貉的亲缘关系最近,与犬关系较近。该基因的5′端上游存在潜在的启动子区域,同时发现存在转录调控元件和转录因子结合位点,不存在CpG岛。通过对赤狐EDNRB基因进行生物信息学分析,能够初步预测其编码区的结构、功能以及该基因的核心启动子区与转录因子结合位点,为其遗传特性及调控机制的研究提供基本信息。     

赤狐黑色素皮质激素受体-1基因结构特征预测及分子进化分析

为进一步分析黑色素皮质激素受体-1(melanocortin-1 receptor,MC1R)基因的分子特性,利用生物信息学方法对GenBank中已报道的赤狐MC1R基因完整编码区序列的碱基组成特点及其编码蛋白的结构特征进行了预测及分析,构建了12个物种MC1R蛋白的系统进化树。结果表明,赤狐MC1R基因编码区序列长度为954 bp,共编码317个氨基酸,为单一外显子,G+C含量高于A+T,编码的蛋白质是一种分子质量为34.8694 ku,等电点为9.13的亲水性稳定碱性蛋白;存在7个强跨膜区、7个广泛磷酸化位点和1个潜在的蛋白激酶C磷酸化位点(第157位的苏氨酸),α-螺旋为其主要二级结构元件;属于G蛋白偶联受体家族一员,包括多个潜在重要功能基序;同源性分析与分子进化树结果均表明,赤狐与北极狐、狗和貉的亲缘关系最近。     

貉源阿留申病毒VP2和NS1蛋白的抗原性预测

旨在预测和分析貉源阿留申病毒（RFAV） VP2和NS1蛋白的抗原表位特征，筛选阿留申病毒属较保守的B、T细胞抗原表位。本研究对RFAV的近全长基因组进行克隆及测序，对其VP2和NS1基因编码蛋白的理化性质、二级结构、翻译后修饰位点和抗原表位进行预测，并将预测的修饰位点、抗原表位与其他阿留申病毒种的序列进行比较分析，筛选相对保守的修饰位点和抗原表位。结果显示，获得的RFAV基因组长4 327 bp，编码VP2蛋白的636个氨基酸，编码NS1蛋白的641个氨基酸。VP2和NS1蛋白均为亲水性蛋白，二级结构以无规则卷曲为主。在阿留申病毒属内，VP2蛋白有3个保守的B细胞抗原表位，3个保守的T细胞表位，8个保守的翻译后修饰位点；NS1蛋白有1个保守的B细胞抗原表位，2个保守的T细胞抗原表位和7个保守的翻译后修饰位点。本研究成功克隆了RFAV近全长基因组序列，全面对RFAV的VP2、NS1蛋白抗原表位、翻译后修饰位点进行预测，并分析其在阿留申病毒属内的保守和变异特征，为阿留申病毒免疫研究提供参考。     

猪恒定链的原核表达及其分子结构与功能分析

为研究猪恒定链(Ii)分子结构与功能,通过PCR扩增编码完整Ii及其异构体的基因片段,克隆至T pMD18-T载体,在对目的基因进行测序及分析其基因与编码蛋白分子结构,确定功能域及其分子遗传变异的基础上,构建pET-32a-Ii重组载体,转化BL21进行诱导表达,并分析表达产物的免疫活性。结果显示,PCR扩增了645bp和837bp的Ii及其异构体编码基因,DNA序列分析其编码氨基酸分别为215个和279个,异构体Ii多出了64个氨基酸构成的Tg区;分子结构分析显示,猪Ii分子由胞内区、跨膜区和胞外区3部分组成,包含有内体定位基元、Ii-key、CLIP、TRIM等功能域,其中内体定位基元含有特征性L7I和PML17双亮氨酸基序,Ii-key、CLIP、TRIM氨基酸序列与人和小鼠Ii具有高度一致性。遗传变异分析表明,猪Ii分子与人、小鼠等哺乳动物的Ii同源性为62.7%~95.6%,与鸡、鸭、鸽、鹅等禽类Ii的同源性为48.7%~49.5%;空间结构分析显示,猪Ii有3个相似的α-helix构成,其间间隔由相似氨基酸构成的2个转角,转角关键位点氨基酸具有高度一致性;Ii编码基因在BL21细胞获得了有效表达,目的蛋白大小约41ku,Western blot和免疫荧光检测显示,表达产物具有良好的反应原性。试验成功获得了猪Ii及其异构体编码基因,明确了其功能区、分子遗传变异等特征,诱导表达获得了具有良好免疫活性的Ii重组蛋白,为进一步研究猪Ii分子结构与功能奠定了基础。     

鸡堆型艾美耳球虫新基因的克隆与生物信息学分析

试验旨在对堆型艾美耳球虫（Eimeria acervulina）孢子化卵囊新基因EST序列进行克隆与生物信息学分析。通过RACE技术扩增从E. acervulina cDNA表达文库中筛选获得的EST序列,得到EST全长cDNA序列,利用多种生物信息学分析软件对其编码蛋白进行分析和预测。结果表明,该EST序列为E.acervulina孢子化卵囊阶段新基因,GenBank登录号为EU590120;该基因含1个492 bp的开放阅读框,编码163个氨基酸,理论分子质量为17.049 ku,等电点为6.69,酸性氨基酸8个,碱性氨基酸8个,分子式为C₇₆₁H₁₂₂₃N₁₉₉O₂₁₉S₁₂;总平均亲水性（GRAVY）为0.731;该蛋白有信号肽,为分泌性蛋白;具有4个跨膜结构,在105～115、28～32和132～138位之间有很强的疏水性;具有1个蛋白激酶C磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、4个N端豆蔻酰基化位点。因此根据生物信息学全面预测和分析,发现该基因所编码的蛋白具有较多的生物学功能位点和潜在的抗原表位区域。     

水貂毛色关联TYRP2基因编码区序列鉴定及比较基因组学分析

探究水貂酪氨酸酶相关蛋白2(TYRP2)基因的分子结构特性及其调控被毛色素沉积的生理功能。利用比较基因组学方法基于水貂皮肤转录组测序获得的TYRP2基因完整编码区(CDS)核苷酸及其编码氨基酸序列的结构特性开展了系统的生物信息学预测及比较基因组学分析。结果:RNA-seq获取的水貂TYRP2基因长度为3 385 bp,CDS长度1 554 bp,共编码517个氨基酸。进一步分析发现,TYRP2编码蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,属混合型二级结构,为酸性不稳定亲水蛋白质;含有1个信号肽,1个跨膜区,形成8对二硫键,包括46个磷酸化位点与7个糖基化位点,179～409位氨基酸为酪氨酸酶家族共有核心结构域。亚细胞定位显示,水貂TYRP2蛋白位于细胞外,属一种分泌型蛋白,主要在细胞内质网中发挥其生物学功能。编码氨基酸序列比对表明,水貂与其他10个食肉目物种TYRP2基因编码氨基酸序列均存在2个保守的铜离子结合位点:CuA和CuB。水貂TYRP2基因鉴定及序列分析为解析其调控被毛色素沉积的生理功能提供了详尽的生物学基础信息。     

貉源阿留申病毒VP2和NS1蛋白的抗原性预测

旨在预测和分析貉源阿留申病毒(RFAV)VP2和NS1蛋白的抗原表位特征,筛选阿留申病毒属较保守的B、T细胞抗原表位。本研究对RFAV的近全长基因组进行克隆及测序,对其VP2和NS1基因编码蛋白的理化性质、二级结构、翻译后修饰位点和抗原表位进行预测,并将预测的修饰位点、抗原表位与其他阿留申病毒种的序列进行比较分析,筛选相对保守的修饰位点和抗原表位。结果显示,获得的RFAV基因组长4 327 bp,编码VP2蛋白的636个氨基酸,编码NS1蛋白的641个氨基酸。VP2和NS1蛋白均为亲水性蛋白,二级结构以无规则卷曲为主。在阿留申病毒属内,VP2蛋白有3个保守的B细胞抗原表位,3个保守的T细胞表位,8个保守的翻译后修饰位点;NS1蛋白有1个保守的B细胞抗原表位,2个保守的T细胞抗原表位和7个保守的翻译后修饰位点。本研究成功克隆了RFAV近全长基因组序列,全面对RFAV的VP2、NS1蛋白抗原表位、翻译后修饰位点进行预测,并分析其在阿留申病毒属内的保守和变异特征,为阿留申病毒免疫研究提供参考。     

Gene Structure Prediction and Molecular Evolution Analysis of Raccoon Dog agouti Gene based on RNA-Seqs

To in-depth analyze the molecular structure characteristics of agouti gene,using bioinformatic methods for RNA-Seqs test to get the complete coding sequence of raccoon dog agouti gene,and its coding protein structure was forecasted and analyzed.The results showed that the length of raccoon dog agouti gene cDNA was 530 bp which contained 396 bp open reading frame (ORF),encoded 131 amino acids.Predicting the weight of the raccoon dog agouti protein molecular was 14.41 ku and isoelectric point (pI) was 9.68,as the unstable hydrophohbic protein;It contained 11 phosphorylation sites,1 glycosylation sites and a long reach 24 amino acid signal peptide;Random coil was the main secondary structure.Phylogenetic tree showed that the raccoon dog had a close genetics distance to vuipe and canis familiaris which was consistent with the traditional animal taxonomy.Through the analysis of the molecular structure characteristics of raccoon dog agouti gene,to provide the oretical basis for revealing the influence of the colour diversity molecular genetics mechanism.     

马鹿生长激素(GH)基因生物信息学预测及分析

为研究马鹿生长激素(GH)基因的结构和功能,从GenBank中下载马鹿、梅花鹿、鼷鹿、牛、山羊、绵羊、猪、人、黑猩猩、挪威大鼠、小家鼠、北极狐、狗、鸡和斑马鱼的GH基因完整编码区(CDS)及氨基酸序列,利用DNAStar 7.0、BioEdit 7.0生物软件与相关在线工具对马鹿GH基因核苷酸序列的基本信息及其编码蛋白的理化特性和结构特征进行了生物信息学预测及分析,对马鹿与其他14个物种GH基因的CDS序列及其编码氨基酸序列进行相似性分析,并基于氨基酸序列构建了15个物种的系统进化树。结果表明:马鹿GH基因DNA序列长度为2 100 bp,包括完整的5个外显子和4个内含子,部分5′UTR和3′UTR,CDS全长654 bp,编码217个氨基酸;其编码的蛋白是一种分子质量为24.588 4 ku,等电点为7.62的疏水性稳定碱性蛋白;存在2个强跨膜区、8个广泛磷酸化位点,二级结构元件以α-螺旋和无规则卷曲为主;该蛋白位于细胞外,含有1个信号肽,属一种分泌型蛋白;马鹿与梅花鹿、牛、绵羊、山羊和鼷鹿等动物的GH基因氨基酸序列相似性较高,亲缘关系最近。该研究结果可为马鹿GH基因的进一步分析提供详细的生物学基础信息。     

黑貉TYRP1基因的克隆及生物信息学分析

为探明黑貉酪氨酸酶相关蛋白1（tyrosinase-related protein 1,TYRP1）基因CDS序列并对其进行生物信息学分析,试验采集黑貉背部皮肤组织提取RNA后反转录为cDNA,根据GenBank中犬科TYRP1基因mRNA序列（登录号：NM_001194966.1）设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增TYRP1基因CDS区,将其插入到克隆载体中,对阳性菌落经PCR验证和序列测定后进行生物信息学分析。结果显示,黑貉TYRP1基因CDS序列全长为1 614 bp,编码537个氨基酸,所编码蛋白属于不稳定可溶性的亲水蛋白质。TYRP1基因与狐的遗传距离较近,说明该基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性。TYRP1蛋白二级结构中,无规则卷曲所占比例最高,为54.0%;α-螺旋次之,为29.8%。TYRP1蛋白三级结构主要由大量无规则卷曲和α-螺旋构成,与二级结构相一致。TYRP1蛋白具有氧化还原酶活性,参与DNA修复和复制、蛋白质合成和降解,可与TYR、DCT、TP53、TRPC1等多种蛋白相互作用。本试验结果为进一步探索TYRP1基因在哺乳动物毛色遗传机制中的功能提供了理论依据。     

会理黑山羊肌肉生长抑制素基因编码序列的克隆与多样性分析

为探究会理黑山羊遗传分化状况,试验参考普通山羊肌肉生长抑制素（MSTN）基因设计引物,采用PCR方法扩增、克隆会理黑山羊MSTN基因编码区,并与其他物种相应基因编码区核苷酸序列进行比对分析。结果表明,会理黑山羊MSTN基因完整编码序列长度为1128 bp,由外显子1（372 bp）、外显子2（375 bp）和外显子3（381 bp）组成;会理黑山羊与建昌黑山羊、黔北麻羊同源性最高,均达97.4%,聚为一簇,亲缘关系最近,与牛、恒河猴、狗等物种的同源性最低,亲缘关系远;会理黑山羊MSTN基因编码区共编码375个氨基酸,会理黑山羊MSTN基因编码的各种氨基酸含量相差较大,其中以亮氨酸含量最丰富,达8.80%。本研究为会理黑山羊的遗传资源保护、开发与利用提供了分子遗传学研究基础。     

Altered expression of melanocortin-1 receptor (MC1R) in a yellow-coloured wild raccoon dog (Nyctereutes procyonoides)

Background – The melanocortin 1 receptor (MC1R) gene plays a key role in determining coat colour in mammals by controlling the proportion of eumelanin and pheomelanin granules. Wild raccoon dogs have a mixed coat colour, with black to brown and grey hairs. Hypothesis/Objectives – The study was performed to identify the cause of the variant yellow coat colour in a wild raccoon dog. Animals – A wild raccoon dog that showed coat colour change to yellow and four wild‐type raccoon dogs that showed normal coat colour were included. Methods – To identify the cause of the variant yellow coat colour, we examined the sequence of the MC1R gene and its expression at the mRNA and protein levels. Results – The coding region of the MC1R gene of this raccoon dog comprised 954 bp, the same as for wild‐type raccoon dogs and domestic dogs. By comparing the gene with that in the wild‐type raccoon dog, a 2 bp deletion was detected in the 5′‐untranslated region, positioned 152 bp upstream of the start codon. However, there was no significant difference in the mRNA expression level. The yellow raccoon dog revealed a significantly decreased MC1R protein level compared with the wild‐type raccoon dogs, indicating an increase in pheomelanin synthesis. Conclusions and clinical importance – These results suggest that the variant coat colour in the yellow raccoon dog was associated with decreased MC1R function.     

水貂PRLR基因的克隆及生物信息学分析

本研究旨在从水貂卵巢组织中克隆催乳素受体(prolactin receptor,PRLR)基因编码区全长序列,并进行生物学信息分析,为研究其结构和功能奠定基础。根据GenBank中登录的犬PRLR基因的mRNA预测序列(登录号:XM_025436332.1)设计1对引物,采集性成熟的健康水貂卵巢组织样本,提取RNA并反转录合成cDNA,以cDNA为模板PCR扩增PRLR基因,将其插入pEASY-Blunt Simple Vector中,筛选阳性克隆测序后进行生物信息学分析。结果显示,水貂PRLR基因编码区序列全长为1 878bp,编码了625个氨基酸,水貂PRLR基因核苷酸序列与海獭同源性最高,为97.7%。系统进化树分析也显示其和海獭亲缘关系最近。对水貂卵巢PRLR基因编码蛋白进行生物信息学分析表明,PRLR蛋白含有1个信号肽,1个细胞外区域,1个跨膜区和1个膜内区;水貂PRLR蛋白为单次跨膜蛋白,其N端的D1部分含有2对保守的二硫键(Cys36—Cys46和Cys75—Cys86),D2部分含有保守的WS-基序(WS-E-WS)。水貂PRLR蛋白具有和其他PRLR蛋白相似的膜外和膜内结构。本试验结果为进一步研究和揭示水貂PRLR蛋白的结构及功能奠定了基础。     

貉IL-2基因的克隆与进化关系的分析

根据GenBank上已发表的犬科动物的白细胞介素-2（IL-2）基因序列，在开放阅读框架上下游的保守区域设计了1对引物。无菌采取貉血，使用淋巴细胞分离液分离外周血液中的淋巴细胞，加入ConA，于二氧化碳培养箱中培养48h后收集培养细胞。以培养细胞中提取的总RNA为模板，应用RT—PCR方法，扩增出貉的IL-2基因。分离纯化片段，连接T载体转化大肠杆菌并测序。结果表明：IL-2基因开放阅读框架全长486bp，编码155个氨基酸。该序列与大、狐等犬科动物的IL-2基因同源关系最近，与大熊猫、家猫的IL-2基因同源关系相对较近，与人、马、牛、绵羊的IL-2基因有一定的遗传距离，与禽类鸡的IL-2基因同源关系最远。     

梅花鹿S100A16基因的克隆及生物信息学分析

为探索梅花鹿（Cervus nippon）S100A16基因序列及生物学特性，本研究根据GenBank数据库中牛、绵羊S100A16基因序列设计引物，以梅花鹿鹿茸顶端组织cDNA为模板，采用RT-PCR技术和分子克隆技术成功获得梅花鹿S100A16基因的cDNA序列。生物信息学分析发现，梅花鹿S100A16基因CDS区全长312 bp，编码103个氨基酸；蛋白含有11个磷酸化位点，有跨膜结构域，无信号肽，为在细胞内发挥作用的稳定蛋白；蛋白仅在C端含有S100蛋白家族经典的EF螺旋结构域，由12个氨基酸组成，N端EF螺旋结构域由15个氨基酸组成；蛋白C端含有FGF-1蛋白结合位点；梅花鹿S100A16蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成；三级结构显示该蛋白有2个Ca²⁺结合位点；梅花鹿S100A16蛋白氨基酸序列与东欧马鹿同源性最高，为100%，与其他部分物种S100A16蛋白氨基酸序列构建系统进化树，分析表明S100A16基因在进化上比较保守，符合功能基因的特点。研究结果为进一步揭示梅花鹿S100A16基因的功能及表达机制提供依据。