基于hipO基因的环介导等温核酸扩增技术检测食源性空肠弯曲菌

空肠弯曲杆菌是人细菌性胃肠炎的常见食源性致病菌之一,严重危害人类的健康,建立快速精准检测食源性空肠弯曲杆菌的方法,对于保障人们的健康和食品安全具有重要意义。本研究建立了一种可视化、低成本基于hipO基因的环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测空肠弯曲菌的方法。该LAMP方法检测空肠弯曲菌CJFX01基因组DNA为阳性,而对肠出血性大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌等食源性致病菌和胸膜肺炎放线杆菌Aha01、副猪嗜血杆菌Ahh01、多杀性巴氏杆菌Ahm03、猪链球菌Ahs02、猪丹毒丝菌Ahe01、支气管败血波氏杆菌Ahb01等猪源致病菌基因组DNA检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。灵敏度的检测结果表明,LAMP检测空肠弯曲杆菌的检测限为5.4×10¹ CFU/mL,而基于F3/B3引物对常规PCR的检测限为5.4×10⁶ CFU/mL,即LAMP检测空肠弯曲杆菌的灵敏度比常规PCR高100 000倍。本研究建立的LAMP检测方法具有快速、可视化、低成本、特异性好和灵敏度...     

4种牛分枝杆菌特异性基因PCR检测方法的比较与评价

牛分枝杆菌是严重危害养牛业的重要人兽共患病原微生物，PCR是检测该病原的有效手段之一。本研究通过筛选最佳的PCR检测方法，以期为临床监测牛分枝杆菌感染提供技术参考。针对牛分枝杆菌4种常见的特异性基因(16S rRNA、IS6110、IS1081和Mpb64)分别设计引物，通过温度梯度PCR法确定最适退火温度；采用牛分枝杆菌参考株核酸确定PCR最小检测限，同时运用牛分枝杆菌国内参考株、牛分枝杆菌国际参考株、禽分枝杆菌、胞内分枝杆菌、副结核分枝杆菌、羊种布鲁菌以及牛种布鲁菌进行特异性比较试验；最后运用人工模拟牛分枝杆菌感染组织样本(肺脏、淋巴结、奶样)比较不同PCR方法检测效果。4对引物以60℃为退火温度时均能检测分枝杆菌，其中IS6110、IS1081和Mpb64基因引物可以特异性检测牛分枝杆菌。IS6110和IS1081基因引物对牛分枝杆菌基因组的检测灵敏度最高，可达10^-10 ng/μL;IS6110基因引物在肺脏和淋巴结中牛分枝杆菌检测灵敏度可达10⁶ CFU/mL以上，而Mpb64基因引物对奶样中牛分枝杆菌的检测灵敏度可达10^...     

基于nuc基因的环介导等温核酸扩增可视化技术检测食源性金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌食物中毒主要是由食用被金黄色葡萄球菌及其所产生的肠毒素污染的奶、肉、蛋、糕点、剩饭等蛋白或淀粉含量丰富的食品引起,快速精准的金黄色葡萄球菌检测技术对于保障人们的健康和食品安全具有重要意义。本研究以nuc基因作为检测靶基因,建立了一种检测金黄色葡萄球菌的环介导等温核酸扩增(LAMP)技术。该方法检测金黄色葡萄球菌基因组DNA样品为阳性,而对单细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、肠出血性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌和产气荚膜梭菌等食源性致病菌和猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌等猪源细菌基因组DNA检测结果均为阴性,表明建立的LAMP方法具有较好的特异性。灵敏度的检测结果表明,LAMP的检测限可达5.6×10¹ CFU/mL,而常规PCR的检测限为5.6×10⁵ CFU/mL,即LAMP的检测灵敏度比常规PCR高出10 000倍。临床样品的检测结果表明,50份猪肉样品中有4份检出金黄色葡萄球菌。本研究为食源性金黄色葡萄球菌提供了一种快速、可视化、特异性好、灵敏度高、成本低的LAMP检测方法。     

检测创伤弧菌两种毒力基因的环介导等温扩增检测方法的建立

为建立快速检测致病性创伤弧菌两种毒素的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,分别以创伤弧菌溶血素A基因(hemolysin gene A,HA)和多重毒素(repeats in toxin,RTX)毒力基因的保守序列作为靶序列设计内、外引物。通过肉眼观察白色沉淀初步判断检测结果,通过琼脂糖电泳最终确定检测结果。LAMP检测创伤弧菌的两种基因的灵敏度都达到10 CFU/mL。特异性结果表明致病性创伤弧菌的结果为阳性,而其他几种常见弧菌和食源菌检测结果为阴性。在人工模拟样品检测中,LAMP结果显示,采用水煮法提取DNA,从样品处理到报告结果耗时1.5 h,鱼肉中创伤弧菌的检出限为1×10~2 CFU/g(RTX)和1×10~4 CFU/g(HA);采用同样方法提取DNA进行普通PCR,其检出限为1×10~3 CFU/g(RTX)和1×10~4 CFU/g(HA),耗时4 h。结果表明,本研究建立的LAMP方法检测创伤弧菌两种毒力基因时具有灵敏度高、特异性强、方法简便等优点,适用于食品和养殖业中的现场快速检测。     

快速检测大肠杆菌O157的LAMP方法的建立与评价

利用DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以rfbE基因为靶序列,设计LAMP引物,建立LAMP反应体系与条件,进行灵敏度和特异性试验.结果显示,整个检测过程仅需1h即可通过肉眼直接目测试验结果.在灵敏度试验中,rfbE-LAMP对O157菌液和模拟阳性样品的最低检测限分别为1CFU/mL和1 CFU/g.在特异性试验中,以其他血清型大肠杆菌以及沙门杆菌基因组DNA为模板对rfbE基因进行检测,均没有发生非特异性扩增反应.试验建立的LAMP检测方法具有操作简单安全、检测灵敏度高、特异性高的特点,能够满足基层实验室、应急检测或现场监测等方面的使用需求.     

加环引物LAMP法快速检测布鲁氏杆菌方法的研究

研究以布鲁氏杆菌保守的OMP25蛋白基因为靶基因,设计了6条LAMP特异性引物,同时探讨了加环引物对LAMP的影响,通过优化LAMP体系的反应条件,建立了一套快速检测布鲁氏杆菌的新方法。LAMP扩增产物可通过凝胶电泳和荧光显色进行判定。该研究比较了LAMP法和加环引物LAMP法的灵敏度,并检测了其引物特异性。试验结果显示,普通LAMP法的灵敏度为20CFU/mL,加环引物的LAMP法的灵敏度为2.0CFU/mL。通过两种方法的比较可知:LAMP法可以快速、直观、准确地检测布鲁氏杆菌,加环引物可进一步提高LAMP的扩增效率,是一种在基层现场有广泛应用前景的检测方法。     

猴痘病毒实时荧光LAMP检测方法的建立

为建立一种特异性强、灵敏度高、操作简单的猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)检测方法,试验针对MPXV保守区OPG002基因片段设计特异性引物,通过优化环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)反应体系中内引物、环引物体积及反应温度建立了一种MPXV实时荧光LAMP检测方法,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,并应用该方法检测了临床样品和模拟样品。结果表明：建立的MPXV实时荧光LAMP检测方法于64℃恒温反应60 min即可完成DNA检测;该方法能特异性地检出MPXV,最低检出限为25 copies/μL,灵敏度是普通PCR方法的20倍;该方法对12份临床样品的检测结果均为阴性,可检测出质粒浓度为0.5×10²～0.5×10⁶ copies/μL的模拟阳性样品。说明建立的MPXV荧光LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单的优点,可用于MPXV的快速鉴别诊断。     

环介导等温扩增技术检测酸乳中蜡样芽孢杆菌

目的：建立快速准确检测酸乳中蜡样芽孢杆菌的方法.方法：根据蜡样芽孢杆菌hblA基因设计特异性引物,通过环介导等温扩增技术（LAMP）直接检测酸乳中蜡样芽孢杆菌,扩增产物电泳检测.结果：LAMP法检测酸乳中蜡样芽孢杆菌的特异性强,方法检出限6.4CFU/mL,人工污染检出限21CFU/mL.结论：LAMP法用于检测酸乳中蜡样芽孢杆菌的灵敏度高、耗时短,为酸乳中蜡样芽孢杆菌的快速检测提供了新的方法.     

Chelex-100法直接提取乳样中奶牛乳房炎主要致病菌DNA方法的建立

为建立一种直接从乳样中快速提取细菌DNA的方法,试验通过人工制备8个倍比稀释细菌的乳样,检测了Chelex-100法提取3种奶牛乳房炎主要致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌)DNA进行PCR扩增的敏感性,并与苯酚—氯仿法进行了比较分析。结果显示,以Chelex-100法提取乳样中细菌DNA进行PCR扩增具有较高的敏感性,所检测金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌的最小浓度分别为10³、10²、10² CFU/mL;而使用苯酚—氯仿法提取乳样中各细菌DNA的PCR敏感性均为10⁴ CFU/mL。综上所述,Chelex-100法提取乳样细菌DNA的PCR敏感性可以满足临床检测奶牛乳房炎的需要,显现了简单快速、经济、无污染的优点,为从乳样中直接提取细菌DNA提供了新的思路,对PCR快速检测乳房炎致病菌具有重要意义。     

结核杆菌多位点环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种快速、高敏感、高特异、鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,本研究根据大多数致病性结核分枝杆菌共有序列esat-6,结核分枝杆菌和牛分枝杆菌gyrB共有特异性序列,以及结核分枝杆菌种特异序列mtp40设计6对特异性引物对痰液中的结核分枝杆菌进行检测,并与鉴别培养基分离培养结果以及常规PCR鉴定结果进行比较。实验结果表明,建立的LAMP检测方法具有很高的特异性。可区分致病性结核分枝杆菌和非致病结核分枝杆菌,也可鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。LAMP检测技术的灵敏度比经典PCR技术高100倍左右,可检测到7拷贝/反应。另外,用3种方法同时检测样品发现,LAMP与细菌培养的符合率为90.91%,LAMP与常规PCR检测结果的符合率为100%。LAMP检测方法可以在流行病学调查及现场快速诊断方面广泛应用,并为临床治疗提供依据。     

Study on Optimization of the Conditions of Detecting Mycobacterium tuberculosis in Milk by Technique of Loop-mediated Isothermal Amplification

To optimize the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method to detect Mycobacterium tuberculosis in milk,the highly conservative 16S rRNA gene of Mycobacterium tuberculosis was selected as a target to design specific primers.Compared the modified method of CATB/NaCl,bacterial genome DNA extraction kit and thermal cracking method to extract the DNA of Mycobacterium tuberculosis,the best approach was chosen.Mycobacterium tuberculosis suspension liquid was diluted with sterilization milk to confirm the susceptibility of this assay.And then Brucella,Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Listeria monocytogenes,Bacillus pasteurii and Salmonella were used for specificity detection.The results showed that the modified method of CATB/NaCl was better than the others.The sensitivity of LAMP was 3×10⁰ CFU/mL,and the specificity was 100%.The sensitivity of detecting Mycobacterium tuberculosis in milk by LAMP was 3×10¹ CFU/mL.     

牛、羊、猪、犬布鲁氏菌病多重PCR方法的建立

The purpose of the experiment was to establish a rapid multiplex PCR detection method which could distinguish B.abortus，B.melitensis，B.suis and B.canis. According to the differences of IS711 and complete genome sequences，four pairs of primers were designed. Multiplex PCR reaction system and conditions were optimized，the specificity，sensitivity and stability of the multiplex PCR were analyzed.Through the establishment of the multiplex PCR，B.abortus，B. melitensis，B. suis and B.canis could amplify the expected fragment，the sizes of the expected fragment were 494，732，591 and 272 bp，respectively. The PCR sensitivity of B.abortus，B.melitensis，B.suis and B.canis were 1.1×10²，5.1×10²，3.5×10² and 2.5×10² CFU/mL，respectively. Detected artificially infectious samples of milk by PCR，PCR sensitivity could reach 1.0×10³ CFU/mL.The developed multiplex PCR method was simple，fast，high sensitivity，and had good prospects and important significance for the identification of B.abortus，B.melitensis，B.suis and B.canis.     

实验猴粪便样品中沙门氏菌LAMP检测方法的建立及应用简

A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay was developed for detection of Salmonlla in fecal samples of experimental monkeys. According to the specific sequences (fimY) of Salmonlla in GenBank, one set of primers was selected and the reaction condition was optimized. The results showed that the detection limit of LAMP method was 1.35×10¹ and 1.35×10³ CFU/mL in Salmonella pure culture and clinical samples,respectively,which was the same as routine PCR. The amplification could complete in one hour, and the result could be distinguished by naked eyes. There was non-specific amplification of other pathogens. These results suggested that this LAMP assay was a simple and specific method for rapid detection of Salmonlla in fecal samples.     

沙门氏菌LAMP检测方法的建立

The assay was aimed to establish a rapid, sensitive and specific method of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for the detection of Salmonella. According to the highly conserved STN gene of Salmonella reported in GenBank, we designed a set of primers, and then followed by a series of LAMP optimization of reaction conditions, specificity test, sensitivity test, stability test and enzyme test. The sensitivity of LAMP and conventional PCR were compared.The results showed that the optimal reaction temperature of LAMP was 65 ℃, when only amplification of Salmonella, the minimum detectable concentration was 10¹ CFU/mL, which was more than conventional PCR detection by one order of magnitude. The results showed that LAMP method had the qualities of specificity, high sensitivity, short time-consuming and convenience for the detection of Salmonella, which was expected to develop into an effective method     

陕西青脚麻肉鸡肠道定殖菌的生活状态和分布研究

为了解陕西青脚麻肉鸡肠道定殖菌的生活状态及分布,试验采用梯度稀释和组织培养方法对青脚麻肉鸡肠道定殖菌进行培养并计数。结果表明,芽孢菌在青脚麻肉鸡小肠中后段达到最大值,菌体总数达6.5×10⁵ CFU/mL;酵母菌在盲肠中的菌体总数仅为6.8×10⁴ CFU/mL;乳酸菌在十二指肠后段的菌体总数仅为8.6×10⁴ CFU/mL。综上所述,陕西青脚麻肉鸡肠道中定殖有芽孢菌的分布,酵母菌和乳酸菌定殖甚少。     

解淀粉芽孢杆菌SSY1株的安全性试验

为评估1株产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌SSY1株的安全性,本试验对其进行了急性毒性、慢性毒性、细菌易位、代谢产物及药敏等安全性试验。急性毒性试验分为高剂量组（1.30×10¹⁰ CFU/mL）、中剂量组（0.90×10¹⁰ CFU/mL）、低剂量组（0.65×10¹⁰ CFU/mL）和生理盐水对照组,一次性灌服后观察14 d,处死存活小鼠,剖检。慢性毒性试验分为高剂量组（0.65×10¹⁰ CFU/mL）、中剂量组（0.65×10⁹ CFU/mL）、低剂量组（0.65×10⁸ CFU/mL）和生理盐水对照组,各组灌服1次/d,连续灌服30 d。结果表明,急性毒性试验小鼠的精神、食欲、行为、粪便等均未见异常,试验鼠全部存活,剖检未见病理变化;慢性毒性试验小鼠均无异常临床变化,剖检小鼠也未见病变,高、中、低剂量组及对照组间小鼠增重、饲料利用率、血液学指标、血液生化指标及脏器系数均差异不显著（P>0.05）;解淀粉芽孢杆菌SSY1菌株在小鼠体内未发生易位,氨基脱羧酶、吲哚试验均为阴性,在测定的24种常用药物中,除林可霉素耐药外,菌株对其余23种药物均敏感。试验证实,解淀粉芽孢杆菌SSY1株的安全性良好。     

Evaluation of Safety of Bacillus amyloliquefaciens SSY1

In order to determine the safety of Bacillus amyloliquefaciens SSY1, we carried out the acute toxicity, chronic toxicity, bacterial translocation, product of metabolism and drug susceptibility test. Acute toxicity test in high dose groups (1.30×10¹⁰ CFU/mL), middle dose group(0.90×10¹⁰ CFU/mL), low dose group (0.65×10¹⁰ CFU/mL) and normal saline control group. After the acute toxicity test, the mice were sacrificed 14 days after the observation. Chronic toxicity test of each group was administered once a day for 30 d, chronic toxicity test in high dose groups (0.65×10¹⁰ CFU/mL), middle dose group (0.65×10⁹ CFU/mL), low dose group (0.65×10⁸ CFU/mL) and normal saline control group. The results showed that all mice were without exception phenomenon, the spirit, appetite, behavior and feces and so on, no pathological changes were found on the acute toxicity test. Chronic toxicity test of the mice were no abnormal clinical changes, and there were no pathological changes. Body weight and feed utilization rate of mice, hematology, blood biochemistry indexes and viscera coefficient difference were not significant (P>0.05);Bacillus amyloliquefaciens SSY1 strain did not occur translocation in mice, amino acid decarboxylase and indole test were negative, among the 24 kinds of commonly used drugs, the strains were sensitive to 23 kinds of drugs except the cillimycin. This experiment proved that Bacillus amyloliquefaciens SSY1 had good security.     

大肠杆菌与金黄色葡萄球菌对奶牛子宫内膜组织细胞因子表达及损伤程度的影响

本试验旨在研究体外感染金黄色葡萄球菌与大肠杆菌对奶牛子宫内膜组织中细胞因子白介素-6（IL-6）、IL-1β和IL-8的表达及损伤程度的影响。以体外培养的奶牛子宫内膜组织作为研究对象,采用1×10⁵~1×10⁹ CFU/mL大肠杆菌与金黄色葡萄球菌对奶牛子宫内膜组织进行体外感染,通过实时荧光定量PCR和ELISA方法检测两种细菌刺激后奶牛子宫内膜组织中IL-6、IL-1β及IL-8 mRNA与蛋白的表达量,并用HE染色法观察两种细菌感染后奶牛子宫内膜组织病理学切片。结果显示,1×10⁵~1×10⁹ CFU/mL大肠杆菌体外感染后,奶牛子宫内膜组织中IL-6、IL-1β和IL-8 mRNA表达量均极显著高于空白对照组（P<0.01）;金黄色葡萄球菌感染浓度为1×10⁵、1×10⁶ CFU/mL时,IL-6、IL-1β mRNA表达量极显著高于空白对照组（P<0.01）,感染浓度为1×10⁷ CFU/mL时,IL-6、IL-1β mRNA表达量显著高于空白对照组（P<0.05）,感染浓度为1×10⁶ CFU/mL时,IL-8 mRNA表达量显著高于空白对照组（P<0.05）,其他感染浓度均与空白对照组无显著差异（P>0.05）。奶牛子宫内膜组织感染1×10⁵~1×10⁹ CFU/mL金黄色葡萄球菌和大肠杆菌时,IL-6、IL-1β及IL-8蛋白表达量均极显著高于空白对照组（P<0.01）。相同浓度的大肠杆菌感染奶牛子宫内膜组织后,IL-6、IL-1β及IL-8 mRNA与蛋白表达量均极显著高于金黄色葡萄球菌感染组（P<0.01）。HE切片染色结果显示,大肠杆菌感染后仍有部分上皮细胞保留,而金黄色葡萄球菌感染后上皮细胞全部脱落。本试验结果表明,大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染奶牛子宫内膜组织后,引起的炎症反应不同。大肠杆菌感染后,促炎性细胞因子被显著上调,而金黄色葡萄球菌感染后破坏子宫内膜上皮细胞程度更加严重。     

鹿场环境中细菌的分布及耐药性调查

为探究辽宁省西丰县鹿场环境中细菌的分布及耐药性情况,本试验采集了鹿场粪便、饮水、空气、饲料等样品,进行了细菌的分离培养及鉴定,对分离到的菌株16S rDNA基因进行PCR扩增、测序分析,并对分选出的致病菌和条件致病菌进行药敏试验。结果显示,所测样品共分离纯化出27株菌,公鹿精饲料、母鹿精饲料、粗饲料和水的含菌量分别为1.0×10⁵、8.7×10⁴、2.7×10⁷ CFU/g和2.9×10⁴ CFU/mL,表明水和粗饲料不符合国家规定的养殖场环境卫生要求;16S rDNA基因序列在NCBI比对后,鉴定出有大肠埃希菌、志贺氏菌等15种不同菌株,其中致病菌和条件致病菌共13种,这13种细菌对呋喃唑酮、多黏菌素B和头孢氨苄等耐药,对头孢曲松、环丙沙星和丁胺卡那等药物敏感。本试验结果可为鹿场细菌性疾病的防控及用药提供参考依据。