RT-PCR检测猪瘟病毒方法的建立与应用

建立RT PCR检测猪瘟病毒的方法。根据已发表的猪瘟病毒E2基因 (囊膜糖蛋白gP55基因 )序列 ,设计合成了一对特异性引物 ,扩增片段的大小为 50 7bp ,用RT PCR技术对石门系标准株和 1 0株分离株进行检测。结果这对引物对标准株和 1 0株分离株均能扩增出与预期大小相符 50 7bpRT PCR产物 ,而对其他 6种猪病病原核酸的扩增结果为阴性。该RT PCR可检出 1 0 0pg的猪瘟病毒RNA模板 ,对人工感染猪不同组织样品进行检测 ,结果对白细胞抽提的核酸样品检出率最高为 1 0 0 % (2 4 / 2 4 ) ,其次为扁桃体、脾、肾 ,检出率为 83 3 % (2 0 / 2 4 ) ,再者为淋巴结 ,检出率为66 7% (1 6/ 2 4 )。对送检的 1 9份疑似猪瘟的病死猪病料组织进行RT PCR检测 ,结果有 1 6份样品为猪瘟病毒阳性。兔体交叉反应试验结果RT PCR阳性的 1 6份病料中 ,有 1 4份样品被判为含有猪瘟病毒 ,其他病料兔体交叉反应试验结果全为阴性     

动物狂犬病病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

以GenBank收录的多基因型狂犬病病毒(RV)N基因序列为参考,设计了简并的PCR引物,建立了能够有效扩增7种基因型RV基因组片段的巢式RT-PCR(nested RT-PCR)方法,命名为RVN371.该方法能够检测到4.6个TCID50的SRV9固定毒,对犬、猪、蝙蝠及牛的狂犬病阳性脑组织样品均表现出良好的特感性:扩增产物目的带位置正确,未见非特异性扩增条带.对比试验表明,RVN371对街毒脑组织样品检测的灵敏度较乳鼠脑内接种试验(MIT)高出100倍;在对3种鼠脑固定毒、12种犬脑街毒样品的检测中,与RV检测的金标方法--免疫荧光试验(FAT)完全符合.RVN371为动物狂犬病的实验室诊断和流行病学研究提供了有利的工具.     

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5＇端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针，建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株，未能检测出牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞；对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析，与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50／mL，整个试验流程只需2h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本，两种方法的检出率分别为17．4％和13．5％，两者符合率为95．7％（198／207）；荧光RT-PCR的检出率高于ELISA，两者差异显著。结果表明，建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。     

猪Kobu病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为了对猪Kobu病毒进行快速诊断及流行病学监测,根据GenBank中公布的9条猪Kobu病毒基因组全序列,在3CD非结构蛋白保守区域设计并合成了2对特异性引物,建立了猪Kobu病毒的巢式RT-PCR检测方法,并用该方法对猪Kobu病毒DX株动物回归试验发病的25头仔猪的组织病料以及送检的72份临床样本进行检测.结果表明,使用该方法对25头发病猪内脏病料的阳性检出率为100％;对送检的72份临床样品的阳性检出率为87.5％ (63/72).该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于猪Kobu病毒的临床快速诊断及流行病学监测.     

猪瘟病毒RT-PCR检测方法的研究

为建立一种能够快速、确切诊断猪瘟（CSF）的方法,根据GenBank上已发表的猪瘟病毒（CSFV）核酸序列设计并合成了一对能特异性扩增CSFV基因片段的引物,经过条件优化后,建立了检测CSFV的RT-PCR方法,扩增病毒核酸片段长508bp。试验证明,该方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,简便、快速、高效,为CSFV的快速准确诊断及进一步的CSF流行病学研究提供了重要的技术手段。     

兔病毒性出血症病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速的兔病毒性出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)病原检测方法,本研究根据GenBank上登录的RHDV VP60基因序列,设计合成内外2对引物,优化PCR反应条件,建立了检测RHDV的巢式RT-PCR方法。该方法对兔轮状病毒、仙台病毒、健康兔肝脏组织的扩增结果均为阴性;该方法第1次扩增的敏感性是10 ng,第2次扩增的敏感性是0.1 ng,第2次比第1次扩增的敏感性高100倍。建立的巢式RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可以准确快速检测出极低含量的RHDV,将为兔病毒性出血症的病原检测及分子流行病学调查等提供一种快速、简单、高效、特异、灵敏的检测方法。     

基于Erns基因的猪瘟病毒一步法RT-PCR快速检测方法的建立和应用

根据猪瘟病毒Erns基因保守序列设计了1对引物,建立了检测猪瘟病毒一步法反转录-聚合酶链（RT-PCR）方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对CSFV扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性;对猪瘟病毒检测的灵敏性为10 pg总RNA量。以上结果表明,该一步法RT-PCR特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪瘟的早期确诊和病毒鉴定。     

基因1型狂犬病病毒核酸巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

针对我国狂犬病临床诊断的现实需求,本研究根据狂犬病病毒基因组核苷酸保守序列,设计巢式引物,对引物工作浓度和退火温度进行了优化,并对RT-PCR敏感性、特异性和重复性进行了检验.结果显示,巢式RT-PCR方法最低能够检测0.01 MILD50/30μL的脑组织病毒量,对阳性样品和非狂犬病感染样品的3次重复检测结果均与狂犬病诊断OIE推荐方法(荧光抗体染色法)的确定结果完全一致;在针对203份临床样品的检测中,FAT疑似样品通过MIT和巢式RT-PCR进一步确诊,巢式RT-PCR显示出较高的敏感性和特异性.以上表明,本研究建立的狂犬病病毒核酸巢式RT-PCR方法高度敏感和特异,可以用于FAT和MIT疑似样品的辅助检测,为试剂盒的研发与应用奠定基础.     

兔出血症病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank公布的兔出血热病毒(Rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV)序列,设计了3条引物,对引物组合进行了筛选,优化PCR体系各反应条件,测定该方法的敏感性与特异性,并进行临床应用对比试验。结果显示,筛选出的引物组合能够特异性扩增331 bp产物,Mg2+浓度1.0~1.5 mmol/L时扩增效果最好,退火温度在50℃~60℃之间扩增无差异性。该方法可以扩增102拷贝以上的模板,对兔轮状病毒与水泡性口炎病毒检测结果均为阴性;临床应用对比实验显示,与HA检测相比,该方法检出阳性率由66.7%提升至77.8%。本研究建立的RT-PCR诊断方法具有特异、灵敏、快速等特点,能够用于该病的临床检测,为防控该病提供了技术保障。     

Establishment and Application of Real-time Quantitative PCR Assay for Detection of Classical Swine Fever Virus

A Real-time quantitative PCR assay for detection of classical swine fever virus (CSFV) was developed using the specific probe and primers designed basing on the E2 gene of CSFV. The Real-time quantitative PCR assay was established using the total RNA of CSFV as template. The specificity, sensitivity and repeatability of the assay were tested, and samples taken from clinic suspicious CSFV infected pigs had been testified by the established assay. The results indicated that the Real-time quantitative PCR assay was successfully established, and showed a good linear relationship at a template range of 10¹ to 10⁶ copies/μL with a coefficient correlation of 0.999; The specificity of the assay revealed that amplifications were showed on CSFV samples, but other pathogens had no amplifications; The sensitivity of the assay was 10 copies/μL nucleic acid and 1 TCID₅₀/mL virus; Meanwhile,19 positive samples were detected, which were consistent with results of CSFV detected by Nested RT-PCR, cloning and sequencing. The eatablished Real-time quantitative PCR assay was specific, sensitive rapid and suitable for early detection and epidemiological study of CSFV.     

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感、特异的猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中CSFV E2基因保守区域序列,设计了一对特异性引物和一条特异性探针,以CSFV总RNA为反转录模板,经优化反应条件,建立CSFV实时荧光定量PCR检测方法,并对其进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对35份临床疑似CSFV感染样品进行了检测。结果表明,本研究建立的CSFV实时荧光定量PCR检测方法在10¹~10⁶拷贝/μL范围内有很好的线性关系,相关系数为0.999;CSFV细胞培养物出现阳性扩增信号,但ST正常细胞对照和其他8种病原对照未出现扩增,特异性良好;该方法重复性好、敏感性高,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,并且CSFV的最低检测限为1 TCID₅₀/mL;自35份疑似CSFV感染样品中检出19份阳性样品,与本课题组建立的CSFV Nested RT-PCR检测结果和克隆测序结果一致。本研究成功建立了CSFV实时荧光定量PCR检测方法,可用于CSFV的快速检测。     

猪瘟病毒化学发光抗体检测方法的建立与应用

旨在建立猪瘟病毒(CSFV)化学发光抗体检测方法,本研究以CSFV E2蛋白作为包被抗原,山羊抗猪IgG-HRP抗体作为酶标抗体,鲁米诺为底物溶液,优化检测方法,成功建立CSFV化学发光抗体检测方法.该方法能在室温20 min内完成对CSFV抗体血清特异性检测,灵敏度与商品化CSFV抗体检测试剂盒相当,且与A型口蹄疫病...     

鉴别非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒野毒株二重TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

旨在建立特异、敏感的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法,用于非洲猪瘟病毒（ASFV）和猪瘟病毒（CSFV）野毒株的快速鉴别检测。针对ASFV的P72基因和CSFV野毒株的5'UTR非编码区序列的保守区域分别设计1对特异性引物和1条探针,经优化反应条件,建立一种基于TaqMan MGB探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和稳定性,对50份临床样品进行检测,并与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法进行比较分析。结果显示：建立的鉴别ASFV和CSFV野毒株二重FQ-PCR检测方法在10⁰~10⁶拷贝·μL^-1模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和CSFV基因出现阳性扩增信号,但对猪瘟病毒疫苗株、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、副猪嗜血杆菌等病原对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在1.18%~2.08%,重复性良好;对ASFV和CSFV的最低检测模板浓度均为10拷贝·μL^-1;利用建立的二重FQ-PCR方法对50份临床样品进行检测,检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法结果完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法,为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。     

猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR的建立及其对人工感染猪体内猪瘟病毒的检测

本研究应用猪瘟病毒通用引物和野毒特异性TaqMan探针,并以质粒作为阳性标准品,结合Corbett公司的RotorGene3000荧光定量PCR仪,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测猪瘟病毒核酸载量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在10^8-10^1范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10拷贝/μL的病毒核酸,与本实验室建立的RT-套式PCR（RT-nPCR）具有相近的敏感性,二者对152份不同样品检测符合率达94.7%。应用本方法对人工感染10^6TCID50猪瘟石门强毒的猪只感染后0-14 d全血中猪瘟病毒RNA进行了定量检测,揭示了猪瘟病毒在猪体内复制的动态变化,证实了感染猪临床表现与病毒滴度存在明显的时间相关性。此外发现,在同居感染猪出现猪瘟临床症状前3-4 d可从其全血中检出病毒RNA。     

2020年新疆部分地区猪瘟病毒抗体检测及分析

为了解2020年新疆部分地区规模化猪场的猪瘟病毒（CSFV）抗体水平,本试验应用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）,对采自18个规模化猪场的1 085份血清样品进行猪瘟病毒抗体检测。结果显示,CSFV抗体平均合格率为83.59%（907/1 085）,高于国家规定标准（70%）,平均阻断率为（66.99±25.09）%。A、B、C、D、E地区间猪瘟病毒抗体水平差异显著（P<0.05）。各规模猪场猪群抗体合格率在70%~87%之间,并且差异显著。此次检测结果表明,6个不同地区平均抗体合格率中,A、B、C、F地区抗体水平整齐度良好,E地区抗体水平偏低,变异系数偏大,抗体整体水平较差。大型规模养猪场猪瘟抗体合格率普遍高于中、小型规模养猪场,说明大型规模养猪场在猪瘟的防控方面具有一定优势。该结果可为新疆地区规模化猪场的猪瘟免疫防控提供参考。     

猪瘟病毒3种检测方法的比较

本研究旨在比较3种检测猪瘟病毒方法的优缺点。应用反转录—复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)、荧光抗体法、胶体金免疫层析试纸条3种方法,分别对 30份疑似猪瘟病料中的猪瘟病毒进行检测。试验结果显示,RT-nPCR方法检出阳性样品数为11份,荧光抗体法为13份,胶体金免疫层析试纸条为8份;3种方法检测全为阳性8份,全为阴性17份。试验结果表明,荧光抗体检测法所需时间较短,但需要经验比较丰富人员来判定结果,且存在假阳性结果, 敏感性比较差;胶体金免疫层析试纸条诊断方法最大的优点就是简便快速,且适合基层的应用,该方法的不足之处就是敏感性较低;RT-nPCR检测法具有快速、敏感等优点,但需一定仪器设备及成熟的技术方法。RT-nPCR还能区分待检样品为疫苗毒株(弱毒)还是野毒株感染(强毒),这是其他2种方法所不可比拟的。     

鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的单一与二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种对猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）临床样本快速、简便的检测技术,以区分猪瘟（classical swine fever,CSF）野毒和疫苗毒感染,为规模化猪场CSF净化奠定基础。通过对GenBank中CSF野毒、疫苗毒及近源病毒的基因组全序列比对,发现CSF兔化弱毒疫苗株3’-NTR独立存在富含T的插入序列,根据这一特点分别在该插入序列的上、下两端设计2对单一RT-PCR引物并选择特异保守区域设计了二重RT-PCR引物,优化筛选能够鉴别CSF野毒与兔化弱毒疫苗的PCR反应条件,建立了能鉴别CSF野毒和疫苗毒的单一与二重RT-PCR鉴别诊断方法。敏感性和特异性分析表明,单一RT-PCR检测CSFV各引物最低核酸检测量分别为2.2 pg（单一RT-PCR中的1对引物）和1.7 pg（单一RT-PCR中的另外1对引物）;二重RT-PCR检测CSFV各引物最低核酸检测量分别为8.2 pg（CSF野毒）和6.7 pg（CSF疫苗毒）,两种方法均检测不到PRV、PRRSV、JEV、BVDV、PCV2的DNA/RNA。采用该方法对146份可疑临床样品进行检测,结果表明CSF疫苗毒与野毒在能繁母猪、育肥猪、保育猪和哺乳仔猪中的二重感染率分别为6.3%、7.4%、8.3%、8.6%。本研究建立的单一与二重RT-PCR方法都具有敏感性强、特异性优、重复性好的特点,该研究对规模化猪场猪瘟的净化具有十分重要的参考价值。