猪A组轮状病毒主要蛋白的编码基因DNA疫苗联合免疫的研究

为研究猪A组轮状病毒(PRV-A)血凝蛋白(VP4)、群抗原蛋白(VP6)和中和抗原蛋白(VP7)编码基因疫苗联合免疫的效力,本研究将表达PRV-AVP4、VP6、VP7蛋白基因的真核表达质粒pVAX1-VP4、pVAX1-VP6、pVAX1-VP7以pVAX1-VP4+pVAX1-VP7(B组)和pVAX1-VP4+p VAX1-VP6+pVAX1-VP7(A组)设计试验组,分别以100μg/只经肌肉注射途径免疫BLAL/c小鼠,间隔2周以相同剂量、途径加强免疫,共免疫3次,免疫后不同时间采血,采用ELISA检测血清抗体。结果显示,B组在免疫后14 d和42 d检测到RV抗体阳性(P/N≥2),A组在免疫后14 d、28 d、42 d均检测到RV抗体阳性(P/N≥2);脾脏免疫相关细胞测定结果表明,A组的CD4~+/CD8~+T淋巴细胞比值和CD19~+B细胞数量均高于B组,两组与对照组相比差异显著(p0.05);淋巴细胞转化试验显示A组的SI值均高于B组,并且42 d时A、B两组差异显著(p0.05)。上述结果表明,3组分联合免疫的DNA疫苗可以诱导小鼠产生较强的体液和细胞免疫应答,为PRV-A的核酸疫苗研究奠定了基础。     

靶向融合犬细小病毒DNA疫苗免疫犬试验研究

为了评价靶向融合犬细小病毒DNA疫苗pVAX1-CTLA-4125-VP2228在自然宿主体内的免疫应答和攻毒保护效果,试验选用CPV抗体阴性犬24只,分为4组,分别为第Ⅰ组(pVAX1-VP2228免疫)、第Ⅱ组(pVAX1-CTLA-4125-VP2228免疫)、第Ⅲ组(pVAX1免疫)、第Ⅳ组(弱毒苗免疫),每组6只犬,间隔4周免疫1次,免疫3次。采用CPV酶联免疫吸附试验(ELISA)、CPV微量中和试验和CPV血凝抑制试验(HI)检测抗体水平。免疫3次后进行攻毒试验,观察保护效果。结果表明:血清中IgG含量第Ⅱ组高于第Ⅰ组,差异极显著(P0.01);中和抗体效价,第Ⅱ组高于第Ⅰ组,差异极显著(P0.01);第Ⅱ组出现HI抗体,而第Ⅰ组未出现HI抗体;攻毒后发现pVAX1-CTLA-4125-VP2228、pVAX1-VP2228具有较好的保护力。说明CTLA-4125能够有效增强自然宿主对VP2228的免疫应答作用,可为进一步研究靶向融合DNA疫苗的作用机制奠定基础。     

犬细小病毒VP2基因编码主要抗原表位区的核酸免疫及其免疫原性研究

为评价犬细小病毒(CPV)VP2主要抗原表位的免疫原性,本研究对CPV YZ株VP2的氨基酸序列进行分析,确定了主要抗原表位区域(VP2-228),通过PCR扩增相应的表位编码区域基因片段(700 bp),将其克隆于真核表达载体p VAX1中构建重组真核表达质粒p VAX1-VP2-228。Western blot结果显示VP2-228能够在COS-7细胞中正确表达。将该重组质粒免疫小鼠,利用血凝抑制试验检测不同时期的抗体水平,以MTT法检测免疫35 d时淋巴细胞的增殖活性。结果表明p VAX1-VP2-228能够诱导小鼠产生较高的抗体水平;淋巴细胞增殖试验表明免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数显著高于对照组(p0.05)。本研究为开展CPV DNA疫苗的研究提供了实验依据。     

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4增强传染性法氏囊病病毒VP2质粒DNA的免疫效应分析

为评价分子佐剂细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)对IBDV VP2质粒DNA的免疫增强作用,试验采用重组质粒载体表达重组蛋白mLTA-VP2-CTLA-4和mLTA-CTLA-4,家兔毒性试验确定其安全性,后选择10日龄非免疫健康鸡进行随机分组试验,设不同剂量mLTA-CTLA-4加IBD活疫苗免疫组、不同剂量mLTAVP2-CTLA-4免疫组、IBD活疫苗免疫组及空白对照组,免疫后用ELISA法定期检测鸡血清抗体IgG及小肠黏膜抗体IgA效价;鸡在加强免疫后用IBDV野生毒株攻击,连续观察2周并计算保护率。结果显示,mLTA-VP2-CTLA-4免疫组、mLTA-CTLA-4加活疫苗共同免疫组产生的IgG和IgA抗体水平与活疫苗免疫组无明显差别,mLTA-CTLA-4加活疫苗共同免疫组产生的IgG和IgA抗体水平略高于mLTA-VP2-CTLA-4免疫组,疫苗对鸡的保护率为100%。结果表明,构建的IBDV分子佐剂DNA疫苗载体能表达无毒性的重组蛋白质,并能产生很好的免疫保护率,为进一步研究IBD亚单位疫苗奠定基础。     

乳酸菌融合表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白与大肠杆菌LTB及其诱导免疫应答的研究

为研究传染性法氏囊病毒(IBDV)保护性抗原VP2与E.coli不耐热肠毒素B亚单位(LTB)在戊糖乳杆菌(L.pentosus)中的共表达及其免疫原性,本研究以乳酸杆菌表面表达型和分泌表达型质粒pPG-1和pPG-2为载体,以VP2为目的基因,构建VP2基因单独表达及与LTB基因融合表达的4种重组L.pentosus,分别命名为pPG-1-VP2/L.pentosus、pPG-1-VP2-LTB/L.pentosus、pPG-2-VP2/L.pentosus及pPG-2-VP2-LTB/L.pentosus。表达的重组蛋白分子量大小分别约为47 ku、55 ku、45 ku及53ku。将构建的重组L.pentosus分别口服免疫SPF雏鸡,以IDEXX试剂盒测定体液免疫应答水平,结果显示,不同表达方式的重组L.pentosus均可以刺激机体产生特异性循环抗体和分泌抗体(sIgA),其中pPG-2-VP2-LTB/L.pentosus诱导产生的抗体滴度高于其它组。MTT法检测不同表达方式的重组乳酸菌免疫雏鸡外周血淋巴细胞增殖反应,结果显示特异性抗原对免疫雏鸡淋巴细胞的增殖指数显著高于未免疫组,表明重组菌能够刺激机体产生特异性细胞免疫应答。这些结果表明4种重组菌均能够刺激机体产生局部黏膜免疫和全身系统免疫应答;并且带有黏膜免疫佐剂LTB融合表达试验组高于VP2蛋白单独表达组。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2与白喉毒素截短体DT390融合蛋白的真核表达及免疫原性检测

为探究白喉毒素截短体DT390是否对鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2蛋白具有免疫增强作用,本研究利用有白喉毒素抗性的毕赤酵母表达系统对DT390和VP2进行融合表达,用SDS-PAGE和Western blotting方法对表达的融合蛋白DT390-VP2进行了鉴定。将24只21日龄SPF雏鸡随机均分为4组:VP2组、DT390-VP2组、PBS(对照组)和B87组(阳性对照组),在第0和14天,分别对各组雏鸡进行免疫,在首免后第28天,每只雏鸡接种100 BID₅₀的IBDV BC6/85毒株,采用ELISA法检测免疫前后不同时间各组雏鸡血清的VP2特异性抗体水平,采用法氏囊组织切片HE染色及病理损伤评分来评价法氏囊的损伤程度,评价融合蛋白DT390-VP2在雏鸡体内的免疫原性和保护功能。SDS-PAGE和Western blotting分析结果显示,表达和提纯后的目的蛋白确为糖基化的融合蛋白DT390-VP2(91.26 ku)。体内试验结果显示,首次免疫21 d后,DT390-VP2组的VP2特异性抗体滴度分别显著和极显著高于B87组(P<0.05)和VP2组(P<0.01);首次免疫28 d后,DT390-VP2组的VP2特异性抗体滴度极显著高于VP2组(P<0.01);与VP2蛋白相比,融合蛋白DT390-VP2减轻了雏鸡法氏囊淋巴滤泡的萎缩程度。综上所述,白喉毒素截短体DT390以融合表达的方式增强了VP2的体液免疫原性,融合蛋白DT390-VP2在一定程度上减轻了IBDV BC6/85毒株造成的组织损伤。     

兔瘟病毒VP60基因重组真核表达质粒的构建及其免疫原性

采用RT-PCR方法扩增兔病毒性出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60基因,PCR产物纯化后克隆到pMD19-T载体,获得重组质粒pMD19-T-VP60,并进行序列测定。测序正确的pMD19-T-VP60经EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切后,将目的片段VP60插入真核表达载体pVAX-1,构建真核表达质粒pVAX1-VP60。将构建好的重组质粒pVAX1-VP60按500μg/只腿部肌肉注射25日龄家兔,同时设pVAX-1组、兔瘟组织灭活苗组和PBS组。分别于免疫后7,14,21,28,35,42 d对各组兔静脉采血,间接ELISA法检测血清中特异性抗体水平,结果显示PBS组和pVAX-1组未检测到特异性抗体,pVAX1-VP60组和兔瘟组织灭活苗组家兔都能产生高水平的特异性抗体,在特异性抗体水平高峰期,2组数据差异不显著(P0.05)。于免疫后3,7,14,21,28,35,42 d随机剖杀pVAX1-VP60组试验兔3只,取心、肝、脾、肺、肾、腿部肌肉,提取组织DNA,进行PCR检测,结果均检测到目的基因VP60的存在。免疫后28 d以滴度10~8的RHDV 0.5 m L/只腿部肌肉注射攻毒,pVAX-1组、PBS组、兔瘟组织灭活苗组、pVAX1-VP60组的相对保护率分别为0%,0%,90%,85%,表明pVAX1-VP60具有良好的免疫效果。     

鸡β-防御素-1对鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因DNA疫苗的免疫佐剂作用

本文旨在研究鸡β-防御素-1(AvBD1)对鸡IBDVVP2基因DNA疫苗的免疫佐剂作用。通过基因工程技术,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-AvBD1与pcDNA3.1(+)-VP2。14日龄岭南黄肉鸡随机分成5组,分别免疫PBS、空质粒载体pcDNA3.1(+)、重组质粒pcDNA3.1(+)-VP2、重组质粒pcDNA3.1(+)-AvBD1与pcD-NA3.1(+)-VP2联合免疫、IBD弱毒苗。收集免疫后不同时期的外周血血清样本,用ELISA方法检测血清中IB-DV VP2特异性抗体水平,通过流式细胞仪检测CD3+、CD4+与CD8+T淋巴细胞的含量。结果表明,联合免疫组(即pcDNA3.1(+)-AvBD1与pcDNA3.1(+)-VP2共同免疫)VP2特异性抗体水平显著高于其他组;单独免疫质粒pcDNA3.1(+)-VP2组VP2特异性抗体水平与免疫IBD弱毒苗组相当,显著高于PBS组与空质粒载体pcD-NA3.1(+)组。在二免后第7天,联合免疫组外周血中CD3+、CD4+与CD8+T淋巴细胞的含量也显著高于单独免疫质粒pcDNA3.1(+)-VP2组,其它时间无显著性差异。IBDV攻毒...     

犬GM-CSF基因对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白.利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应.为进一步提高VP2 DNA疫苗的免疫活性,本实验利用犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因作为生物佐剂研究其对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用.首先通过RT-PCR方法从犬淋巴细胞中扩增GM-CSF基因,并将其插入到pcDNA3.1栽体上,分别构建该基因的两个分泌型真核表达载体,即非融合表达载体pcDNA-cGMCSF和与Myc His融合的表达栽体pcDNA-cGMCSF/MH.用pcDNA-cGMCSF/MH载体转染HEK293T细胞以确定GM-CSF基因能否在真核细胞中进行分泌表达.然后用本室构建的VP2基因表达栽体单免疫小鼠,用VP2表达载体与pcDNA-cGMCSF共免疫小鼠(pcDNA3.1空载体作为阴性对照).免疫后用ELISA方法检测不同时间小鼠血清的抗体水平.用MTT法检测小鼠免疫后35 d时淋巴细胞的增殖活性,同时用ELISA试剂盒检测小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平.结果表明,本试验构建的表达载体能够介导重组GM-CSF在真核细胞中进行分泌表达.免疫实验表明,利用GM-CSF基因与VP2基因共免疫小鼠,抗体的水平明显高于VP2基因单免疫组(P＜0.01).共免疫组小鼠淋巴细胞的刺激指数和γ干扰素的表达水平均明显高于单免疫组(P＜0.05).由此可见,GM-CSF表达载体可明显提高CPV VP2 DNA疫苗的免疫应答水平.     

表达猪附红细胞体ENO基因的质粒DNA的构建及免疫效果研究

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的质粒DNA,并测定其免疫效果。将猪附红细胞体ENO基因克隆到PVAX1真核表达载体上,然后转染到Vero细胞中进行表达并测定其免疫效果。将18只BALB/c小鼠（雌雄各半）随机分为3组（PVAX1-ENO质粒DNA免疫组、PVAX1空载体对照组及PBS对照组）,每组6只,每组小鼠对应免疫接种PVAX1-ENO质粒DNA、PVAX1空质粒和PBS。分离血清并通过ELISA方法测定血清中ENO蛋白抗体效价、IgG₁和IgG_2a抗体水平及IFN-γ和IL-4细胞因子水平。三免2周后每组选取3只小鼠检测CD4⁺和CD8⁺含量。结果显示,本试验成功构建了PVAX1-ENO质粒DNA,经PCR和酶切鉴定正确,并能在Vero细胞中成功表达。PVAX1-ENO质粒DNA免疫组ENO蛋白抗体水平、IgG₁和IgG_2a抗体水平、IFN-γ和IL-4细胞因子水平及CD4⁺和CD8⁺含量均显著高于PVAX1空载体对照组及PBS对照组（P<0.05）。结果表明,PVAX1-ENO质粒DNA可显著提高BALB/c小鼠的体液免疫水平,并在一定程度上刺激BALB/c小鼠细胞免疫。     

Construction of Specifically Targeted Chimeric Canine Parvovirus DNA Vaccine and Its Efficacy Assessment

To design chimeric DNA vaccine targeted to antigen-presenting cells with enhanced efficacy to induce immunization.The plasmid containing the gene encoding the extracelluar domain of canine cytotoxic T-lymphocyte antigen 4(CTLA-4₁₂₅),was directly fused to the gene fragment for major antigenic epitopes of VP2(VP2₂₂₈) by molecular engineering technology.The plasmid containing VP2₂₂₈ alone was also constructed to serve as control and transfection of COS-7 cells with the two resultant plasimds was performed respectively,followed by assay of Western blotting.The mice were immunized with the constructed two plasimds,respectively.After immunization,the antibodies anginst CPV in the immunized mice at different times were measured by HI.The spleen lymphocyte proliferation response was determined by lymphocyte proliferation assay,and the interferon-γ (IFN-γ) expression level of the mouse lymphocytes were measured by ELISA.The eukaryotic expression plasimds of CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈ fusion protein or VP2₂₂₈ alone were cloned.Western blotting showed that the two recombinant proteins could be expressed.Immunization results showed that the antibody levels in serum of CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈-immunized mice were significantly higher than that of VP2₂₂₈-immunized mice (P<0.05).The lymphocyte stimulation indexes and secreted IFN-γ levels of the CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈-immunized mice were significantly higher than that of VP2₂₂₈-immunized mice (P<0.05 and P<0.01),respectively.CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈ chimeric DNA vaccine stimulates strong immune response in mice,making it possible for further exploration into chimeric DNA that target the antigen to APCs.     

表达猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒并分析评价其免疫效果。将重组克隆质粒pMD-19T-ENO与腺病毒穿梭载体AdV4-GFP分别进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO;将经PacⅠ酶线性化后的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO转染293细胞,获得重组腺病毒Ad4-M/ENO,采用PCR和间接免疫荧光试验（IFTA）鉴定猪附红细胞体ENO基因在293细胞中的表达,再对293细胞进行培养,测定重组腺病毒的滴度;将30只BALB/c小鼠分为3组：重组腺病毒Ad4-M/ENO组、AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组,分别进行免疫接种,采用ELISA方法检测血清中猪附红细胞体IgG、IgG₁、IgG_2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平,在三免2周后检测小鼠脾脏中CD4⁺和CD8⁺含量。结果显示,构建的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO目的基因片段大小为1 182 bp;重组腺病毒Ad4-M/ENO包装成功,能在293细胞中表达,滴度为1×10⁹ PFU/mL。经重组腺病毒Ad4-M/ENO免疫后的BALB/c小鼠血清中IgG、IgG₁、IgG_2a抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平及淋巴细胞亚群CD4⁺、CD8⁺含量均显著或极显著高于AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组（P<0.05;P<0.01）。结果表明,本试验成功构建了表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒,且该重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答反应。     

白细胞介素-12对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为进一步提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平,本研究在小鼠体内尝试了利用白细胞介素12（IL-12）基因表达载体提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平。首先采用RT-PCR方法从小鼠脾淋巴细胞中分别扩增IL-12大亚基（P40）和小亚基（P35）cDNA基因;然后在真核表达载体pcDNA3.1A上通过引入内部核糖体进入位点（IRES）序列,分别将P40基因和P35基因插入到IRES序列的上下游,构建成IL-12（P40和P35双亚基）基因表达载体,pcDNA-P40-IRES-P35。将上述表达载体与本室构建的VP2表达载体通过磷酸钙方法转染HEK 293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达载体能否介导相应基因在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2载体单免疫和VP2载体和IL-12载体共免疫方法对小鼠进行免疫（用pcDNA3.1A作为对照）。免疫后在特定时间通过ELISA方法检测小鼠血清抗VP2蛋白的抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验检测免疫后35d小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果表明,扩增的小鼠IL-12P40和P35亚基基因与GenBank的参考序列基本一致。Western-blot检测结果表明,重组IL-12和VP2均能够在HEK293T细胞中进行分泌性表达。ELISA检测结果表明利用IL-2载体与VP2载体共免疫小鼠,其血清中抗VP2的抗体水平明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.01）,抗体水平在第35天高达1：5120。淋巴细胞增殖试验结果表明,免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组（P〈0.01）,VP2载体与IL2载体共免疫组的刺激指数明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.05）。由此可见,在小鼠体内,IL-12基因表达载体可明显提高CPV VP2基因疫苗的免疫应答水平。     

白细胞介素-2基因表达质粒对犬细小病毒VP2DNA疫苗在小鼠的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒主要抗原蛋白。研究证实由VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为提高VP2DNA疫苗的免疫原性,本研究在小鼠体内尝试了利用犬白细胞介素2（cIL-2）基因增强VP2DNA疫苗免疫应答的研究。通过RT-PCR方法从犬脾淋巴细胞中分别扩增含终止密码子和不合终止密码子的cIL-2cDNA基因,然后将基因插入到真核表达载体pcDNA3．1中,分别构建成非融合的和与Myc／His融合的clL-2基因真核分泌型表达载体,pcDNA-cIL-2和pcDNA-cIL-2／MH。将pcDNA-oIL-2／MH表达栽体通过磷酸钙方法转染HEK293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达栽体能否介导cIL-2在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2表达载体（pcDNA-CD5sp-VP2,本室构建）单注射和VP2／IL-2表达载体共注射对小鼠进行免疫（用pcD-NA3．1栽体作为阴性对照）。免疫后通过ELISA方法检测免疫后不同时期小鼠血清VP2的抗体水平,并通过细胞增殖试验检测免疫后小鼠脾脏淋巴细胞的增殖反应,用ELISA方法测定小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平。试验结果表明,扩增的小鼠cIL-2基因与GenBank的参考序列一致,构建的cIL-2表达载体能够介导重组cIL-2在HEK293T细胞中进行分泌表达。免疫结果显示,利用cIL-2／VP2表达载体共免疫小鼠,免疫后35d血清中VP2的抗体水平达到1：5120,明显高于VP2表达载体单免疫组（P〈0．01）。淋巴细胞增殖试验表明,2组免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于阴性对照组（P〈0．01）,共免疫组的刺激指数又明显高于单免疫组（P〈0．05）。共免疫小鼠淋巴细胞7干扰素的表达水平明显高于单免疫组和阴性对照组（P〈0．01）。由此可见,cIL-2表达载体可明显提高CPVVP2基因疫苗的免疫应答水平。     

DNA Immunization Against Very Virulent Infectious Bursal Disease Virus with VP2‐4‐3 Gene and Chicken IL‐6 Gene

The present study was to investigate the feasibility and efficiency of the DNA vaccine to protect chickens against very virulent infectious bursal disease virus (vvIBDV) infection. A plasmid DNA carrying VP2‐4‐3 genes of vvIBDV SH95 and a plasmid DNA carrying chicken interleukin‐6 (ChIL‐6) genes were constructed and designated as pALTER‐MAX‐VP2‐4‐3 and pALTER‐MAX‐ChIL‐6 respectively. Several DNA vaccination experiments were performed: 1‐week‐old chickens were intramuscularly injected with only plasmid pcDNA3‐VP2, pALTER‐MAX‐VP2‐4‐3 or mixture with pALTER‐MAX‐ChIL‐6. The chickens at 4 weeks old were orally inoculated with vvIBDV SH95. The results showed that immunization with the mixture of pALTER‐MAX‐VP2‐4‐3 and pALTER‐MAX‐ChIL‐6 three times conferred protection for 90% of chickens. Enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA) antibody titres in chickens immunized together with pALTER‐MAX‐ChIL‐6 were higher than those immunized simply with plasmid pcDNA3‐VP2 or pALTER‐MAX‐VP2‐4‐3. IBDV was not detected in the bursa of the protected chickens at 8 days after challenge by RT‐PCR. The results indicate that protection against vvIBDV can be achieved by using the VP2‐4‐3 gene of vvIBDV as a DNA vaccine. Furthermore, the simultaneous injection of ChIL‐6 plasmid significantly increased the protection after challenge with the very virulent strain.     

猪β2肾上腺素能受体基因真核表达载体及突变体的构建及表达

试验旨在构建猪β₂肾上腺素能受体（β₂ adrenergic receptor,β₂AR）基因及其突变体真核表达载体,并鉴定其在HEK293T细胞中的表达。通过猪基因组DNA克隆猪β₂AR基因,利用同源重组技术将其连接至真核表达载体pcDNA3.1（+）,构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-β₂AR,加入c-myc标签后命名为myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR。以真核表达载体为模板构建突变体myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR-D130N、myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR-C285S和myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR-D130N/C285S,并将构建的真核表达载体和突变体转染HEK293T细胞,利用Western blotting技术验证其表达。结果显示,猪β₂AR基因已正确重组入pcDNA3.1（+）载体中;经测序鉴定,猪β₂AR的第130位天冬氨酸成功突变为天冬酰胺,第285位半胱氨酸成功突变为丝氨酸。Western blotting检测结果证明所构建的表达载体均可在HEK293T细胞中表达。本研究成功构建了猪β₂AR野生型的真核表达载体及2个单点突变和1个双点突变的突变体,并验证其在HEK293T细胞中正常表达,为进一步研究猪β₂AR蛋白表达及其药理学活性奠定基础。     

Fusion of C3d molecule with bovine rotavirus VP7 or bovine herpesvirus type 1 glycoprotein D inhibits immune responses following DNA immunization

The binding of the complement C3d molecule with receptors on B cells and/or follicular dendritic cells (FDCs) influences the induction of humoral immune responses. For example, C3d fused to an antigen has been shown to have a strong adjuvant effect on antibody production. We investigated the possibility that co-expression of antigen and C3d as a fusion protein could enhance antigen-specific immune responses, following plasmid immunization. One or two copies of murine C3d-cDNA, C3d or (C3d)(2), respectively, were cloned together with bovine rotavirus (BRV) VP7 or bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) glycoprotein D (gD) genes. All constructs contained a signal peptide that resulted in the secretion of the expressed proteins. In vitro, the characterization of the chimeric proteins indicated that both VP7 and gD retained their antigenicity and the C3d remained biologically active. However, immunization with plasmids encoding VP7-C3d chimeras did not enhance rotavirus-specific antibody responses and the frequency of BRV-specific IFN-gamma secreting cells in the spleens were significantly lower in mice immunized with pVP7-(C3d)(2) when compared with mice immunized with plasmid encoding VP7. The same pattern of immune responses was observed for plasmids encoding gD-C3d. Both gD-specific antibody responses and the frequency of gD-specific IFN-gamma secreting cells were significantly lower in mice immunized with plasmid expressing gD-C3d chimeras when compared with mice immunized with plasmid encoding gD alone. These results indicate that co-expression of C3d with an antigen actually inhibit both humoral and cell-mediated antigen-specific immune responses.     

热带无爪螨主要变应原Blo t 5和Blo t 21融合表达质粒诱导小鼠产生IgG和调节性T细胞

旨在开发防治热带螨过敏症的兽用核酸疫苗,本试验通过对热带无爪螨主要变应原Blo t 5和Blo t 21的基因序列进行密码子优化,构建了热带螨主要变应原融合基因的真核表达载体pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG。为验证该真核表达载体的免疫效果,采用皮下注射,以100 μg/100 μL量的pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG核酸免疫BALB/c小鼠(n=6),通过ELISA检测小鼠血清中特异性IgG、IgG1和IgG2a的水平变化;流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞中调节性T细胞的变化。结果显示,真核表达质粒pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG免疫小鼠后可诱导特异性IgG和IgG2a水平升高,且IgG2a/IgG1的比值升高,这暗示免疫后小鼠机体发生偏向Th1型的免疫反应。此外,该核酸疫苗可诱导小鼠产生较高水平的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ T细胞,这表明该真核表达质粒免疫小鼠后可能会诱发免疫抑制。