国产犬细小病毒弱毒疫苗免疫试验及田间应用效果观察

1986年,解放军兽医大学研究所等单位选用犬科动物细小病毒自然弱毒CR86/06株)为种毒,初步研制出一种细小病毒弱毒疫苗。经实验研究及田间临床初步应用试验,证明本疫苗安全性好,免疫效果确实。1987年7月至1989年11月,我们应用该疫苗在本基地进行了安全性试验,免疫后CPV HI抗体滴度消长规律观察,免疫效果试验,     

犬细小病毒核酸疫苗制备及免疫试验

以犬细小病毒基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增了全长VP1基因,PCR产物经纯化和NotⅠ/BamHⅠ双酶切后与同样处理的真核表达载体pIRES进行连接,转化到感受态细胞JM109中,筛选了真核重组表达质粒pIRESVP1,并进行了序列测定。对6只9月龄犬分别接种不同剂量的pIRESVP1或空载体质粒及生理盐水,8周接种1次,每次接种前采血,测定血清的血凝抑制抗体效价,第2次免疫后即可检测到较高的血清效价。在第3次接种4周后,对全部实验犬进行攻毒,攻毒后第7天及第14天时采血,测定血清的血凝抑制抗体效价。所有接种pIRESVP1疫苗的犬均能抵抗CPV强毒的攻击,而接种空载体质粒和生理盐水的对照犬则全部发病。证明所构建的核酸疫苗(pIRESVP1)能使犬免受犬细小病毒强毒的感染。     

不同种类犬细小病毒疫苗临床应用效果的检测

应用ＥＬＩＳＡ和套式ＰＣＲ技术以及常规的寄生虫检测和体温检查，筛选出６２０头无病状、无内寄生虫、适宜作不同种类细小病毒疫苗试验的健康幼犬。对５种犬细小病毒的疫苗进行试验。证明犬细小病毒抗原抗体复合物疫苗的效果最佳。     

犬细小病毒核酸疫苗、重组活载体疫苗与弱毒疫苗免疫犬实验研究

分别用犬细小病毒（CPV）核酸疫苗（pVCPV-VP2）、CPV重组活载体疫苗（CAV2／CPV）与CPV弱毒疫苗对犬进行了免疫试验,以检测不同CPV疫苗的免疫原性。采用CPVELISA、CPVHI与CPV微量中和试验检测免疫犬的体液免疫水平,采用淋巴细胞转化试验检测犬的细胞免疫水平。结果,pVCPV—VP2和CAV2／CPV均能诱导机体产生抗CPVELISA抗体与抗CPV中和抗体,但是pVCPV-VP2不能诱导机体产生可检测的抗CPVHI抗体,而CAV2／CPV能够诱导机体产生抗CPVHI抗体。淋巴细胞转化试验结果,pVCPV-VP2和CAV2／CPV免疫犬的外周血淋巴细胞对ConA与CPV的刺激均出现明显的增殖反应。结果表明,pVCPV—VP2和CAV2／CPV免疫犬均能诱导机体产生抗CPV的特异性体液免疫反应和细胞免疫反应,两者所表达的VP2蛋白均具有较好的免疫原性。CAV2／CPV以及pVCPV—VP2和CAV2／CPV联合免疫犬的抗CPV体液免疫水平和细胞免疫水平均比用pVCPV—VP2单独免疫犬的体液免疫水平和细胞免疫水平高。但CAV2／CPV诱导机体产生的抗CPV特异性免疫反应仍然比CPV弱毒疫苗诱导机体产生的抗CPV特异性免疫反应弱。另外,CAV2／CPV还能诱导机体产生抗CAV-2的特异性免疫反应。     

Construction of Specifically Targeted Chimeric Canine Parvovirus DNA Vaccine and Its Efficacy Assessment

To design chimeric DNA vaccine targeted to antigen-presenting cells with enhanced efficacy to induce immunization.The plasmid containing the gene encoding the extracelluar domain of canine cytotoxic T-lymphocyte antigen 4(CTLA-4₁₂₅),was directly fused to the gene fragment for major antigenic epitopes of VP2(VP2₂₂₈) by molecular engineering technology.The plasmid containing VP2₂₂₈ alone was also constructed to serve as control and transfection of COS-7 cells with the two resultant plasimds was performed respectively,followed by assay of Western blotting.The mice were immunized with the constructed two plasimds,respectively.After immunization,the antibodies anginst CPV in the immunized mice at different times were measured by HI.The spleen lymphocyte proliferation response was determined by lymphocyte proliferation assay,and the interferon-γ (IFN-γ) expression level of the mouse lymphocytes were measured by ELISA.The eukaryotic expression plasimds of CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈ fusion protein or VP2₂₂₈ alone were cloned.Western blotting showed that the two recombinant proteins could be expressed.Immunization results showed that the antibody levels in serum of CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈-immunized mice were significantly higher than that of VP2₂₂₈-immunized mice (P<0.05).The lymphocyte stimulation indexes and secreted IFN-γ levels of the CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈-immunized mice were significantly higher than that of VP2₂₂₈-immunized mice (P<0.05 and P<0.01),respectively.CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈ chimeric DNA vaccine stimulates strong immune response in mice,making it possible for further exploration into chimeric DNA that target the antigen to APCs.     

用无针注射器接种犬细小病毒疫苗免疫效果研究

为了研究无针注射器接种犬细小病毒疫苗的免疫效果,试验将15只42～45日龄健康拉布拉多寻回犬和15只金毛寻回猎犬随机分成3组,每组10只(每个品种5只),分别为有针注射1头份组(含犬细小病毒抗原NL-35-D株)、无针注射1头份组和无针注射1/2头份组。有针注射1头份组采用有针注射器接种1头份卫佳伍疫苗,无针注射1头份组和无针注射1/2头份组采用无针注射器分别接种1头份、1/2头份。首免后第14,28天采用同样的方法进行二免和三免。免疫后观察犬的临床反应;分别于首免、二免和三免后第14天采血、分离血清,用犬细小病毒(CPV Ab)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒检测抗体浓度,根据产生的抗体浓度判断免疫效果。结果表明：无针注射1头份和1/2头份组犬没有出现炎症反应和其他不良反应,疼痛明显降低;各组试验犬二免后第14天抗体水平均能达到保护作用;首免、二免和三免后第14天三组比较,无针注射1头份组和无针注射1/2头份组抗体水平均略高于有针注射1头份组,但差异不显著(P>0.05)。说明采用无针注射器接种犬细小病毒疫苗免疫效果确实、安全。     

紫锥菊增强犬瘟热疫苗和犬细小病毒疫苗免疫效果的研究进展

详细阐述了紫锥菊的药理活性、安全药理学、临床应用以及毒理学研究等内容。紫锥菊可作为免疫增强剂,提高犬瘟热疫苗和犬细小病毒疫苗的免疫效果,本文为其研究与开发提供一定的参考。     

一株新分离犬细小病毒灭活疫苗的制备及免疫效果研究

JL0911株犬细小病毒是由军事兽医研究所流行病与病毒病防控技术实验室分离得到的一株新型犬细小病毒,其主要抗原位点上的氨基酸序列较国内先前分离到的其他株有较大差异,不能被归入目前已有的CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c三个类型。本研究旨在利用JL0911株犬细小病毒研制灭活疫苗,并评价其免疫原性。试验采用10^5.5 TCID₅₀/mL的犬细小病毒JL0911,以甲醛灭活后,加入1/4体积的纳米佐剂,制备了犬细小病毒灭活疫苗。取1.5 mL上述疫苗,通过肌肉注射免疫普通家犬,免疫前后不同时间均采集血清,在F81细胞系上测定犬细小病毒的中和抗体。结果显示,免疫后14 d,试验犬血中细小病毒中和抗体效价较免疫前有显著提高,最高可由0提高至2⁹,表明本试验分离的JL0911株犬细小病毒具有生产犬细小病毒灭活疫苗的潜在价值。     

犬细小病毒性肠炎弱毒疫苗的研究

选用从犬科动物貉中分得的貉细小病毒CR86106株为种毒,用猫肾传代细胞F81系培养增殖,制成犬细小病毒性肠炎弱毒疫苗(M-CPV)。该苗对猪红细胞的HA效价平均156,对F81细胞系的TCID_(50)平均为4.02。对离乳幼犬的最低免疫剂量为5×10~(3·8)TCID_(50)。苗注后2周即可获得免疫,血清HI抗体达32即可抵抗CPV强毒感染。疫苗的免疫期为1年。于-15℃以下冰盒保存,疫苗的有效期为9个月。CR80106株遗传性稳定,经CPV易感幼犬和F81细胞系连续传5代和22代,对犬的安全性和免疫原性不变。病毒蛋白经SDS—PAGE和HPLC分析,均未发现与原始毒株有不同。M-CPV对母源抗体干扰有较强的抵抗力,母源抗体达32的幼犬,100％可对该亩产生免疫应答。HI抗体<2的CPV易感幼犬接种该苗后除粪便轻度阳转外,无其他异常,同居CPV易感幼犬也不会感染发病。两次免疫后作同居感染攻毒,可获得完全保护,不会由粪便排出强毒。于产前20d给怀孕母犬接种,也未见有流产、早产、死胎和弱胎现象发生,所产仔犬全部生长发育正常。全国16个军、警犬场队用本疫苗累计免疫各类犬3320只,全部安全,没有一只因注苗而发病,经1～2年临床观察,3296头获得保护,保护率为99.28％。     

白细胞介素-2对犬细小病毒疫苗免疫效果的影响

为研究白细胞介素-2(IL-2)对犬细小病毒疫苗免疫效果的影响,选择40只幼犬,随机分成试验组和对照组,试验组按0.5 ml/头份加入犬用IL-2与犬细小病毒疫苗一起皮下注射,对照组单独使用犬细小病毒疫苗,注射后分别在接种前、接种后7 d和14 d使用金标试纸条检测其抗体效价,并进行组间抗体效价差异的t检验。试验结果表明,接种疫苗前试验组与对照组犬细小病毒平均抗体效价之间差异不显著;接种疫苗后7 d,试验组与对照组犬细小病毒平均抗体效价差异极显著(P<0.01);接种疫苗后14 d,试验组与对照组犬细小病毒平均抗体效价差异极显著(P<0.01)。试验表明:IL-2可明显提高幼犬对犬细小病毒疫苗的抗体应答能力,是一种良好的犬细小病毒疫苗候选佐剂。     

细菌DNA对小鼠接种犬细小病毒灭活苗的免疫增强效果

用大肠杆菌 DNA、弗氏佐剂、铝胶、蜂胶等不同佐剂 ,与犬细小病毒灭活疫苗配合免疫小鼠 ,以血凝抑制试验检测病毒特异性血凝抑制抗体。结果表明 ,各佐剂均能增强特异性抗体的产生 ,经组间单因素相关性分析 ,细菌 DNA与弗氏佐剂的免疫增强效果明显高于铝胶与蜂胶 (P <0 .0 5或 P <0 .0 1)。细菌 DNA具有强烈免疫刺激作用、无不良反应等特性 ,可望作为疫苗佐剂应用     

复方泛菌克对犬细小病毒病的疗效试验

复方泛菌克是一种新型高效复方抗菌、抗病毒药物,能迅速消除动物的肠毒素和内毒素,增强胃肠吸收能力,提高机体免疫力。犬细小病毒病是犬常见的一种病毒性疾病,易引起溃疡性肠炎和腹泻。现用复方泛菌克对30只患犬细小病毒病的病犬进行治疗,治愈28只,死亡2只,治愈率为93.3%,治疗效果好。     

犬细小病毒病的流行现状调查

对犬细小病毒病流行现状进行调查,为本病的预防、诊断和治疗提供依据。 用犬细小病毒抗原检测试剂盒对2008年门诊的具有腹泻、呕吐、粪便带血等体征的189只患犬作病原检测,对犬细小病毒阳性病例兼有发热、咳嗽体征的16例病犬同时作犬瘟热病毒抗原检测。结果犬细小病毒阳性病例共137只,发病年龄从1个月～15岁各年龄段均有分布,以6月龄以下幼龄动物发病较多,占65.7%。流行季节差异不大,以春季病例略多,占27.0%。犬细小病毒与犬瘟热病毒混合感染的有12例,占8.8%。对在疫苗接种免疫保护期内的4只患犬进行检测,3只犬细小病毒阳性。结论：①免疫力尚未建立是幼犬发病的主要原因;②不按规定的免疫程序对动物进行加强免疫是成年犬发病的主要原因;③在部分发病幼犬中存在犬细小病毒与犬瘟热病毒的混合感染;④老龄动物对免疫的应答能力下降可导致免疫失败。     

犬细小病毒特异性免疫球蛋白的临床应用效果观察

旨在观察犬细小病毒特异性免疫球蛋白治疗犬细小病毒病的临床应用效果,本文收集了中国农业大学动物医院自2016年1月—2019年11月接治的犬细小病毒病患犬的病历资料,筛选出病历资料完整的并使用了犬细小病毒单抗或犬细小病毒特异性免疫球蛋白治疗的患犬病例进行跟踪以及回访。对收集的病例数据进行了总治愈率、各初始抗体水平的治愈率、各月龄段的治愈率和治愈病例的病程分析。结果显示,犬细小病毒特异性免疫球蛋白和犬细小病毒单克隆抗体在总治愈率、相同初始抗体水平治愈率、相同月龄段治愈率均无显著差异（P>0.05）。但使用特异性免疫球蛋白的病例痊愈时间显著低于使用单克隆抗体的病例（P=0.02<0.05）。综上表明,犬细小病毒特异性免疫球蛋白的临床应用效果良好,可为犬细小病毒病的治疗提供新的药物选择。     

基于甲病毒复制子的犬瘟热核酸疫苗的构建及表达性研究

本试验利用T-A克隆技术,构建克隆载体pEASY-Blunt-F,BamHⅠ酶切pEASY-Blunt-F,回收F基因,将其克隆至pSCA1真核表达载体中,获得重组质粒pSCA1-F。经DNA测序、限制性内切酶分析和PCR鉴定,结果表明重组质粒pSCA1-F成功构建。通过间接免疫荧光试验和Western blotting证实F基因在转染细胞中表达。此外,细胞凋亡的检测结果表明,pSCA1-F能引起转染的细胞发生凋亡。