Screening of Probiotics Inhibiting E. coli K88 in vitro

The probiotics tested in the experiment were isolated from the intestinal of weaning piglets.The isolated probiotics and E.coli K88 were inoculated into the culture of intestinal porcine epithelial cell-1 (IPEC-1).The activity of lactate dehydrogenase (LDH) in the supernatant was measured after incubating for 2.5 h.At the same time, the probiotics and E.coli K88 were co-cultured in vitro, the number of E.coli K88 was counted and the probiotics which could be resistant to the E.coli K88 were selected 2.5 h later.The results showed that the Lactobacillus casei and Bacillus coagulans could significantly reduce LDH activity (P<0.05), decrease the damage of E.coli K88; Bacillus coagulans could inhibit the growth of E.coli K88.At the same time, Bacillus coagulans could resist high temperature, acid and bile salt.The results showed that Bacillus coagulans strains had great potential as the application of probiotics strains.The methods could be used as a model of screen probiotics which could inhibit the growth of E.coli K88 in vitro.     

酸与胆汁耐性芽孢益生菌的筛选

试验选用允许直接饲喂的安全微生物中的芽孢杆菌,按照益生菌的特定要求,考察各菌株对低pH和高胆盐的耐受性及产酶特性。筛选获得的凝结芽孢杆菌AHU1366,耐受性优良,并能产生淀粉酶和蛋白酶,是一株比较理想的饲用益生菌。     

一株凝结芽孢杆菌的分离筛选及生物学特性研究

研究采用改良MRS培养基,从土壤中分离一株能抑制常见病原菌的产酸芽孢杆菌。该菌株对大肠杆菌(EscherichiacoliO139、E.coliK88、E.coliK99)、伤寒沙门氏菌[Salmonella typhimurium O4H(iSTO4Hi)]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等均有较强的抑制作用,经生理生化试验和16SrDNA序列分析鉴定为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。该菌株模拟胃液处理30min后存活率为91%,耐胆盐浓度达3.0%,小鼠急性毒性试验结论为无毒无害物质。研究结果表明,该菌株可以顺利通过胃酸进入小肠后开始作用,改善肠道微生态环境,具有作为微生态制剂菌株的应用潜力。     

益生菌与功能发酵乳开发研究进展

近10 年来,随着先进研究方法的使用和研究内容的不断深入,对益生菌的认识取得重大进展,尤其是对益生菌促进健康作用的机理逐渐清晰,益生菌制备技术和产业化技术更加成熟,为新型发酵乳的开发提供了坚实的发展基础。本文对益生菌功能机理、遗传转化及代谢调控的研究现状和发展进行阐述,介绍分离自内蒙古马乳酒中的干酪乳杆菌LC2W和分离自发酵蔬菜中的植物乳杆菌ST-Ⅲ的益生特性、基因组及产胞外多糖特性,并进一步探讨基于植物乳杆菌增殖技术开发含高活菌数的纯植物乳杆菌发酵乳品,以期为益生菌和功能发酵乳的应用开发提供理论依据。发酵乳品是益生菌的良好载体,吸收现代益生菌科技成果,加强循证医学方法论证,基于生物活性效应分子及生物活性评价,增加临床研究数据,新型发酵乳将为人类健康做出更多贡献。     

对产气荚膜梭菌具有抑菌作用的益生菌的筛选及其抑菌性能探究

研究旨在筛选对产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,Cp)具有抑制作用的益生菌,探讨其抑制效果。采用抑菌圈法对益生菌菌株进行初筛,通过测定发酵液最低抑菌浓度(MIC)以及菌体共培养,探究所筛益生菌对产气荚膜梭菌的抑杀性能,测定乳酸对益生菌MIC的影响及益生菌菌数的动态变化,探究乳酸对益生菌抑菌作用和耐储性的影响。结果显示,筛选出3株对产气荚膜梭菌具有抑制作用的益生菌,分别为枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌,其发酵液抑菌圈直径分别为16.67、14.54、15.72 mm,MIC分别为250、250、125 mg/g。枯草芽孢杆菌和产气荚膜梭菌共培养12 h,产气荚膜梭菌的生长快速下降,共培养48 h后,无法检出产气荚膜梭菌活菌。凝结芽孢杆菌与产气荚膜梭菌共培养24 h,其生长快速下降,培养至72 h,未检测出产气荚膜梭菌活菌。乳酸的加入可以增强枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌发酵液的抑菌效果,其MIC分别为31.25、62.50、31.25 mg/g。酸化后的枯草芽孢杆菌发酵液、凝结芽孢杆菌发酵液和丁酸梭菌发酵液分别在31.25、62.50、31.25 mg/g浓度下能完全抑制产气荚膜梭菌的生长。该酸性制剂储存2个月后,枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌芽孢存活率分别为33.22%和0.10%。研究表明,枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌对产气荚膜梭菌均具有一定的抑制作用,但酸化的发酵液(芽孢为主)的储存性均较差。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在干酪乳杆菌中的分泌表达及其GM1结合活性分析

为获得表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的乳酸菌表达系统,并分析其免疫反应性和神经节苷脂受体(GM1)结合活性,本研究将编码LTB蛋白的eltb基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG-2中,构建重组质粒pPG-2-eltb,电转化于干酪乳杆菌393中。筛选获得重组干酪乳杆菌,应用western blot和间接ELISA方法鉴定LTB表达情况,并检测其与GM1结合活性。结果显示,目的蛋白以分泌形式表达,可被LTB阳性血清识别。GM1-ELISA试验结果证实表达的LTB可与牛GM1特异性结合。表明LTB蛋白在重组干酪乳杆菌获得了表达,并且具有免疫反应活性和佐剂活性,为以LTB为分子佐剂研制乳酸菌黏膜疫苗奠定基础。     

益生菌干酪乳杆菌LC-15生长及发酵特性研究

益生菌发酵剂对于益生菌发酵乳制品的开发与应用有很重要的研究意义,对一株具有降低胆固醇作用的益生菌干酪乳杆菌LC-15(Lactobacillus casei LC-15)进行生长发酵特性的研究。通过对干酪乳杆菌LC-15的生长及发酵特性的测定:确定了干酪乳杆菌LC-15在复原脱脂乳中凝乳需10h,12h时pH达到4.5,滴定酸度达到81.5°T,最适生长温度为38℃;药敏实验表明,干酪乳杆菌LC-15对四环素、氯霉素和红霉素高度敏感;该菌发酵乳所含挥发性风味物质中酮类物质与各类挥发性脂肪酸总含量分别达到了35.91%和52.52%;干酪乳杆菌LC-15发酵乳在前期发酵中酸度变化不大,有一定程度的后酸化现象;在pH4.0的PBS缓冲溶液4℃贮存10d总菌落下降近一个数量级;干酪乳杆菌LC-15在与其他发酵菌以3:1:1混合培养时,在39℃培养条件下6h开始凝乳,比干酪乳杆菌LC-15单菌发酵缩短4h。     

犬源益生菌的筛选及特性研究

本试验从健康的成年犬粪便中分离出11株菌株,采取抑菌试验筛选得到5株动物乳杆菌（Lactobacillus animalis） B5、B8、B9、B10、B11。5株菌株均有着良好的生长优势、产酸能力和自由基清除能力。菌株B5和B11在pH 2.0环境中的生存能力达50%以上;在0.3%胆盐浓度下,5株菌株存活率高于70%;B8有较强的自凝聚能力,5 h可达到63.78%;B9的表面疏水能力高达90.07%;5株菌株对青霉素、氯霉素、环丙沙星、氨苄西林普遍高度敏感,对庆大霉素、丁胺卡那、复方新诺明、四环素及万古霉素不敏感;溶血试验表明所选动物乳杆菌为无毒菌株。因此,这5株动物乳杆菌可作为潜在的益生菌菌株应用于犬食品中。     

益生菌B.coagulans对罗非鱼生长性能和肌肉营养成分的影响研究

以罗非鱼为试验动物,研究不同浓度的益生菌B.coagulans对其生长性能和肌肉营养成分的影响.试验分为4组,添加益生菌浓度分别为0(对照组)、1.0×106cfu/g(试验组-1)、5.0×106cfu/g(试验组-2)和1.0×107 cfu/g(试验组-3),每个处理3个重复.结果显示,与对照组和试验组-1比较,试验组-2和试验组-3显著(P<0.05)提高了罗非鱼的末重、日增重以及肌肉中钙、磷的含量,但是,试验组-2和试验组-3之间差异不显著.与对照组和试验组-1比较,试验组-2同样显著降低了(P<0.05)罗非鱼肌肉中粗脂肪的含量,但是与试验组-3比较没有显著差异.此外,益生菌B.coagulans对罗非鱼成活率以及肌肉中粗蛋白、粗灰分和水分含量没有显著影响.研究表明,饵料中添加一定浓度的益生菌B.coag-ulans,通过与动物肠道等的互作,可以显著改善罗非鱼的生长性能和肌肉中粗脂肪、钙、磷的含量.     

解淀粉芽孢杆菌SC06与肠毒性大肠杆菌K88对IPEC-1细胞转运载体、紧密连接、凋亡和免疫相关基因表达的影响

本试验以IPEC-1细胞为材料,探究解淀粉芽孢杆菌SC06(以下简称SC06)与肠毒性大肠杆菌K88(以下简称K88)对肠上皮屏障功能相关基因表达的影响。将IPEC-1细胞分为4个组并作不同处理:CK组为空白对照,不作处理; SC06组和SC06+K88组用含有108CFU/mL SC06的DM EM/F12培养基先预处理6 h,之后K88组和SC06+K88组加入含有108CFU/mL K88的DM EM/F12培养基处理3 h;乳酸脱氢酶(LDH)活性测定另设以含1%Trinton X-100的DM EM/F12培养基处理的Trinton组为阳性对照。各组细胞均培养9 h。结果表明:1)与CK组相比,K88和SC06单独处理均显著降低了葡萄糖转运载体2 (GLUT2)和小肽转运载体1(PepT1)基因的相对表达量(P<0.05),SC06单独处理显著增加了丙氨酸/丝氨酸/半胱氨酸/苏氨酸转运载体2(ASCT2)和兴奋性氨基酸转运载体1(EAAC1)基因的相对表达量(P<0.05);与K88单独处理相比,SC06预处理显著抑制了K88诱导的LDH活性和EAAC1基因相对表达量的增加(P<0.05)。2)与CK组相比,K88单独处理显著上调了闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、闭合蛋白(occludin)基因的表达(P <0.05),显著下调了密封蛋白(claudin)-3、claudin-4和黏蛋白-1(MUC1)基因的表达(P <0.05); SC06单独处理显著上调了ZO-1、claudin-4基因的表达(P <0.05); K88和SC06单独处理均显著促进了天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)、凋亡相关因子(Fas)及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)基因的表达(P<0.05),显著抑制了天冬氨酸蛋白水解酶-9(caspase-9)与Bcl-2相关X蛋白(Bax)基因的表达(P<0.05),且K88单独处理还显著降低了天冬氨酸蛋白水解酶-8(caspase-8)基因的表达(P<0.05)。与K88单独处理相比,SC06预处理显著阻止了由K88诱导的ZO-1、caspase-3和Bcl-2基因相对表达量的增加(P<0.05)及claudin-3、claudin-4、MUC1、caspase-9和Bax基因相对表达量的降低(P <0.05)。3)与CK组相比,K88单独处理显著上调了肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)及转化生长因子β(TGF-β)基因的表达(P<0.05),并显著上调了核转录因子-κB-p50(NF-κB-p50)、肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TRAF-6)、髓样分化因子88(MyD88)、核苷酸结合寡聚域1(NOD-1)及Toll样受体-4(TLR4)基因的表达(P <0. 05); SC06单独处理显著降低了IL-6、NOD1与Toll样受体-6(TLR6)基因的表达(P<0.05),显著上调了TG F-β和MyD88基因的表达(P<0.05)。与K88单独处理相比,SC06预处理显著抑制了由K88导致的MyD88、NOD-1及TLR4基因相对表达量的增加(P<0.05)。综上所述,K88诱导IPEC-1细胞发生炎症反应,破坏肠上皮细胞的完整性,SC06在一定程度上有缓解作用。     

中药联合益生菌对大肠杆菌性小鼠腹泻的保护作用

【目的】研究中药联合益生菌对大肠杆菌性小鼠腹泻的保护作用。【方法】通过正交试验筛选中药联合益生菌最佳因素配比。取60只小鼠随机分为空白组、模型组、中药组、益生菌组和中药联合益生菌组,每组12只。空白组小鼠腹腔注射生理盐水(0.2 mL/只),模型组、中药组、益生菌组和中药联合益生菌组均先腹腔注射分离菌悬液1×10⁷ CFU/kg,然后中药组按10 mL/kg灌胃中药液(其中蒲公英提取物浓度为0.25 g/mL,黄芪总黄酮和黄芪多糖浓度均为0.05 g/mL),益生菌组按4 mL/kg灌胃枯草杆菌悬液(菌含量5×10⁷ CFU/mL),中药联合益生菌组按上述量灌胃中药液和枯草杆菌混合液,每天定时灌胃给药1次,连续3 d。每日记录小鼠腹泻、体重、采食量等情况。末次给药12 h后分离心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏,称重并计算脏器系数;血液分析法检测血液学指标;取粪便及小肠内容物检测粪便隐血情况并进行细菌计数;ELISA法检测小鼠血清和小肠组织中髓过氧化物酶(MPO)活性。【结果】中药联合益生菌最佳因素配比为A₁B₂C₂D₂。与空白组相比,模型组小鼠腹泻率100%且无自愈现象,症状和剖检病变明显,腹泻指数极显著上升(P＜0.01),体重、采食量均极显著下降(P＜0.01),肝脏、脾脏器官指数均显著升高(P＜0.05),淋巴细胞比率(LYM)、中间细胞比率(MID)均显著下降(P＜0.05),粒细胞比率(GRAN)极显著上升(P＜0.01);与模型组相比,中药组和中药联合益生菌组腹泻指数极显著下降(P＜0.01),体重、采食量显著上升(P＜0.05),中药组肝脏、脾脏器官指数显著下降(P＜0.05),中药联合益生菌组脏器系数极显著下降(P＜0.01),中药组、益生菌组及中药联合益生菌组LYM显著上升(P＜0.05)、GRAN显著下降(P＜0.05)。粪便隐血检测结果显示,模型组检测呈强阳性;中药组、益生菌组呈弱阳性,中药联合益生菌组呈阴性。与空白组相比,模型组小鼠肠内大肠杆菌数、血清及小肠组织中MPO活性均极显著上升(P＜0.01);与模型组相比,中药组和中药联合益生菌组小鼠肠内大肠杆菌数、血清及小肠组织中MPO活性均显著下降(P＜0.05)。【结论】中药联合益生菌可降低腹泻指数、肝脏和脾脏器官指数,增加体重、饮食量,使粪便隐血转阴并降低肠内大肠杆菌数、血清及小肠组织中MPO活性,从而对大肠杆菌性小鼠腹泻产生协同保护作用。     

中药联合益生菌对大肠杆菌致小鼠腹泻保护机制研究

【目的】前期研究表明中药联合益生菌对致病性大肠杆菌所致小鼠腹泻具有明显的保护作用,本研究旨在进一步探讨中药联合益生菌对致病性大肠杆菌致小鼠腹泻的保护机制。【方法】选取小鼠60只,随机分为5组,空白组、模型组、中药组、益生菌组及中药联合益生菌组,每组12只。除空白组外,其余各组小鼠通过腹腔注射1×10⁷CFU/kg大肠杆菌分离株菌悬液建立小鼠腹泻模型,空白组腹腔注射等量生理盐水。中药组灌胃给予中药液(2.5 g/kg蒲公英提取物、0.5 g/kg黄芪总黄酮及0.5 g/kg黄芪多糖),益生菌组灌胃给予枯草芽孢杆菌悬液(2×10⁸CFU/kg),中药联合益生菌组灌胃给予中药液(2.5 g/kg蒲公英提取物、0.5 g/kg黄芪总黄酮及0.5 g/kg黄芪多糖)与枯草芽孢杆菌悬液(5×10⁷CFU/kg)的混合液,1次/d,连续给药7 d。HE染色观察小肠组织病理学变化,扫描电镜观察小肠组织超微结构变化,ELISA法检测小鼠小肠匀浆和血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)含量,RT-PCR法检测小肠组...     

Molecular Mechanism of the Inflammatory Response Induced by Enterotrxigenic E. coli K88 in Piglets

To investigate the molecular mechanism of the inflammatory response in the piglets infected with enterotoxigenic E. coli (ETEC) K88, piglets were infected with ETEC K88,the IL-8 content in serum of piglets were assayed by ELISA,and the mRNA relative expression levels of TLR2/4 and its signal transduction pathway related genes (MyD88,Tollip and Bcl3) in mesenteric lymph nodes were detected by quantitative Real-time PCR. The results showed that compared with control group,the content of IL-8 in serum and the expressions of TLR2/4 in lymph nodes were all extremely significantly or significantly increased at 6 and 24 h after infection (P<0.01;P<0.05),and the IL-8 content and TLR2/4 mRNA expression at 24 h after infection were all significantly lower than those at 6 h after infection (P<0.05).In addition,the expressions of MyD88,Tollip and Bcl3 in lymph nodes were all extremely significantly increased at 24 h after infection compared with control group (P<0.01), but there was no significant difference between experimental group and control group at 6 h after infection (P>0.05). In conclusion,ETEC K88 infected piglets might produce inflammatory cytokines IL-8 through the TLR2/4-MyD88 signaling pathway,which could promote the inflammatory reaction in piglets. This inflammatory response might be regulated by Tollip and Bcl3,which could weak the inflammatory intensity in piglets.     

产肠毒素大肠杆菌K88诱导仔猪炎症反应的分子机制

为探讨产肠毒素大肠杆菌（ETEC） K88感染仔猪发生炎症反应的分子机制,试验用ETEC K88灌服断奶仔猪,ELISA法检测攻毒后仔猪血清中白细胞介素8（IL-8）含量,实时荧光定量PCR方法检测淋巴结中Toll样受体2（TLR2）、Toll样受体4（TLR4）及其信号通路相关基因（髓样分化因子88（MyD88）、Toll相互作用蛋白（Tollip）、B细胞淋巴瘤因子3（Bcl3））的mRNA相对表达水平。结果发现,仔猪攻毒ETEC K88后6和24 h血清IL-8含量和淋巴结TLR2/4的表达水平均极显著或显著高于对照组（P<0.01;P<0.05）,且感染后24 h显著低于感染后6 h（P<0.05）;仔猪感染ETEC K88后24 h淋巴结中MyD88、Tollip和Bcl3的表达水平均极显著高于对照组（P<0.01）,但是感染后6 h时与对照组相比均无显著差异（P>0.05）。综上所述,ETEC K88感染仔猪可能是通过TLR2/4-MyD88信号通路产生炎症因子IL-8,促使仔猪出现炎症反应,且该炎症反应可能受Tollip和Bcl3蛋白的调控而被减弱。     

2株枯草芽孢杆菌对大肠杆菌和沙门氏菌的体外抑菌试验研究简

本试验旨在检测2株枯草芽孢杆菌对致病性大肠杆菌和沙门氏菌抑菌作用。以致病性大肠杆菌和沙门氏菌作为指示菌,采用2株枯草芽孢杆菌与大肠杆菌和沙门氏菌同时接种及先后接种的方法,对其与大肠杆菌和沙门氏菌的生物颉颃作用进行了研究。结果表明,先接种枯草芽孢杆菌再接种致病菌抑制作用最明显且在24 h时抑菌作用最强,同时接种枯草芽孢杆菌和致病菌抑制作用次之,先接种致病菌再接种枯草芽孢杆菌的抑制作用最弱。提示,2株枯草芽孢杆菌对致病性大肠杆菌和沙门氏菌都有一定的抑制作用,但抑制作用的强弱有差异,且与枯草芽孢杆菌和致病菌接种的时间长短有关。     

绵羊肠道3株乳酸杆菌对大肠杆菌的体外生物颉颃试验

用健康成年羊肠道分离的3株乳酸杆菌对致病性大肠杆菌进行体外生物颉颃试验。结果：3株乳酸杆菌对致病性大肠杆菌均有明显的生物颉颃作用（P〈0．01）。     

动物性食品源大肠杆菌O血清型鉴定及其K88菌毛基因检测

本研究对河北省冀东地区农贸市场和超市采集的生猪肉、生鸡蛋和生羊肉等分离得到的20株大肠杆菌进行大肠杆菌血清型鉴定;并检测不同血清型大肠杆菌的K88菌毛基因。采用常规方法进行大肠杆菌的O血清型鉴定,用PCR方法检测K88菌毛基因。分离鉴定的20株大肠杆菌有7种血清型,包括O38、O78、O88、O11、O107、O91、O9,其中O38、O78为优势血清型菌,均占分离菌株的25%(5/20)。在分离的动物性食品源大肠杆菌中有30%(6/20)的菌株K88菌毛基因扩增呈阳性。结果表明,O78、O38为冀东地区动物性食品源大肠杆菌常见血清型,30%(6/20)的菌株K88菌毛基因扩增阳性。