广西巴马小型猪Oct4基因克隆及其在成纤维细胞中的表达

根据GenBank中公布的猪Oct4核苷酸序列设计合成1对引物,采用RT-PCR方法从巴马小型猪睾丸组织扩增Oct4基因编码全序列。然后将该基因重组于含有绿色荧光报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建成pEGFP-Oct4重组质粒,通过酶切电泳鉴定和DNA测序证明重组质粒构建成功。使用脂质体2000将pEGFP-Oct4转染巴马小型猪肾脏成纤维细胞,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,转染细胞株中可检测到Oct4的转录。结果表明,成功构建了真核表达载体pEGFP-Oct4,并可在巴马小型猪肾脏成纤维细胞中表达,为进一步研究Oct4基因生物学功能奠定了基础。     

敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊DKK1基因的重组质粒,并对其转染成纤维细胞后基因的表达量变化进行研究。试验采集敖汉细毛羊肱二头肌提取基因组DNA,参照GenBank中DKK1基因序列设计1对引物,PCR扩增获得DKK1基因片段,连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-DKK1重组质粒并转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,鉴定正确后构建PmaxGFP-DKK1重组质粒,转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞;对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的重组质粒PmaxGFP-DKK1转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测DKK1基因在成纤维细胞中的表达量变化。结果显示,经酶切、测序鉴定发现,重组质粒PmaxGFP-DKK1构建成功,大小为3 956 bp,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染细胞后DKK1基因的表达量明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组（P<0.01）。试验成功构建了敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒,并成功转染成纤维细胞,为进一步研究DKK1基因的功能奠定基础。     

绿色荧光蛋白表达载体的改造和表达

为获得增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的真核表达载体pEFP-N1-MSC,并观察其在猪成纤维细胞中的表达情况,用Nhe Ⅰ和Age Ⅰ消除pEGFP-N1质粒上的多克隆位点(MSC),然后补平连接,获得增强型绿色荧光蛋白编码基因的真核表达载体pEGFP-N1-MSC质粒,将pEGFP-N1-MSC质粒转化DH5α感受态细胞,于Kanr LB平板上筛选阳性克隆.重组子经Nhe Ⅰ和Age Ⅰ双酶切鉴定,将该载体转染猪成纤维细胞,24 h后观察EGFP表达情况,48 h后添加G418进行筛选.结果表明:改造的pEGFP-N1-MSC真核表达载体,成功转染猪成纤维细胞,在倒置荧光显微镜下呈现绿色光,获得可产生绿色荧光的pEGFP-N1-MSC载体,为构建猪双正选择同源重组载体奠定了基础.     

绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建及在其原代成纤维细胞中的瞬时表达

Myostatin(MSTN)基因是胚胎期肌肉形成和出生后骨骼肌生长的主要调控因子之一,通过抑制肌细胞的扩增和分化而调控肌肉的生长和发育。为了进一步揭示MSTN在绵羊成纤维细胞中的生物学功能,采用RT-PCR从绵羊肌肉组织中扩增MSTN基因,将其cDNA终止密码子TGA删除,采用定向克隆技术连接到带有水母绿色荧光蛋白(AcGFP)报告基因的真核表达载体pAcGFP-N1中,构建融合蛋白重组质粒,经XhoⅠ/SacⅡ双酶切、测序鉴定后,用脂质体介导质粒转染绵羊原代成纤维细胞,观测荧光表达及用RT-PCR和Western blotting方法检测基因转录、蛋白质表达情况。结果表明,成功克隆绵羊MSTN基因,通过PCR方法在MSTN阅读框两端引入了XhoⅠ和SacⅡ克隆位点,成功构建pAcGFP-MSTN融合蛋白真核表达载体,重组质粒转染绵羊成纤维细胞24 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,通过RT-PCR扩增出1138 bp的转录产物,并用Western blotting检测到78 ku目的蛋白的表达。本试验为研究MSTN基因在成纤维细胞和脂肪分化调控中的具体机制奠定基础。     

敖汉细毛羊Notch1基因真核表达载体的构建及在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊Notch1基因表达载体及转染成纤维细胞后基因表达量变化。试验以敖汉细毛羊40日龄胎儿为研究对象,提取RNA反转录并参照Gen Bank中Notch1基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得Notch1基因片段,将得到的Notch1基因片段连接至pGM-T载体,构建pGM-T-Notch1克隆载体并转化大肠杆菌(E.coli) DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定后构建pcDNA3.1-Notch1重组表达载体,转化大肠杆菌(E.coli) DH5α感受态细胞。将敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的pcDNA3.1-Notch1瞬时转染成纤维细胞,利用荧光定量PCR技术检测Notch1基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示:经酶切、测序鉴定质粒pcDNA3.1-Notch1构建成功,并且转染成纤维细胞后Notch1基因的表达量升高,且转染组的表达量极显著地高于对照组(P0.01)。结论:成功构建了敖汉细毛羊Notch1基因的表达载体,并且成功转染成纤维细胞,基因表达量明显升高,结果可为进一步研究其功能奠定基础。     

鸡α干扰素基因真核表达载体pCAGGS-IFN-α的构建及其在293T细胞中的表达

为了构建鸡α干扰素基因真核表达载体,试验采用RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞中扩增α干扰素基因序列,将扩增产物定向插入到pMD18-T克隆载体中,进行序列测定;测序正确的质粒经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切,将目的基因片段定向克隆到真核表达载体pCAGGS中,构建重组质粒pCAGGS-IFN-α;将重组质粒转染293T细胞,使用间接免疫荧光、Western-blot等方法检测目的蛋白。结果表明:已成功扩增出582 bp大小的鸡α干扰素基因片段,测序结果与GenBank报道的序列基本一致。说明阳性重组质粒pCAGGS-IFN-α真核表达载体构建成功,能正确表达鸡α干扰素。     

鸡卵清蛋白基因5′调控序列表达载体的构建及其在鸡原代输卵管上皮细胞及鸡成纤维细胞的表达

将氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因与鸡卵清蛋白基因上游调控序列融合，构建了pCAT-3-OVP(鸡卵清蛋白基因5′调控序列）表达载体。将构建的载体与脂质体混合后制备转染液，转染鸡原代输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞进行瞬时表达。结果表明，在鸡原代输卵管上皮细胞，转染后48h表达量最高，为0．67μg/L;而在鸡成纤维细胞，不论有无类固醇激素存在，均不表达。结果提示，在输卵管细胞中存在细胞特异性转录因子。     

表达鹅α干扰素基因重组禽痘病毒的构建及表达产物抑制鹅细小病毒活性的初步研究

为研究表达鹅α干扰素(GoIFN-α)基因重组活载体疫苗对抑制病毒增殖活性,本实验从植物血凝素刺激的延边白鹅外周血淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR扩增gIFN-α基因,其大小为576 bp.将其与LacZ表达盒串联克隆于pSY681质粒中构建pSY681-IFN-α-LacZ转移重组质粒.采用脂质体将重组质粒转染于预感染禽痘病毒(FPV) 017株的鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝/白斑筛选获得重组禽痘病毒rFPV-IFN-α.采用间接免疫荧光和western blot方法对重组毒鉴定结果显示,GoIFN-α基因在CEF中获得表达,分子质量约为29 ku.表达的CoIFN-α对鹅细小病毒在鹅胚成纤维细胞中的复制具有抑制作用.本研究为进一步开展GoIFN-α基因重组FPV活载体疫苗的体内试验奠定了基础.     

诱导性表达Cre重组酶转基因猪成纤维细胞的构建及鉴定

通过PCR方法分别从pGL3-Mx1载体上和pcDNA3.1(+)载体上扩增猪Mx1启动子和BGHpolyA;利用重叠PCR方法获得猪源的Cre重组酶基因,并从pGcFRT2NeoR上用Xhol Ⅰ和Sal Ⅰ酶切得到FRT2NeoR盒子.将上述4个片段利用SOE-PCR及T5 DNA连接酶连接,然后利用原核表达载体pET28a(+)构建Cre表达载体Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR.用LipofeetamineTM2000介导转染猪成纤维细胞,G418筛选阳性细胞,PCR鉴定.结果表明,成功构建了诱导性表达Cre重组酶表达载体Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR,并成功整合到猪成纤维细胞的基因组中,获得了诱导性表达Cre重组酶的转基因猪成纤维细胞,为最终通过核移植方法获得诱导性表达Cre重组酶转基因猪奠定基础.     

鸡gga-miR-199a慢病毒表达系统的构建

为建立一种稳定持续表达鸡gga-miR-199a的系统,将从鸡DF-1细胞扩增到的gga-miR-199a前体序列克隆入pLL3.7慢病毒载体质粒中用以包装慢病毒。同时构建了更换pLL3.7质粒中鼠源U6启动子更换为鸡源及人源U6启动子的pLL3.7慢病毒载体质粒;将其与慢病毒包装辅助质粒共转至HEK293T细胞中,收集浓缩病毒颗粒并侵染细胞并获得过表达gga-miR-199a的单细胞克隆。提取单细胞克隆总RNA进行gga-miR-199a-5P的定量检测。结果表明,经慢病毒侵染后的细胞中鸡gga-miR-199a表达量显著提高,且人源U6启动子的转录效率最高,该研究成功建立了一种稳定持续表达鸡gga-miR-199a的慢病毒系统,说明该系统有利于在鸡活体或原代细胞中开展miRNA功能的研究。     

E3泛素连接酶Nrdp1和SOCS-1对布鲁氏菌诱导细胞凋亡的影响

为了探讨E3泛素连接酶Nrdp1、SOCS-1基因在布鲁氏菌侵染巨噬细胞过程中对细胞凋亡的影响,构建Nrdp1、SOCS-1基因的干扰和过表达细胞模型(简称为pLL3.7-N1、pLL3.7-S1和pLEX-Nrdp1、pLEX-SOCS-1);羊种布鲁氏菌16M(简称16M) 侵染正常细胞RAW264.7及pLL3.7-N1、pLEX-Nrdp1、pLL3.7-S1、pLEX-SOCS-1组细胞,qRT-PCR检测Bax、Bcl-2、TNF-α的mRNA表达量,并通过流式细胞仪术检测细胞凋亡率。结果显示,试验成功构建并筛选出干扰和过表达Nrdp1、SOCS-1效果最好的pLL3.7-N1、pLEX-Nrdp1、pLL3.7-S1、pLEX-SOCS-1细胞模型;16M侵染各组细胞,与对照组相比,在不同的时间段pLL3.7-N1、pLL3.7-S1、pLEX-Nrdp1、pLEX-SOCS-1组细胞的Bcl-2和Bax的mRNA表达量差异显著(P < 0.05);pLL3.7-S1组细胞的TNF-α mRNA显著降低(P < 0.05),而pLEX-SOCS-1组显著升高(P < 0.05);pLEX-Nrdp1、pLEX-SOCS-1组细胞凋亡率显著升高(P < 0.05),而pLL3.7-S1组显著降低(P < 0.05)。研究结果表明,Nrdp1、SOCS-1基因与16M诱导的细胞凋亡密切相关,为16M胞内寄生机制的研究奠定了基础。     

Effect of E3 Ubiquitin Ligase Nrdp1 and SOCS-1 on Intracellular Survival and Macrophage Apoptosis Induced by Brucella

In order to investigate the effect of E3 ubiquitin ligase Nrdp1 and SOCS-1 genes on apoptosis during Brucella infection macrophages.The cell models of interference and over expression of Nrdp1 and SOCS-1 genes (pLL3.7-N1,pLL3.7-S1 and pLEX-Nrdp1,pLEX-SOCS-1) were constructed.Normal RAW264.7 cell,pLL3.7-N1,pLEX-Nrdp1,pLL3.7-S1 and pLEX-SOCS-1 group cells were infected with Brucella melitensis 16M (referred to 16M),the expression of Bax,Bcl-2,TNF-α genes were detected by qRT-PCR and apoptosis rate was detected by flow cytometry.pLL3.7-N1,pLEX-Nrdp1,pLL3.7-S1,pLEX-SOCS-1 cell model of the works best of interference and overexpression Nrdp1,SOCS-1 were successfully constructed and screened.After 16M infecting each group cells,compared with the control group,the expression of Bcl-2 and Bax mRNA in pLL3.7-N1,pLEX-Nrdp1,pLL3.7-S1 and pLEX-SOCS-1 groups were significantly different in different time periods (P < 0.05).The expression of TNF-α mRNA in pLL3.7-S1 group was significantly lower (P < 0.05),while the pLEX-SOCS-1 group was significantly higher (P < 0.05).Apoptosis rates in pLEX-Nrdp1,pLEX-SOCS-1 groups were significantly higher (P < 0.05),while pLL3.7-S1 group was lower (P < 0.05).The results showed that the Nrdp1 and SOCS-1 genes were closely related to apoptosis with 16M induction,the research laid the foundation for the study of 16M intracellular parasitism mechanisms.     

牦牛AIF-1蛋白表达及对巨噬细胞炎性因子mRNA的影响

旨在对牦牛同种移植炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)蛋白进行原核表达、纯化,并探讨其对巨噬细胞炎性因子的影响。采用q-PCR检测AIF-1基因在牦牛5种组织中的表达量,构建原核表达载体表达纯化AIF-1蛋白,q-PCR检测小鼠巨噬细胞4种炎性因子的表达量。结果表明,AIF-1基因在麦洼牦牛脾中表达水平最高,极显著高于其它组织(P<0.01)。表达并纯化出约29.47 ku的AIF-1重组蛋白,1.0、10.0、100.0μg·mL^-1 AIF-1蛋白均能促进小鼠巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS的表达。这表明AIF-1在巨噬细胞免疫应答中发挥着一定作用,为深入研究牦牛AIF-1功能提供参考。     

虾青素对小鼠早期胚胎发育及相关基因表达的影响

试验旨在研究培养液中添加虾青素（AX）对小鼠胚胎体外发育和相关基因表达的影响。试验选用23~25 g的ICR系雌性小鼠,利用超数排卵,取卵母细胞进行体外受精,受精1 h后将受精卵随机分组、分别移入浓度为0、5、10、25、50 μmol/L的虾青素培养液中进行体外发育培养,在培养24和96 h后分别观察并统计各组的卵裂率和囊胚率;体外培养至96 h后,对囊胚进行细胞计数,统计囊胚细胞数差异;提取各组囊胚总RNA,利用实时荧光定量PCR技术对各组胚胎的TGF-β和Bcl-2基因的相对表达量进行检测。结果显示,添加10 μmol/L虾青素能够改善小鼠胚胎体外发育环境且显著提高胚胎卵裂率和囊胚率（P<0.05）;显著提高囊胚的细胞数（P<0.05）;极显著提高TGF-β基因表达量（P<0.01）。结果表明,添加10 μmol/L虾青素有利于小鼠胚胎体外发育,可用于改善小鼠胚胎体外发育环境;TGF-β和Bcl-2基因很可能参与了胚胎发育过程中的相关调控。     

ChMDA5通路参与传染性法氏囊病病毒致雏鸡法氏囊损伤的研究

传染性法氏囊病病毒（IBDV）为dsRNA病毒,可造成雏鸡法氏囊损伤进而发生免疫抑制;MDA5是能够特异性识别dsRNA病毒的模式识别受体。为研究鸡MDA5（chMDA5）信号通路在IBDV致雏鸡法氏囊病理损伤中的作用,试验选取50只14日龄SPF雏鸡随机分为IBDV感染组和空白对照组,每组25只,IBDV感染组雏鸡通过点眼、滴鼻感染IBDV JIC7株病毒液,0.6 mL·只^-1,空白对照组雏鸡经相同途径给予相同剂量无菌PBS,感染IBDV后第1、4、7、21及35天采集雏鸡法氏囊。采用qRT-PCR方法检测法氏囊中IBDV载量,chMDA5及chMDA5信号通路衔接蛋白（chIPS-1）、转录因子（chIRF3和chNF-κB）、下游产物细胞因子（chIFN-β、chTNF-α、chIL-1β、chIL-6） mRNA水平变化;间接免疫荧光法检测chMDA5蛋白表达变化,传统病理学方法检查法氏囊病理组织学变化。结果发现,雏鸡感染IBDV后,其法氏囊中chMDA5、chIPS-1、chIRF3、chNF-κB、chIFN-β、chTNF-α、chIL-1β、chIL-6的表达量均显著高于对照组,且法氏囊组织发生形态损伤,上述变化趋势与IBDV载量变化基本一致。结果表明,雏鸡法氏囊chMDA5及其信号转导通路可被IBDV激活,参与到IBDV感染雏鸡法氏囊损伤与抗损伤过程中。     

布鲁氏菌侵染对类泛素SUMO-1表达的影响及类泛素SUMO-1慢病毒表达载体的构建

研究布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后类泛素SUMO-1的表达变化,并构建小鼠类泛素SUMO-1基因过表达的慢病毒载体。本试验分别利用布鲁氏菌16M、M5-90侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测细胞中类泛素SUMO-1的表达;利用DNA重组技术将类泛素SUMO-1基因片段插入到慢病毒表达载体pLEX-MCS 中,获得重组慢病毒质粒pLEX-SUMO-1,测序鉴定成功后转染293T 细胞,包装好的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,并利用实时荧光定量PCR、Western blotting方法分别检测细胞中类泛素SUMO-1 mRNA及蛋白表达水平。结果表明,布鲁氏菌16M、M5-90侵染细胞后,在感染早期类泛素SUMO-1的表达受到抑制,12 h内呈现下降趋势,在12 h后开始上升,极显著高于正常水平(P < 0.01);测序结果证明,类泛素SUMO-1基因正确插入到pLEX-MCS 质粒中;实时荧光定量PCR方法检测表明,类泛素SUMO-1 mRNA转录水平上调。由此可见,布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7能够引起细胞内类泛素SUMO-1表达的改变;成功构建了类泛素SUMO-1慢病毒过表达载体,为进一步研究类泛素SUMO-1的功能奠定基础。     

Cloning of Pig ZO-1 Gene and Screening on its Effective shRNA Fragments

The aim of this study was to screen effective shRNA fragments targeting pig zonula occludens-1 (ZO-1) gene,which would lay foundation to further explore its function in pig oocytes in vitro maturation (IVM) by RNAi technology.Pig ZO-1 gene was cloned and its eukaryotic expression vector was constructed,its effective shRNA fragments were screened.The results showed that the CDS length of cloned pig ZO-1 gene was 3 036 bp.The results of sequence multialigned showed that the sequence of pig ZO-1 gene shared 88%,88%,87% and 85% homology with Taurus,Ovis aries, Equns caballus and Homo sapiens,respectively.Clear RFP red fluorescent was observed in transfected cells with the pDsRed-N1-ZO-1 eukaryotic expression plasmid transfected into HEK293T cells by X-tremeGENE HP DNA transfection reagent.Two shRNA fragments targeting pig ZO-1 gene were designed and synthesized,weaker RFP red fluorescent was observed in co-transfected cells with the target and interfered shRNA plasmid groups.The Real-time PCR results showed that the two designed shRNAs could effectively inhibit the expression of pig ZO-1 mRNA,shRNA201 fragment had significantly higher inhibition effect than that of shRNA1276 fragment (77.8% and 67.0%,P < 0.05).