亮甲酚蓝染色对牛卵母细胞体外成熟和凋亡的影响

为了探讨亮甲酚蓝(brilliant cresyl blue,BCB)对牛未成熟卵母细胞染色选择后对其体外成熟(IVM)和凋亡的影响,本研究在牛卵母细胞成熟培养前用26 μmol/L BCB染色90 min作为处理组,以未染色卵母细胞作为对照组;将处理组依照胞质的颜色分为蓝色组(BCB⁺)和无色组(BCB^-),成熟培养后检测卵子的发育能力。结果表明:①经BCB染色卵母细胞在成熟后,BCB⁺组卵母细胞成熟率(80.92%)较对照组(60.00%)和BCB^-组(51.61%)差异显著(P<0.05);②BCB⁺组的凋亡率(6.50%)较对照组(28.21%)、BCB^-组(39.06%)差异显著(P <0.05),随着卵母细胞发育潜能的升高其凋亡率逐渐降低。由此可见,以亮甲酚蓝染色为基础的牛卵丘-卵母细胞复合体的区分可以用来有效的选择更具发育活力的牛卵母细胞。     

单宁酸对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

研究旨在探讨单宁酸对猪卵母细胞体外成熟质量及其胚胎发育能力的影响。在猪卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外成熟培养液中添加不同浓度（0、1、10、100 μg/mL）单宁酸培养42 h后,检测COCs的扩散程度和卵丘细胞扩散指数,统计COCs的体外成熟率,检测成熟卵母细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）、活性氧（reactive oxygen species,ROS）和生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）的水平,并统计孤雌激活及体外受精胚胎48和168 h的卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数。结果显示,与对照组相比,10 μg/mL单宁酸组卵丘细胞扩散指数显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率差异不显著（P>0.05）,100 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组GSH和GDF9水平显著提高（P<0.05）,ROS水平显著降低（P<0.05）。孤雌胚胎和体外受精胚胎发育能力结果显示,与对照组相比,各单宁酸组卵裂率差异不显著（P>0.05）,10 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚率及体外受精胚胎囊胚率显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚细胞数及体外受精胚胎囊胚细胞数均显著低于其他各组（P<0.05）。以上结果表明,10 μg/mL单宁酸可通过提高卵丘细胞扩散能力及GSH和GDF9水平、降低卵母细胞内ROS水平,改善猪卵母细胞成熟质量,提高孤雌胚胎及体外受精胚胎的发育能力。     

藏红花素对小鼠卵母细胞体外成熟能力的影响

试验旨在探讨藏红花素（crocin）的抗氧化应激作用对小鼠卵母细胞体外成熟及后续胚胎发育能力的影响。在体外成熟（IVM）培养液中添加不同浓度藏红花素（0、5、10、15、20、25、30 μmol/L），小鼠卵母细胞在体外成熟培养12 h后，检测卵母细胞第一极排出情况、卵母细胞胞质内活性氧（ROS）和谷胱甘肽（GSH）含量，并进行体外受精（IVF）；体外受精后6 h统计受精率，24 h统计卵裂率，96 h统计囊胚率。结果显示，与对照组相比，10、15 μmol/L藏红花素显著提高了卵母细胞第一极体排出率（P<0.05）；当藏红花素浓度继续增加时，卵母细胞的第一极体排出率下降，30 μmol/L藏红花素显著降低了卵母细胞第一极体排出率（P<0.05）；5、10、15 μmol/L藏红花素均显著降低了卵母细胞ROS含量（P<0.05），10、15 μmol/L藏红花素均显著提高了卵母细胞GSH含量（P<0.05）。与对照组相比，10 μmol/L藏红花素组受精率、卵裂率、囊胚率差异均不显著（P>0.05），15、20、25、30 μmol/L藏红花素均显著降低受精率和囊胚率（P<0.05），对卵裂率影响不显著（P>0.05）。结果表明，在小鼠卵母细胞体外成熟培养液中添加10 μmol/L藏红花素可以显著增加第一极体排出率，显著降低卵母细胞ROS含量、提高卵母细胞GSH含量，但对受精后的胚胎发育无显著影响。     

BCB和Zebularine对绵羊体细胞核移植胚胎发育效果的影响

为探究亮甲酚蓝(BCB)染色选择的卵母细胞是否有利于体细胞核移植胚胎的体外发育,本实验将卵丘-卵母细胞复合体(COCs)放入含有BCB的PBS中染色,根据细胞质颜色可将卵母细胞分成BCB~+组和BCB~-组,并以未经BCB处理的COCs作为对照组,然后将卵母细胞进行体外成熟,统计卵母细胞的成熟率。将成熟后的卵母细胞进行体细胞核移植,其中,部分BCB~+组卵母细胞所需的供体细胞利用Zebularine处理,统计体细胞核移植的卵裂率、桑椹胚率和囊胚率。结果表明:BCB~+组卵母细胞的成熟率显著高于对照组和BCB~-组(71.15%vs 65.38%,53.52%,P0.05);BCB~+组核移植胚胎的卵裂率(87.91%vs 56.83%)、桑椹胚率(37.41%vs 21.73%)和囊胚率(21.48%vs6.82%)均显著高于BCB~-组(P0.05);与对照组相比,BCB~+组卵裂率(87.91%vs 83.23%)和囊胚率(21.48%vs14.89%)也显著升高(P0.05)。BCB~+组供体细胞经Zebularine处理后,胚胎发育能力进一步提高,其中囊胚率显著高于BCB~+组、对照组和BCB~-组(29.25%vs 21.48%,14.89%,6.82%,P0.05)。     

细胞松弛素B对猪孤雌胚胎和体外克隆胚胎发育能力的影响

为探讨细胞松弛素B（cytochalasin B,CB）对猪孤雌胚胎和克隆胚胎发育能力的影响,本研究通过在猪体外胚胎培养基中添加不同浓度CB以及不同孵育时间的处理,筛选出CB对猪早期胚胎发育的最适浓度和最佳孵育时间,同时通过Hoechst33342染色检测猪体外囊胚孵化期的细胞数差异,进一步研究CB对孤雌胚胎和克隆胚胎发育的影响。结果显示,培养基中添加CB浓度为7.5 μg/mL时孤雌胚胎和克隆胚胎的卵裂率分别为85.00%和90.23%,囊胚率为35.68%和42.58%,均显著高于其他各组（P < 0.05）;采用7.5 μg/mL CB处理电激活后的孤雌胚胎和克隆胚胎,孤雌胚胎孵育4 h组的卵裂率（83.80%）和囊胚率最高（35.39%）,与其他各组差异显著（P < 0.05）,而克隆胚胎孵育6 h组的卵裂率（83.98%）和囊胚率最高（55.62%）,与其他各组差异显著（P < 0.05）。此外,Hoechst33342染色结果显示,未添加CB处理的孤雌胚胎在囊胚孵化期的细胞平均数为28个,CB处理组的孤雌胚胎和克隆胚胎细胞平均数分别为36和52个,处理组和未处理组细胞数差异显著（P < 0.05）。结果表明,猪体外孤雌胚胎用7.5 μg/mL CB 处理4 h可获得较高的卵裂率和囊胚率;体外克隆胚胎用7.5 μg/mL CB 处理6 h卵裂率及囊胚率最高,且囊胚期内细胞团细胞总数最多。CB处理有利于体外胚胎早期发育,提高克隆胚胎移植受孕率。     

体内、外卵母细胞对猪体细胞克隆胚胎发育潜力的影响

为探讨猪体内、外成熟卵母细胞对核移植重组胚胎发育能力的影响,试验通过激素促排获得体内成熟卵母细胞和收集废弃卵巢获取体外成熟的卵母细胞,分别构建核移植重组胚,比较其卵裂率、囊胚率及胚胎移植受孕情况。结果显示,PGC+PMSG+HCG组的平均排卵数（27.8枚/头）显著高于PGC+HCG （12.5枚/头）、PMSG+HCG （13.7枚/头）及自然发情组（11.5枚/头）（P<0.05）,体内收集到的卵母细胞,可用于构建核移植重组胚的可用卵率均达到90%以上,与其他处理组差异不显著（P>0.05）,说明通过激素处理可获得更多的可用卵母细胞,而且卵母细胞的质量没有显著差异;以体内和体外成熟卵母细胞作为核移植受体构建的克隆胚胎,二者的胚胎融合率（80.31%和79.29%）和卵裂率（90.40%和86.51%）差异均不显著（P>0.05）,但来自体内成熟卵母细胞克隆的胚胎发育至囊胚期的比例显著升高（P<0.05）;将体内、外成熟卵母细胞构建的核移植重组胚分别移植代孕母猪,头平均移植30或60枚时,体内成熟卵母构建的克隆胚胎移植出生仔猪10头,而体外培养卵母细胞构建的克隆胚胎均未着床受孕,表明通过激素促排获得的卵母细胞质量更好,能显著提高克隆胚胎的囊胚率,减少胚胎移植数量,提高代孕母猪的怀孕率。     

甘草酸单铵盐对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

将收集的猪COCs置于添加不同浓度(0.0,0.3,0.6,1.2μmol/L)甘草酸单铵盐(monoammonium glycyrrhizinate, MAG)的卵母细胞体外成熟培养液中培养46 h,统计成熟率，通过免疫荧光染色检测成熟卵母细胞ROS表达水平；对成熟卵母细胞体外受精，于胚胎培养液内体外培养48,120 h,分别统计体外受精胚胎卵裂率、囊胚率，并用Hochest荧光染色检测囊胚总细胞数；结合成熟率及IVF胚胎发育囊胚率选定最佳添加浓度，在体外成熟培养液中添加最适浓度MAG,以0μmol/L MAG为对照组，体外培养46 h后，利用免疫荧光染色检测猪成熟卵母细胞的线粒体膜电位水平和细胞凋亡水平。结果显示，与对照组相比，不同浓度MAG处理组猪卵母细胞体外成熟率均有所提高，但差异均不显著(P>0.05);不同浓度MAG添加均可降低猪卵母细胞ROS水平，与对照组相比，0.3,0.6μmol/L组差异显著(P<0.05),1.2μmol/L组差异极显著(P<0.01)。0.3μmol/L添加组显著提高了猪体外受精囊胚率(P<0.05),但不同MAG添加组对...     

亮甲酚蓝染色对牛核移植胚胎体外发育的影响

为研究亮甲酚蓝(brilliant cresyl blue,BCB)染色选择卵母细胞对牛核移植体系的影响,本实验以未进行染色处理的牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)作为对照组,在成熟培养前用26μmol/L亮甲酚蓝染色90 min作为处理组,将处理组依照胞质的颜色分为蓝色组(BCB+)和无色组(BCB-),分别在成熟培养后作为受体,经胞质内注射法构建牛体细胞核移植胚胎,统计体细胞核移植的卵裂数、囊胚数和囊胚细胞数来评价其发育潜能。结果表明:BCB+组的成熟率(80.9%)与对照组(60.2%)和BCB-组(51.9%)差异显著(P<0.05);BCB+组的囊胚率(32.26%)与对照组(21.49%)和BCB-组(5.95%)差异显著(P<0.05),另外BCB+组的囊胚细胞总数(132.5)显著高于其他组(P<0.05)。结果显示,通过亮甲酚蓝染色法筛选出成熟的高质量牛卵母细胞用于体细胞核移植,可以获得更高的克隆囊胚率。     

体外成熟液中添加PAF对牦牛卵母细胞发育能力及基因表达的影响

旨在探讨体外成熟（IVM）液中添加血小板活化因子（PAF）对牦牛卵母细胞发育能力及基因表达影响。本试验将牦牛1 025个卵丘-卵母细胞复合体（COCs）分为4组,分别在含不同浓度PAF（0、10^-8、10^-7和10^-6mol·L^-1）的IVM液中成熟后,与奶牛精子体外受精（IVF）和体外培养（IVC）,比较分析各组卵母细胞成熟率、卵裂率和囊胚率以及COCs和胚胎中抗凋亡（BCL-2）、促凋亡（BAX）、表皮生长因子（EGF）及其受体（EGFR）、转录因子（OCT-4和NANOG）和c-fos等基因的表达量差异。结果表明,IVM液中PAF浓度为10^-7mol·L^-1组的卵母细胞成熟率（（92.16±0.19）%）、卵裂率（（77.20±0.85）%）和囊胚率（（46.71±0.68）%）显著高于其他组（P<0.05）。qPCR结果显示,在该组成熟的COCs中BCL-2、EGF、EGFR、c-fos表达量显著上调（P<0.05）,而促凋亡基因BAX表达量显著下调（P<0.05）,囊胚中EGF、EGFR、OCT-4基因表达量显著上调（P<0.05）。各组间2-、4-、8-细胞、桑椹胚和囊胚中BCL-2、BAX和NANOG表达量差异不显著,但桑椹胚和囊胚中BCL-2表达量均明显下调,而BAX表达量均明显上调。综上所述,IVM液中适宜浓度PAF（10^-7mol·L^-1）可以促进牦牛卵母细胞成熟和胚胎发育,调控细胞凋亡和增殖相关基因的表达。     

钙离子水平对猪卵母细胞体外成熟与早期胚胎发育的影响

维持细胞内钙离子(Ca²⁺)稳态对维护卵母细胞成熟及植入前胚胎正常发育至关重要。本实验旨在研究Ca²⁺水平变化对猪卵母细胞体外成熟发育的影响。收集的猪卵丘卵母细胞复合体(COCs)，随机分为3组，即对照组、100 nmol/L毒胡萝卜素(TG)组和100 nmol/L TG+300 nmol/L光溜海绵素C(XeC)组，体外培养，分别统计卵丘扩散情况、体外成熟率、胞内Ca²⁺水平，随后进行孤雌激活(PA)统计各组卵裂率、囊胚率及细胞总数。结果表明：添加XeC可显著改善由TG引起的猪卵丘细胞扩散不完全，卵母细胞体外成熟率、卵裂率和囊胚率降低，以及细胞数减少等现象，并显著降低由TG诱导的胞内Ca²⁺水平。综上，胞内Ca²⁺水平对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育具有重要的调控作用。     

Effect of BCB Staining on in vitro Maturation and Development of Nuclear Transfer Embryo of Pig Oocyte

This experiment aimed to study the effect of brilliant cresyl blue (BCB) on in vitro maturation of pig oocytes and the developmental capacity of pig SCNT embryos.The cumulus-oocyte complexes (COCs) were stained with different concentrations of BCB (13,26,39 and 52 μmol/L) for 90 min,and then we divided the COCs into BCB⁺ and BCB^- for in vitro culture 42 to 44 h.The results showed that,with the concentration of BCB increased,the staining rate (20.00%,46.39%,51.66% and 59.03%) raised gradually while the maturation rate of oocytes (74.03%,72.16%,70.53% and 48.61%) reduced,the percentages of oocytes staining by 26 μmol/L BCB for 90 min were higher than that of other groups in staining rate and maturation rate.However,the nuclear maturation rate of BCB⁺ groups were higher than that of BCB^- group.Therefore,26 μmol/L BCB was selected as the most effective concentration dying the oocytes (BCB⁺),which were used as parthenogenetic activation and nuclear transfer embryos.The cleavage and blastocyst rates of parthenogenetic activation and SCNT embryos in BCB⁺ group were significantly higher than that of BCB^- group (P<0.05),but there were no significant differences between the cleavage and blastocyst rates in the groups of BCB⁺ and control (P>0.05).Reconstructed embryos derived from the COCs stained with BCB were transferred to five surrogates,and six cloned piglets were obtained from one of the two pregnant pigs.These results showed that COCs stained with BCB was an effective method to select high-quality oocytes,which could improve the efficiency of in vitro embryo production.     

Effect of Human Menopausal Gonadotropin,17β-estradiol and Epidermal Growth Factor on the Quality of in vitro Maturation Bovine Oocytes

For optimizing in vitro maturation system of bovine oocytes,we firstly examined the influence of four different hormonal regimes(FSH+LH,HMG,FSH+LH+E₂ and HMG+E₂) on oocyte maturation rates.Then we studied the effects of epidermal growth factor (EGF) in the above defined medium on bovine oocyte maturation,in vitro development and quality of parthenogenetic embryos.The cell apoptotic index of parthenogenetic blastocysts was detected by TUNEL.No significant difference was observed in maturation rates in four groups supplemented with different hormones.However,human menopausal gonadotropin (HMG) provided steady maturation results in replicates.Maturation of oocytes was promoted by supplementation with 17β-estradiol (E₂).Combination of HMG and E₂ gave rise to steady and efficient mature results.The presence of EGF at 30 ng/mL concentration significantly increased maturation rate and blastocyst rate and reduced apoptotic cells in parthenogenetic blastocysts.Therefore,the optimal oocyte maturation solution could be supplemented with 0.075 IU/mL HMG,1 μg/mL E₂ and 30 ng/mL EGF.     

虾青素对小鼠早期胚胎发育及相关基因表达的影响

试验旨在研究培养液中添加虾青素（AX）对小鼠胚胎体外发育和相关基因表达的影响。试验选用23~25 g的ICR系雌性小鼠,利用超数排卵,取卵母细胞进行体外受精,受精1 h后将受精卵随机分组、分别移入浓度为0、5、10、25、50 μmol/L的虾青素培养液中进行体外发育培养,在培养24和96 h后分别观察并统计各组的卵裂率和囊胚率;体外培养至96 h后,对囊胚进行细胞计数,统计囊胚细胞数差异;提取各组囊胚总RNA,利用实时荧光定量PCR技术对各组胚胎的TGF-β和Bcl-2基因的相对表达量进行检测。结果显示,添加10 μmol/L虾青素能够改善小鼠胚胎体外发育环境且显著提高胚胎卵裂率和囊胚率（P<0.05）;显著提高囊胚的细胞数（P<0.05）;极显著提高TGF-β基因表达量（P<0.01）。结果表明,添加10 μmol/L虾青素有利于小鼠胚胎体外发育,可用于改善小鼠胚胎体外发育环境;TGF-β和Bcl-2基因很可能参与了胚胎发育过程中的相关调控。     

卵母细胞来源对水牛体细胞核移植胚胎发育潜能的影响

【目的】探索不同来源卵母细胞对体细胞核移植(SCNT)重构胚的发育能力及发育潜能关键蛋白表达水平的影响。【方法】试验分为活体采卵(OPU)和屠宰场(SLH)卵巢2组,OPU组用超声波活体采卵仪穿刺抽吸10头非泌乳期经产水牛卵巢的卵泡采卵,SLH组从屠宰场卵巢抽吸卵泡采卵。获得的卵母细胞分别进行体外成熟,体外成熟22～24 h后,吹打去除卵丘细胞,挑选具有第一极体的卵母细胞,去核后与水牛耳部成纤维细胞进行SCNT,分别统计SCNT重构胚的融合率、分裂率和囊胚率,用免疫荧光检测2种SCNT重构胚的E-钙黏蛋白(E-cadherin)和转录因子Sox2蛋白的表达水平。【结果】OPU组卵母细胞成熟率及其SCNT重构胚的囊胚率均显著高于SLH组(P<0.05),但2组SCNT重构胚的融合率和分裂率均无显著差异(P>0.05);免疫荧光结果显示,E-cadherin蛋白定位于细胞膜上,Sox2蛋白分布在细胞核膜及细胞质中,OPU组SCNT重构胚中E-cadherin和Sox2的表达水平均显著高于SLH组(P<0.05)。【结论】活体采集的水牛卵母细胞更适合用于SCNT重构胚的构建...     

人尿促性腺激素、雌二醇及表皮生长因子对牛卵母细胞体外成熟质量的影响

试验旨在研究不同激素配比及表皮生长因子(EGF)浓度对牛卵母细胞体外成熟及卵母细胞质量的影响。将随机分组的卵丘-卵母细胞复合体于添加FSH+LH、HMG、FSH+LH+E₂、HMG+E₂ 4种不同激素组合配比的成熟基础液中培养,对比其体外成熟率,比较了EGF对牛卵母细胞体外成熟率和孤雌胚胎体外发育的影响,并采用TUNEL法检测添加不同浓度EGF的牛孤雌激活囊胚细胞凋亡情况。结果表明,添加HMG的成熟试验结果稳定,E₂对牛卵母细胞成熟有一定的促进作用,HMG+E₂联合使用可以得到高效稳定的成熟结果;在此基础上,在成熟液中添加30 ng/mL EGF对牛卵母细胞的成熟质量、胚胎发育及降低胚胎细胞凋亡都有明显的促进作用。因此,在体外成熟培养液中添加0.075 IU/mL HMG、1 μg/mL E₂和30 ng/mL EGF对牛卵母细胞的成熟和质量较为有益。