叶锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库的构建及其质量评价

由小麦叶锈菌(Puccinia triticina)引起的小麦叶锈病在世界各地产麦区均有发生,利用抗病品种是防治该病害最经济、安全、有效的方法.小麦抗叶锈基因Lr19是一个十分有效的抗叶锈基因,自1966年首次将该基因从长穗偃麦草转到普通小麦中,至今仍是一个应用潜力很大的抗病基因.本研究以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr19和叶锈菌04-15-8①(生理小种类型THTS)为材料,构建叶锈病菌诱导的小麦叶片cDNA文库.研究结果表明文库的克隆数为4.1×106,插入片段大小在0.5～3.0kb,平均插入片段大小1.0 kb.因此该文库可用于基因克隆与分析,为研究小麦抗叶锈病相关基因提供条件.     

玉米根部酵母双杂交cDNA文库的构建及评价

从玉米各生长时期的根部中提取总RNA后,再利用磁珠法从中分离纯化出mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA).利用SMART技术,通过同源重组的方法,在酵母菌株AH109中构建了玉米根部全长cDNA文库.经检测,文库的转化率为1.76×107转化子/3μgpGADT7-Rec,文库滴度为1.17×106pfu/mL,重组率为95%.     

黄麻幼苗cDNA文库的构建和质量鉴定

黄麻全长cDNA文库的构建对开展黄麻遗传和功能研究具有重要的应用价值.以生产上的优良品种闽引一号为材料,利用Creator SMART cDNA Construction Kit技术,成功构建了黄麻苗期的全长cDNA文库.文库的滴度为1.9× 106 pfu/mL.随机挑取86个克隆进行菌落PCR鉴定,结果显示:插入片段的大小在0.5～2.0 kb之间.研究结果表明,黄麻全长cDNA文库的质量较高.     

枸杞叶片cDNA文库的构建

为了克隆和研究类胡萝卜素合成的一系列基因,采用TRIzol试剂提取枸杞叶片总RNA,然后利用PolyATtractmRNA分离系统分离mRNA,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA,以λ-ZAP为载体,体外包装后构建了滴度为2×107pfu/mL的枸杞叶片的cDNA文库。随机挑选10个克隆,经平板裂解酶切鉴定,插入序列的大小为0·5~3kb。该文库可以完全满足筛选或扩增基因的需要。     

全长cDNA文库的构建方法

全长cDNA文库的构建是进行功能基因组研究的一种经济、快速、有效的途径,克服了传统cDNA文库的缺点,节省了基因克隆和功能鉴定的时间,促进了功能基因组的研究进程。目前有6种构建全长cDNA文库的方法,包括Oligo-Capping、CAPture、SMART、CAP-trapper、CapSelect、CAP-jumping。这几种方法在起始材料用量、文库构建技术、实验操作复杂程度和文库构建质量等方面构存在不同程度的优缺点,但综合比较而言,SMART和CAP-trapper这两种方法比较有实际应用价值。SMART法适于简单、快速地构建一般质量的cDNA文库,如果采用Little-cycle SMART和Large-size SMART这两种改进技术,所建文库质量也非常好;CAP-trapper法虽然对实验技术要求较高,实验过程复杂,但所建文库全长率高,冗余性低,建库效率高,是目前构建高质量文库最好的方法。     

大豆叶片全长cDNA文库的构建与鉴定

以大豆绥农14第一个三出复叶幼叶为材料提取mRNA,利用SMART技术合成了全长cDNA,经限制性内切酶SfiA和SfiB消化后的cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB中,建成大豆叶片全长cDNA文库。文库容量1·2×106,重组率接近100%。对随机挑取的克隆进行菌液PCR鉴定,插入片断大小范围为0·25~2·0kb,主要集中在0·5~1·5kb,插入片断平均大小为0·9kb,这说明文库质量可保证大规模全长cDNA的获得。     

小金海棠抑制性消减cDNA文库的构建及文库质量分析

构建小金海棠抑制性消减文库,为进一步大量筛选、克隆苹果铁高效基因、果树转基因工程奠定基础。试验是在提取水培条件下小金海棠缺铁(EDTA-Fe2＋,4μmol/L)和正常供铁(EDTA-Fe2＋,40 μmol/L)的根的总RNA,经过LD-PCR扩增双链cDNA后,利用抑制性消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制性PCR,构建了小金海棠缺铁条件下包含1200个独立克隆的消减cDNA文库。用菌落PCR检测,结果显示插入片段大小范围在300~800bp之间,提取质粒进行PCR和质粒RsaⅠ酶切同样也得到一致性的结果。     

芝麻全长cDNA文库的构建及序列分析

本研究采用Gateway建库技术构建了中国芝麻主栽品种豫芝11号的植株生长发育过程中不同组织的全长cDNA文库(SiFcDNA)。该全长cDNA文库容为5.6×106,文库滴度为1.12×106 cfu/mL。部分克隆检测显示,文库cDNA片段长度集中于1.0~3.0 kb,重组率为96.88%,全长cDNA比例为88%。随机挑取1152个单克隆进行5'端EST测序,共获高质量有效EST序列1088条,拼接得到单一基因序列867条,其中46条单一基因在NCBI数据库中没有查到相应的同源序列,可能为芝麻生长发育过程特有的新基因;所获单一基因序列被划分为26个GO功能亚类。此外,从获得的Unigene序列中挖掘出了173个SSR,分布频率为4.78 kb/SSR;AG/CT类型SSR出现次数最多,占总SSR的19.08%。高质量全长SiFcDNA文库的构建为深入开展芝麻功能基因组学研究奠定基础。     

擎天凤梨花器官全长cDNA文库的构建及EST分析

为了通过基因工程手段来培育花色丰富、花型奇特的擎大凤梨新品种,从擎天凤梨中筛选出花色、花型相关调控基因则是十分必要的.本研究以擎天凤梨属品种Ostara为材料,采用SMART技术成功构建了擎天凤梨花器官的质粒型全长cDNA文库,初始文库滴度为3×10~6,插入片段平均长度大于1 kb;随机挑取2004个阳性克隆进行5'EST测序,获得高质量序列1 758条,经拼接获得1 365条单基因簇(unigene),其中跨叠群(contig)175个和单条序列(singlet)1 195个;经ORF寻找共获得有效ORF 1 283条;经COG分析EST序列编码的蛋白质被分为22类;经Blast分析后,获得一批花色、花器官发育、花期调控以及其它育种价值基因(包括cDNA全长或片段).该研究结果为擎天凤梨的花色、花型转基因等育种奠定了基础.     

Genes for Resistance to Yellow Rust in Seedlings of Wheat Cultivars from Pakistan Tested with British Isolates of Puccinia striiformis

Seedlings of 26 wheat caltivars from Pakistan were tested with 18 British races of P. striiformis. It is postulated that the race-specific genes Yr6, Yr7, Yr9 and perhaps Yr2 were present among the cultivars, and that there was other resistance not controlled by these genes.     

水分胁迫柠条锦鸡儿叶片均一化全长cDNA文库的构建及EST分析

柠条是包括内蒙古在内干旱荒漠草原上的优势建群植物,具有极强的耐旱(寒)力,为了研究其抗逆机理,挖掘和利用其抗旱基因,用Trizol法从经过干旱处理的柠条当年新生幼嫩枝叶中提取总RNA,分离纯化mRNA,采用SMART技术反转录合成双链cDNA,DSN技术进行均一化,构建了柠条全长cDNA文库。经检验,文库的滴度为1.5×106 cfu/mL,重组率为93.75%,90%以上插入片段的长度为1.0～2.0 kb。从文库中随机挑取3200个克隆进行5’测序,得到3020个有效EST,合成2429个unigenes,其中,singlets 2229条,占总有效序列的91.76%,经与数据库比对,发现了脱水素、抗旱相关转录因子等多个抗旱相关基因。     

Evaluation and variation in response to infection with Puccinia striiformis and Puccinia recondita of local wheat landraces

The purpose of this study was to identify the species of local landraces of wheat (Triticum spp.), held in the Israel Gene Bank, to evaluate them for basic characters and to assess their response to infection by two rust fungi under artificial inoculation conditions. One-hundred-thirty one seed samples were collected from local or Beduin farmers during 1978–1981 throughout the Galilee, Mt. Gilboa. Judean Desert and the south Negev. The samples were collected and stored in the Israel Gene Bank without any characterization or evaluation. Each accession was planted in a 1 m row at Bet Dagan and grown under favorable conditions for plant growth and rust development. Determination of the species, data of plant height, days to heading and reaction of the landraces to artificial inoculation with a composite inoculum of Puccinia recondita and P. striiformis were collected from each row. A small part of the landraces collection consisted of mixed populations of T. durum and T. aestivum plants, where one of the two species was predominant. One-hundred-fourteen and 17 accessions from this collection represented, respectively, Triticum durum and T. aestivum Israel landraces. Large variations were found for all the characters examined. Of the total accessions, 6.5% (8 accessions) and 32% (42 accessions) were resistant, respectively, to yellow- and leaf-rust. It was concluded that the diversified populations of the local landraces of wheat can be used as a source not only for genes affecting basic characters such as plant height and heading date, but also for resistance to leaf rust and yellow rust. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

小麦条锈病区域流行相关性研究初报

小麦条锈病是一种大区流行病害,病菌夏孢子可随气流远程传播,该病的多次流行给中国农业生产造成了严重损失。选择甘肃天水、四川马尔康、陕西汉中、西安、河南郑州,根据各地1988—2000年小麦条锈病病情数据和每年3月1日-5月31日降雨量、相对湿度、最大风向、平均风速、最高气温、最低气温等地面气象观测资料,采用主成分分析和判别分析方法,初步明确了天水的病害发生流行对其他区域的影响,证明了天水小麦条锈病的发生和流行对马尔康和郑州有相当大的影响,而与汉中、西安的相关性不高。研究结果对于探明小麦条锈病大区流行规律,实现对其宏观管理和超长期预测具有一定的意义。     

彩叶草叶片cDNA文库的构建与分析

用植物(叶)总RNA抽提试剂盒提取彩叶草红色品种顶部叶片总RNA,用SMART cDNA Library Construction Kit构建cDNA文库。经测定原始文库滴度为1.2×106 pfu/ml,扩增总文库滴度为6.7×109 pfu/ml,重组率达到98%,插入片段在0.5 kb到2 kb之间,1 kb以上的占60%。通过PCR检测,从总文库中检测到了彩叶草CHS、DFR 及ANS基因的特异片段。各项指标都表明,已获得较高质量的cDNA文库,为彩叶草叶色基因的分离克隆,彩叶草类黄酮类色素合成的分子调控的研究奠定了基础。     

紫杆柽柳cDNA文库构建与硫氧还蛋白基因的克隆

以NaHCO3胁迫的紫杆柽柳(Tamarixandrossowii)为材料建立了cDNA文库。经检测,文库的初始滴度为5.7×105pfu,重组率为96%,插入片段的长度在0.3~3.0kb之间,平均长度为1.2kb,扩增后文库的滴度为4.0×109pfu/ml。对文库克隆进行随机测序,获得了紫杆柽柳的硫氧还蛋白(Thioredoxin)基因序列。生物信息学分析表明获得的硫氧还蛋白基因全长683bp,其中5'非翻译区长56bp,3'非翻译区长204bp,开放读码框长423bp,编码140个氨基酸,蛋白的分子量为15.1kD,理论等电点为5.59,其氨基酸序列中具有硫氧还蛋白的保守活性位点“WCGPC”序列,Clustal分析表明该硫氧还蛋白与蓖麻(Ricinuscommunis)的硫氧还蛋白氨基酸序列同源性高,达65%。本研究构建的cDNA文库为柽柳基因克隆和系统研究柽柳抗逆分子机理奠定了基础。