神经退行性疾病转基因猴模型的构建及相关技术体系建立

非人灵长类动物因与人有最近亲缘关系而成为研究人类生命领域最高级模式动物。本研究采用慢病毒载体技术结合胚胎工程技术,拟建立一套高效简便转基因猴制作技术体系,建立小脑共济失调转基因猴模型,为该病研究提供最为理想动物模型,同时为建立其他疾病转基因猴模型提供技术路线。利用卵泡浆内单精子显微注射技术(Introeytoplasmiesperm injection,ICSI)技术总共构建88个体外受精胚胎,经过体外培养共计32枚发育到原核期并进行病毒注射后移入7只受体猴输卵管内。B超妊娠检测,怀孕3只,其中:1只未能发育到期中间流产,1只发育到期生1死胎,1只顺产生1只活试管猴,经过人工喂养奶粉后健康存活,但经检测转基因为阴性。本研究虽然未能通过病毒注射获得阳性转基因猴,但对食蟹猴(Macaca fascicularis)超数排卵及B超监测卵泡发育技术、卵母细胞回收及体外成熟培养技术、电刺激采精及精子获能技术、食蟹猴体外受精技术和胚胎体外培养技术以及胚胎移植等技术体系进行多次探索和优化,并成功建立相关技术平台,将为后续利用试管猴技术结合高效的TALEN和CRISPR/Cas9等基因编辑工具获得各种疾病模型奠定基础。     

转基因畜禽的研究进展

转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物.自Mintz等(1979)将猴腺病毒伴随病毒(SV40)DNA导入小鼠早期胚胎的囊胚腔,得到了第一个承载有人工导入外源基因的嵌合体小鼠以来,在短短的十多年里,国内外关于转基因的研究渗透到了生物学的各个领域,为许多基因研究提供了大量宝贵的资料[1].     

跨膜蛋白66生物信息学分析及其突变体转基因小鼠构建

跨膜蛋白66(TMEM66)是与细胞凋亡以及癌症发生密切相关的重要功能基因,为了在个体水平研究其生物学功能,我们进行了TMEM66基因突变体(TMEM66V)转基因小鼠的构建。本研究通过原核注射法进行转基因操作,将获得的312个受精卵移植到13只代孕母鼠中,运用PCR、Southern blotting对出生的小鼠进行转基因鉴定,对于转基因阳性小鼠通过传代试验研究外源基因是否稳定整合,并通过反向PCR方法研究外源基因的整合方式。结果显示在出生的55只小鼠中有6只为转基因阳性,其中3只转基因小鼠可以稳定传代,表明这些小鼠中外源基因发生了稳定整合。反向PCR检测结果发现外源片段是以串联重复的方式整合到转基因小鼠的基因组中。本研究成功构建了TMEM66基因突变体转基因小鼠,为进一步研究TMEM66基因的功能奠定了基础。     

转基因动物应用及现存问题探讨

利用转基因技术(transgenic technology)使外源基因与动物本身的基因整合在一起,并随细胞的分裂而增殖,最终得以表达,这样培养出的动物即称为转基因动物(transgeni canimal)。如果外来基因能稳定地遗传给后代,就会形成转基因动物系。转基因动物的研究始于20世纪80年代,Gordon等采用原核显微注射法向小鼠胚胎注射纯化了的DNA(猴肾病毒-疱疹病毒胸腺激酶基因SV4启动子克隆到PBR322),从而得到第一例转基因小鼠,     

转基因小鼠在麻疹病毒研究中的应用

麻疹病毒(MV)只感染人和一些灵长类动物,由于没有敏感的小动物模型,使其致病机制的研究受到限制。CD46和SLAM是MV细胞受体,CD46转基因小鼠NSE-CD46和YAC-CD46用于研究MV在神经系统中的分布、传播等病理作用,也用于研究MV的抑制剂和减毒活疫苗。转基因小鼠为MV感染致病机理的研究提供了一定的体内实验证据。     

中国3种旧大陆猴TRIMCyp嵌合基因的存在状况及基因特性研究

本研究应用PCR方法检测了中国3种旧大陆猴(恒河猴、食蟹猴及藏酋猴)的TRIMCyp嵌合基因型个体的存在状况,并首次发现携带TRIMCyp嵌合基因中国品系恒河猴。同时本实验应用建立RT-PCR方法在mRNA水平上进一步检测了恒河猴和食蟹猴的TRIMCyp嵌合基因序列和特性。其编码的融合蛋白TRIMCyp丧失了对HIV-1复制的限制功能,推测具有该基因型旧大陆猴对HIV-1更易感,可用于建立新型的艾滋病非人灵长类动物模型。本研究结果将促进逆转录病毒跨种间传播的研究和建立HIV-1易感非人灵长类动物模型。     

鼻咽癌来源LMP1转基因小鼠的制备

本试验利用显微注射技术，制备鼻咽癌来源LMP1基因（N-LMP1）的转基因小鼠。共获得15只首建鼠，经小鼠尾部组织DNA分析，PCR法证明其中两只小鼠有N-LMP1基因扩增带，Southern杂交显示PCR阳性小鼠有特异的杂交信号，整合率为13.3%，N-LMP1转基因小鼠的建立为研究N-LMP1转基因小鼠的建立为研究N-LMP1在鼻咽癌变过程中的作用机制奠定了基础。     

近交系高表达HBV转基因小鼠的建立及表达传代稳定性

将纯化的高表达 1.3copy HBV全基因 ,通过原核显微注射方法 ,建立了近交系 ( Balb/ c)高表达 HBV转基因小鼠模型 ,以血清 HBs Ag为检测指标 ,对该转基因鼠 HBV基因持续表达水平和数代遗传稳定性进行了研究。结果 ,获高表达 HBV( 1.3copy)转基因 Balb/ c小鼠 Founder 2只 ,用回交传代方法 ,本 HBV转基因小鼠已稳定传至第 8代 ,每代转基因鼠阳性率平均保持在 4 4 .6 7% ,性别对 HBV转基因小鼠总体阳性率有影响 ,雄性小鼠的阳性率 ( 4 4.15 % )明显高于雌性小鼠 ( 4 2 .2 6 % ) ( P<0 .0 5 ) ;血清表达 HBs Ag水平较稳定 ,平均为 ( 85 3.2 8± 2 35 .4 3)μg/ L ,雌雄小鼠之间表达水平没有明显差异。     

丰容对圈养东黑白疣猴行为的影响

笔者对红山森林动物园灵长2馆和3馆现有的1只成年雄性东黑白疣猴、4只成年雌性东黑白疣猴、3只亚成年东黑白疣猴(2015年繁殖的3只亚成年疣猴均为雌性,2016年繁殖的2只亚成年疣猴为1雌1雄未做观察)进行行为观察。为了提高动物福利,为野生动物提供优良的生活环境,最大限度地利用笼舍,笔者对疣猴的笼舍进行了丰容。本文对此次丰容进行了介绍、探讨和总结,希望对相关圈养灵长类动物的丰容提供帮助。     

艾滋病疫苗及治疗的新靶点

来自美国加州大学旧金山分校的研究人员在一项研究中发现,在感染猴免疫缺陷病毒(SIV)后,肠道中拥有更多某种类型免疫细胞的恒河猴相比于其他猴,其血液中病毒水平要低得多,且在感染6个月后能够更好地控制病毒。SIV是一种感染灵长类动物的逆转录病毒,SIV病毒株跨越到人类导致了人类免疫缺陷病毒(HIV)的演     

人白细胞抗原-B27(HLA-B27)转基因小鼠的建立

人白细胞抗原 -B2 7( HLA-B2 7)与强直性脊柱炎 ( AS)有强相关性 ,为构建 AS动物模型以用于其发病机理和治疗的研究 ,将 HLA-B2 7基因与 β2 -微球蛋白基因等量混合后 ,利用显微注射技术注入昆明小鼠的1 3 70枚受精卵中 ,再将注射后存活的 1 0 50枚卵移植到 58只假孕母鼠体内 ,产仔 97只。PCR检测上述 97只转基因仔鼠 ,结果 2 7只为阳性。Southern blotting检测上述 2 7份 PCR阳性小鼠的基因组 ,结果 8只为阳性 ,表明已成功地建立了 HLA-B2 7转基因小鼠     

转基因动物及其在畜牧生产中的应用

转基因动物的研究最初是在小鼠体内进行的。转基因小鼠的成功大约经 9年的研究。从 2 0世纪 80年代初这项技术诞生的那天起 ,就在改良畜禽生产性状 ,提高畜禽抗病力及利用转基因畜禽生产非常规畜产品 (如人类药用PRO) ,有关癌基因机制的分析 ,免疫机制的研究以及对遗传疾病的了解等方面显示了广阔的应用前景。1　什么是转基因动物转基因动物是指以实验方法导入外源基因 ,在染色体组内稳定整合并遗传给后一代动物。转基因动物的生产步骤包括以下五步 :第一步 :目的基因的选择 ;第二步 :将重组基因导入受精卵 ,基因导入可采用显微注射法、反…     

体内A型精原细胞介导转MxA基因小鼠的制备

本研究旨在探讨内源性A型精原干细胞介导法制备转抗黏液病毒基因A(Myxovirus resistance gene,MxA)基因小鼠的可行性。将pcDNA-MxA质粒和新型转染试剂ExGen500混悬后分5点注射至7日龄的ICR公鼠两侧睾丸组织内,睾丸内基因注射(testis gene transfer,TGT)鼠在性成熟后的不同阶段(6、12及24周龄)与正常母鼠交配,检测后代外源基因整合及表达情况,选取表达MxA基因的小鼠进行H5N1亚型禽流感病毒攻毒试验,观察小鼠的健康状况并观察肺及气管的组织病变情况。结果表明,TGT鼠和正常母鼠交配后能稳定产生转基因后代小鼠,2只TGT鼠在6、12及24周龄交配后代整合率分别为11.11%(2/18)、11.76%(2/17)、11.54%(3/26)及13.64%(3/22)、13.33%(2/15)、11.76%(2/17)。2只TGT鼠后代外源基因平均整合率分别为11.47%及12.91%,之间差异不显著(P0.05)。RT-PCR检测表明,MxA基因整合小鼠中有21.43%(3/22)测到MxA的表达;所制备的MxA表达鼠H5N1亚型禽流感病毒攻毒后全身症状、肺及气管病变程度明显比正常鼠轻。试验结果表明体内精原干细胞介导的转基因方法是一种可行的、具有很大应用前景的转基因方法,制备的转MxA基因小鼠对H5N1亚型禽流感病毒具有一定的抵抗力。     

家蚕转基因方法及研究进展

转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在动物基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。 1 980年Ｇｏｒｄｏｎ等将胸腺激酶 (ＴＫ)基因和ＳＶ40病毒基因片段的融合基因通过微注射技术导入到小鼠的受精卵中 ,发现ＴＫ基因整合到了小鼠的染色体中 ;随后相继的类似研究发现整合到小鼠染色体中的外源基因能够遗传给后代。 1 982年Ｐａｌｍｉｔｅｒ等采用转基因技术培育出了携带有人生长激素 (ｈＧＨ)的转基因小鼠 ,由于小鼠具有很快的生长速度 ,个体较正常小鼠大二倍以上 ,成了当时轰动一时的“巨型小鼠”。超级小鼠的成功 ,标志着转基因动…     

β干扰素转基因小鼠的建立和特性研究

选择ICR小鼠为受试动物,应用显微注射仪,将线状人β干扰素基因,按2940～10000拷贝,1～3pL的剂量注射到供体受精卵的雄前核,然后移植到假孕受体的输卵管。实验先后注射了301个受精卵,移植到20只假孕受体,其中5只妊娠,产仔25只。从所获得的25只亲代小鼠的尾组织提取DNA,用内切酶BamHI消化,以[α-~(32)P]-dCTP标记的上述外源基因为特异性核酸探针,应用DNA印迹法检测这些小鼠DNA内外源基因的整合状况.结果表明,亲代小鼠中有人β干扰素基因重组子的转基因小鼠,杂交带在6.8kb位置。应用上述同样方法对亲代转基因小鼠的子1代组织DNA检测发现,绝大多数小鼠的标本除见到1条1.8kb人β干扰素基因的较弱杂交带外,还有数条5.0kb以上强弱各异的杂交带,表明这种外源基因不仅整合到了亲代小鼠的遗传物质内,而且可经垂直方式传给子代。人β干扰素基因的鼠体水平表达检测发现,1只子1代转基因小鼠的肿瘤组织浸出液中含有人β干扰素,滴度达160U/mL,表明整合在小鼠DNA内的人β干扰素外源基因不经诱导而有一定表达。     

牛FABP3转基因小鼠的遗传及表达特性研究

旨在研究和分析牛FABP3基因在小鼠体内遗传和表达特性,对培育优质高产转基因肉牛新品种具有重要意义。本研究利用前期获得的4只FABP3转基因小鼠,通过制定的4组交配方案获得子代小鼠,并利用PCR、实时荧光定量PCR和组织原位表达技术对转基因牛FABP3基因小鼠的子代遗传特征,以及FABP3基因在G0代和G1代小鼠心、肝、肾、骨骼肌组织的表达情况进行了检测。RT-PCR检测结果表明,在G0代转基因小鼠中,牛FABP3基因能够表达;牛FABP3基因在转基因小鼠中可以遗传,G1代转基因小鼠平均阳性率达68.4%;相对定量PCR结果表明,转基因小鼠总FABP3基因在G1代小鼠心肌和骨骼肌中表达量相对于阴性个体有不同程度的增加;组织原位检测表明,在G0代个体中表达量较高,G1代个体中虽能看到绿色荧光,但略有降低。本研究表明,牛FABP3基因存在于小鼠基因组中,并能够被表达,且可以遗传给后代,这为后期进一步研究牛FABP3基因对小鼠骨骼肌脂肪含量的影响奠定坚实基础。     

fat-1转基因小鼠脂类代谢相关基因的表达分析

为了分析fat-1转基因小鼠对3个脂类代谢关键基因(FASN、PPAR、LPL)的组织表达特性,研究利用实时荧光定量PCR技术检测FASN、PPAR和LPL在心脏、肝脏、骨骼肌组织中的表达情况。结果表明:FASN、PPAR、LPL基因在转基因小鼠心脏、肝脏、骨骼肌的表达情况有很大差异。其中PPAR和LPL基因在转基因小鼠肝脏组织中极显著升高(P0.01),而在心脏、骨骼肌的表达量显著或极显著下降(P0.01或P0.05);FASN基因只在骨骼肌中极显著下降(P0.01),而在心脏和肝脏中没有发生明显变化(P0.05)。说明fat-1基因能够在机体脂类代谢的调控过程中发挥重要的作用。     

桂林恒河猴感染人芽囊原虫的调查研究

人芽囊原虫(Blastocystis hominis)是一种寄生在人类和灵长类动物肠道内的人畜共患的原虫,又称人酵母菌,主要分布于热带地区和发展中国家。我国人群感染率在0.06%～17.02%之间[1],感染者可出现腹痛、腹泻等消化道症状。广州地区灵长类动物中感染率为16.7%～78.9%[2]。为了解桂林恒河猴人芽     

集约化饲养条件下实验猴寄生虫感染状况调查

<正>非人灵长类动物和人亲缘关系接近,基因同源性高达75%~98.5%,是人类疾病理想的动物模型。近年来,随着生物医药的快速发展,对高品质实验猴的需求迅猛增加,刺激实验猴养殖业蓬勃发展。目前,我国已成为实验猴资源和出口大国,人工养殖实验猴规模居世界之首。随着实验猴养殖的集约化程度提高,寄生虫感染已成为困扰行业发展的一个技术难题。多年来,国内对实验猴寄生虫感染情况已有报道[1-3],但至今尚无     

Wip1过表达转基因小鼠模型的制备与鉴定

本研究旨在构建Wip1过表达转基因小鼠,并对Wip1过表达转基因小鼠进行RNA水平上的筛选,为研究动脉粥样硬化的发生机制提供一种动物模型。通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）获得小鼠组织的cDNA,并以其为模板进行PCR扩增,对扩增片段进行胶回收,然后进行扩增片段和空载体的双酶切,将酶切后胶回收得到的Wip1基因全长与载体pcDNA3.1（+）进行连接,获得Wip1-pcDNA3.1（+）过表达载体,最终得到Wip1过表达转基因原代小鼠,并利用Southern blotting方法和实时荧光定量PCR方法对小鼠进行鉴定筛选。试验获得Wip1过表达转基因原代小鼠30只,利用Southern blotting方法鉴定出阳性小鼠11只,阳性率为36.67%,实时荧光定量PCR筛选Wip1过表达转基因小鼠阳性率为32.84%。以上结果表明,试验成功构建了Wip1-pcDNA3.1（+）过表达载体,并且经过Wip1基因在小鼠组织DNA和RNA水平上的鉴定筛选,成功获得了Wip1过表达转基因小鼠。