红豆杉香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因克隆分析

20碳单位的香叶基香叶基焦磷酸是紫杉醇生物合成的直接前体,它由香叶基香叶基焦磷酸合成酶催化生成。采用RT-PCR技术从高原植物西藏红豆杉中克隆了编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因,命名为TwGGPPS（GenBank登录号：DQ364604）。该基因编码区长为1182bp,编码393个氨基酸的多肽;生物信息学分析表明TwGGPPS定位于质体,在其氨基端具有长为18个氨基酸的质体转运肽;TwGGPPS属于异戊烯基转运酶家族,具有该酶家族特有的2个天冬氨酸富集基序;分子系统进化分析表明植物的GGPPS分为被子植物和裸子植物2种类型,TwGGPPS属于裸子植物类型的GGPPS;对TwGGPPS的蛋白质结构模拟分析结果表明,TwGGPPS由大量的α-螺旋通过随机卷曲连接而成,这些α-螺旋环绕形成一个袋状空腔,其空腔口部为底物结合与碳链延伸的活性部位。对TwGGPPS基因组结构的分析表明该基因没有内含子。该基因的克隆和分析为实现紫杉醇的基因工程提供了一个重要的基因和作用靶点。     

汉中黑稻花青素合成酶基因克隆及生物信息学分析

花青素合成酶(Anthocyanidin Synthase,ANS)是植物花青苷生物合成途径末端的关键酶,催化无色花色素到有色花色素的转变。为研究汉中黑稻的ANS多样性及起源,采用克隆测序的方法对汉中7种品种黑稻的ANS基因序列进行分析。采用生物信息学方法,对该基因序列进行对比,并构建系统进化树和同源树,对其编码蛋白从基本理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、信号肽、导肽、二级结构和三级结构等方面进行预测和分析。结果表明7种汉中黑稻存在黑稻1、黑稻2两种基因序列,开放阅读框均为1 128bp,编码375个氨基酸。进化树表明黑稻1和黑稻2与籼稻、粳稻、浦竹仔、小麦等禾本科植物较近的亲缘关系,同源性分析表明黑稻1和黑稻2与籼稻等植物的ANS具有高度的同源性。氨基酸序列比对发现黑稻1和黑稻2仅有326位氨基酸不同。黑稻1的ANS蛋白含有2OG-FeⅡ_Oxy加氧酶的保守结构域。ANS蛋白三级结构预测,发现黑稻1和籼稻存在差异,推测ANS可能是花青苷合成中起重要作用的关键酶。这些结果表明ANS基因是一个古老的基因,可以作为种属鉴定的参考基因,可能是影响黑稻花青苷生物合成的主要基因之一。     

基于转录组信息的艾纳香牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(BbGGPS)的克隆及序列分析

采用RT-PCR和RACE(Rapid amplification of c DNA ends)技术,从艾纳香(Blumea balsamifera L·DC)的叶片中克隆到二萜化合物合成的关键酶牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Bb GGPS)基因。结果显示:Bb GGPS基因的c DNA全长1475 bp,包含开放阅读框(ORF)1002 bp,编码334个氨基酸;亚细胞结构定位于叶绿体,既非膜蛋白也非分泌性蛋白。疏水性分析显示,Bb GGPS是亲水性蛋白。同源性比对结果显示,Bb GGPS蛋白与其他植物中GGPS蛋白具有高度的相似性。系统发育分析表明,所有序列被聚为5大类,Bb GGPS与菊科植物刺菜蓟聚(Cynara cardunculus var)为一类,表明与其亲缘关系最近。     

马铃薯ACS基因克隆及生物信息学分析

1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxlic acid synthetase,ACS)是乙烯合成途径中的限速酶,为明确其基因结构为目标,根据已报道的基因序列信息,用马铃薯栽培品种‘甘农薯2号’试管苗作为材料,提取叶片总RNA,设计基因特异性引物,利用RT-PCR克隆出ACS基因,并对基因及其蛋白进行了生物信息学分析.结果表明:ACS基因CDS区长1 461bp,编码486个氨基酸,ACS蛋白分子量约为55kU,PI 6.76;具有12个alpha螺旋区域,22个beta片层区,32个转角和23个自由卷曲区;具有39个疏水区和41个亲水区;同源性分析表明ACS基因在高等植物中保守性较高.     

荸荠淀粉合成酶AGPase的基因克隆及表达分析

[目的]克隆荸荠ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)小亚基基因EdAPS1的cDNA序列,并分析其序列特征及其在荸荠不同组织和球茎发育过程中的表达情况,为研究荸荠淀粉生物合成机制提供理论依据.[方法]通过RT-PCR技术从荸荠球茎中克隆EdAPS1基因的cDNA序列,采用生物信息学方法对其序列和所编码的蛋白进行预测...     

橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析

【目的】法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase,FPS）是天然橡胶生物合成的甲羟戊酸途径中的关键酶,获得橡胶草FPS基因并转化野生橡胶草,为研究FPS基因在橡胶草橡胶生物合成过程中的调控作用奠定基础。【方法】采用同源克隆的方法获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列,并对该基因进行生物信息学分析。对橡胶草和其他18种不同高等植物的FPS氨基酸序列进行多序列比对及进化树分析。提取橡胶草不同组织：根、叶柄、叶、花梗、花和种子RNA,对FPS基因进行组织特异性表达分析,并对不同生长时期的橡胶草FPS表达量进行比较,分析橡胶草生长过程中FPS的调节作用。将该基因在野生型橡胶草中过表达,对得到的转基因和野生型植株FPS相对表达水平进行分析,比较转基因和野生型植株橡胶含量的变化。碱煮法提取转基因和野生型橡胶草根部的橡胶,测定橡胶含量。【结果】获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列,命名为TKFPS（GenBank登录号 KJ558350.1）。序列分析表明该基因包含1个1 029 bp的完整开放阅读框,编码342个氨基酸,编码的蛋白质相对分子量为39.35 kD,理论等电点（pI）为5.41,平均疏水性为-0.242。多序列比对结果表明,橡胶草FPS氨基酸序列含有高等植物FPS基因的5个保守结构域,系统发育分析结果显示新疆野生橡胶草与蒲公英处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,TKFPS 蛋白无跨膜区域,可能定位于细胞质中发挥功能。组织特异性分析结果表明TKFPS在橡胶草的根、叶柄、叶、花梗、花、种子中均有表达,其中,在叶中表达量最高,根次之,在花中表达量最低。重组子pCAMBIA2300-35S-TKFPS经农杆菌介导法转化野生橡胶草叶盘,得到6株转基因植株。实时荧光定量PCR检测发现,与野生型相比,转基因株系FPS的相对表达量水平明显升高,6株转基因株系TKFPS表达量平均约是野生型的2.8倍。橡胶含量测定结果表明6株转基因株系的根中橡胶质量分数平均比野生型增加了3.92%。【结论】成功从橡胶草中克隆获得TKFPS,并转化野生橡胶草得到转TKFPS的高产橡胶草株系,FPS在橡胶草产胶过程中发挥重要功能。     

木薯蔗糖磷酸合成酶基因克隆及组织表达分析

通过同源克隆从木薯品种辐选01(RS01)中获得SPS基因保守序列,利用RACE扩增技术获得全长cDNA序列并使用相关软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR分析木薯SPS基因在不同时期、不同组织中的相对表达量。结果表明:克隆获得的木薯SPS基因cDNA序列全长3 857bp,开放阅读框(ORF)长3 228bp,编码1 076个氨基酸,命名为MeSPS(GenBank登录号KX822780);同源性分析表明,MeSPS基因与麻风树、蓖麻和荔枝的SPS基因序列同源性较高,分别为89%、89%和87%;其氨基酸序列与其他植物SPS氨基酸同源性在77%~92%;经qRT-PCR分析结果表明,MeSPS在苗期的相对表达量较高;在同一生长时期,MeSPS在叶片中相对表达量高于茎段和块根。     

滇龙胆异戊烯基焦磷酸异构酶 基因的克隆与表达分析

根据药用植物滇龙胆转录组异戊烯基焦磷酸异构酶基因(Gr IDI)序列,应用RT-PCR技术从滇龙胆幼叶克隆该基因开放阅读框(ORF),获得Gr IDI1和Gr IDI2两条序列,其Gen Bank登录号分别为KM879183和KM879184。生物信息学分析表明Gr IDI1基因ORF长708 bp,编码235氨基酸;Gr IDI1蛋白相对分子质量为27.10 ku,理论p I为5.01。该蛋白属于I型异戊烯基焦磷酸异构酶家族成员,可能定位于细胞质。该蛋白无信号肽,为亲水稳定蛋白,主要由α-螺旋(45.53%)和无规则卷曲(39.57%)构成。该蛋白具有其他IDI蛋白的活性位点、金属结合位点和保守结构域(NUDIX羟化酶结构域)。Gr IDI1蛋白与黄龙胆Gl IDI蛋白亲缘关系最近。原核表达结果表明,Gr IDI1基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为53.11ku,与预期大小一致。组织特异性表达分析结果表明Gr IDI1基因主要在叶中表达。     

菘蓝查尔酮合成酶基因(IiCHS)的克隆及其生物信息学分析

类黄酮是植物体内一类重要的次生代谢产物,对植物的生长发育有着重要的调节作用。查尔酮合成酶是植物类黄酮合成途径的第一个关键酶,在调控类黄酮的生物合成中起着决定作用。本研究采用RTPCR方法扩增得到一条菘蓝查尔酮合成酶家族蛋白基因,命名为IiCHS,全长1 273 bp,包含一个1 194 bp的ORF,编码397个氨基酸,分析其编码的蛋白质序列显示其属于查尔酮合成酶家族蛋白,定位于胞质中。该研究不仅有助于分析查尔酮合酶基因的功能,而且还为进一步利用该基因资源改良菘蓝品质奠定了理论基础。     

前纳豆激酶原基因温控型表达载体的构建及其表达条件的研究

纳豆激酶(nattokinase,简称NK)是一种枯草芽孢杆菌蛋白激酶,该酶具有强烈溶栓活性.本研究从枯草芽胞杆菌中分离纯化得到基因组DNA作为模板,通过PCR扩增前纳豆激酶原基因,将其克隆到质粒pUC19中,构建重组克隆质粒pNK并转化大肠杆菌DH5α,测序结果表明,所克隆片段全长1152bp,与GenBank中已报道序列同源性达100％.将目的基因片段与表达载体pBV220连接,构建重组表达质粒pBNK,转化大肠杆菌HB101.采用不同诱导时间、不同诱导温度(40℃、42℃和44℃)诱导表达,结果发现转化菌pBNK6-HB101在LB培养基中经30℃培养,42℃诱导表达7小时目的产物表达量达到最大,约占菌体总蛋白的25.35％,转化菌pBNK6-HB101在不同的培养基(LB和TB)中培养,无明显差异.     

荣昌猪TYP基因克隆及其序列分析

实验根据人、牛的酪氨酸酶(TYR，tyrosinase)基因序列设计了3对引物，扩增出猪的酪氨酸酶基因外显子2，3，4序列，其长度分别为210，135，182bp。对其进行了克隆测序，序列被GenBank收录，登录号分别为：AY236997，AY279998，AY242973。与人、牛、鼠的酪氨酸酶基因序列比对结果显示，TYR基因该区段在人、牛、鼠、猪上极其保守。     

奶牛γ-干扰素基因克隆及其在大肠杆菌中表达

根据奶牛γ干扰素 ( Bov IFN-γ)基因的 c DNA序列设计 1对引物 ,应用一步法逆转录聚合酶链式反应 ( RT-PCR)技术从奶牛脾淋巴细胞的总 RNA中扩增出特异性片段。将 RT-PCR产物克隆到 Pucm-T载体中 ,经过限制性酶切分析、测序证实扩增得到的 Bov IFN-γ基因序列正确。将该基因片段切下并克隆到大肠杆菌表达载体 PGEX-6P-1谷光甘肽 S 转移酶基因的下游 ,经 IPTG诱导后 ,表达出 42 ku的融合蛋白 ,薄层扫描测定可溶性融合蛋白表达量约占菌体可溶性总蛋白的 2 5 %。通过细胞病变抑制试验证实 ,融合蛋白具有较好的生物学活性 ,在牛肾细胞上抑制水泡性口炎病毒的活性可达到 1 63 84U· mg- 1 ,有望成为预防和控制奶牛疾病的新产品。     

荣昌猪TYP基因克隆及其序列分析

实验根据人、牛的酪氨酸酶(TYR,tyrosinase)基因序列设计了3对引物,扩增出猪的酪氨酸酶基因外显子2,3,4序列,其长度分别为210,135,182 bp.对其进行了克隆测序,序列被GenBank收录,登录号分别为:AY 236997,AY279998,AY 242973.与人、牛、鼠的酪氨酸酶基因序列比对结果显示,TYR基因该区段在人、牛、鼠、猪上极其保守.     

玉米ZmAATP基因的克隆及遗传转化载体的构建

ATP-ADP转运蛋白(AATP)是质体内外能量供应和物质交换的重要载体,可以通过调节质体内外ATP浓度来影响质体内的合成代谢。本研究克隆了玉米ZmAATP基因,进化树分析显示ZmAATP蛋白与ATPase亲缘关系较近。进一步研发发现,授粉后随着玉米籽粒的发育和淀粉的积累,ZmAATP基因的表达量逐渐提高。另外,我们分别构建了由组成型启动子(Ubi)和胚乳特异型启动子(GluAI)驱动的ZmAATP基因的过量表达载体,为进一步研究该基因在玉米中的生物学功能奠定了基础。     

防御素基因的化学合成及克隆

将防御素基因分成４个寡聚核苷酸片段，采用固相亚磷酰胺法在ＤＮＡ合成仪上化学合成。片段２和４分别用Ｔ＿４多聚核苷酸激酶将５′端磷酸化，４个片段等量混合，用Ｔ＿４ＤＮＡ连接酶连成一个１０９ｂｐ的双股ＤＮＡ片段，其两侧为ＢａｍＨＩ和ＳａｌⅠ粘性末端。把它与经上述双酶切的质粒ｐＵＣ１９连接，转化大肠杆菌ＤＨＳα。转化株经含Ｘｇａｌ青霉素平板初筛，质粒酶切分析以及ＰＣＲ专一性扩增，证实已获得完整的防御素基因克隆。为进一步表达防御素提供了材料．     

鸡贫血病毒衣壳蛋白基因的PCR扩增和克隆

通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增鸡贫血病毒（ＣＡＶ）衣壳蛋白基因（１．４ｋｂ），并将此基因克隆进ｐＵＣ－１８载体中。通过原位杂交、酶切分析、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交及其标记成探针对ＣＡＶ基因组的特异性反应等试验证实所获得的克隆是含有ＣＡＶ衣壳蛋白基因的重组质粒克隆。此工作为下一步ＣＡＶ衣壳蛋白体外表达的研究奠定了基础     

IBRV内蒙古分离株gD基因的分子克隆与序列分析

根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒( GenBank NC_001847) gD基因序列设计1对特异性引物,采用PCR方法扩增出内蒙古分离株gD基因的cDNA,重组到PMD19 -T载体中,并进行克隆及序列测定.经限制性内切酶谱分析和序列分析,证明所克隆的cDNA为gD基因.该基因片段长1 559bp,包含1个由1 251bp组成的完整开放阅读框(ORF),共编码417个氨基酸.序列比较和系统进化树分析结果显示:内蒙古分离株gD基因与GenBank上已发表的其它分离株相比,核苷酸同源性在99.1％～99.9％之间,其推导的氨基酸同源性在90..6％～99.8％之间,在系统进化树中内蒙分离株与AJ004801株亲缘关系较近,属于同1个分支.生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白具有亲水性,有很强的抗原性,有3个潜在糖基化位点,可能存在2个蛋白激酶C磷酸化位点,存在4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点.     

马立克氏病病毒（MDV）B抗原基因的克隆及鉴定

将ＭＤＶＧＡ株ＢａｍＨＩ基因文库中含Ｉ３片段的质粒ｐＡＣＹＣ１８４和Ｋ３片段的质粒ｐＨＣ７９扩增，用碱裂解法抽提质粒后，利用相应的限制性内切酶切出目的基因片段，连接到合适的载体上，构建了完整的ＭＤＶＢ抗原基因克隆载体。通过内切酶分析，地高辛（ＤＩＧ）－探针原位杂交，ＤＮＡ序列预测，确认克隆的Ｂ抗原基因正确。