热应激对剑尾鱼HSP70家族两成员基因表达的影响

采用RT-PCR方法扩增实验动物剑尾鱼（Xiphopohorus helleri）纯系RR-B的HSP70家族两个成员的eDNA片段，并将其克隆到PMD18-T载体中测序，将测序结果与GenBank中的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行同源性比较。同时利用RT-PCR半定量方法研究热应激时两个成员在剑尾鱼组织中的表达。通过克隆获得了剑尾鱼的HSP70家族两个新成员的cDNA片段，两序列均包含HSP70家族的特征性签名序列和热休克蛋白的定位序列；通过对克隆片段与已发表的青锵（Oryzias latipes）等鱼类HSP70的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列同源性比较，发现核苷酸序列同源性较高，成员一和成员二分别为85％-89％和82％-99％；氨基酸序列同源性更高，成员一和成员二分别为97％-99％和93％-99％。一般条件下，两成员在剑尾鱼肝脏、脾脏、肾脏和心脏中不表达，但热应激能刺激成员一在剑尾鱼脾脏中表达，成员二在肝脏、脾脏、肾脏和心脏中强烈表达，并可能在参与热应激保护方面起更大作用。     

条斑紫菜HSP90基因的克隆与表达分析

为了研究HSP90在条斑紫菜胁迫耐受中的作用,克隆了条斑紫菜HSP90基因(命名为PyHSP90),采用定量RT-PCR研究了其表达规律。PyHSP90基因包含一个长2274nt的完整开放阅读框,编码757个氨基酸。PyHSP90蛋白定位于细胞质中,具有HSP90蛋白家族的特征序列和保守结构域,与多种生物的HSP90具有较高的序列一致性。在进化树上条斑紫菜等红藻的HSP90与隐藻的亲缘关系最近,与绿藻和陆生植物亲缘关系较远。低温和高温胁迫都能显著性地诱导条斑紫菜叶状体PyHSP90基因的表达,而且表达量与胁迫程度成正相关;低盐胁迫下PyHSP90基因表达上调;而失水胁迫下PyHSP90基因表达下调。     

热应激对银鲫生化指标和HSP70 mRNA表达的影响

本研究旨在探讨热应激对银鲫(Carassius auratus gibelio)生化指标及肝脏HSP70 mRNA表达的影响,选取平均体重为(72.8±10.1) g的银鲫,分别在热应激前(25℃,对照组)、热应激后(32℃,0 h、2 h、6 h、10 h)和恢复适温后6 h (25℃,恢复组)的条件下,测定机体血浆乳酸(LD)、血浆葡萄糖(Glu)、肝糖原(Gly)、己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)和肝脏HSP70 mRNA表达量变化。研究表明,实验组乳酸含量从热应激开始至恢复期,差异始终不显著(P>0.05);实验组血浆葡萄糖水平在热应激后0 h、2 h、6 h,极显著高于对照组(P<0.01);实验组肝糖原水平在热应激0 h时,极显著高于对照组(P<0.01),其余时间点差异不显著(P>0.05);己糖激酶活力在热应激后2 h,显著高于对照组(P>0.05);丙酮酸激酶活力在热应激后6 h,极显著高于对照组(P<0.01);热应激后2 h,肝脏中HSP70 mRNA表达量达到最高(P<0.01),恢复至适温后,表达量与应激前无差异(P>0.05)。本研究为进一步探究银鲫的高温应激作用机制及调控机理提供参考数据,同时,也为银鲫养殖和育种等生产实践提供相应参考依据。     

大黄素、维生素C及其配伍对团头鲂生长、生理生化指标、抗病原感染以及两种HSP70s mRNA表达的影响

选取1200尾健康的团头鲂,体重为(133.44±2.11)g,随机分成4组,其中1组为对照组,投喂基础日粮(含50.3mg/kg维生素C,以L-抗坏血酸-2-多聚磷酸酯为Vc源),另外3组为试验组,投喂饲料是在基础日粮中分别添加60mg/kg大黄素、700mg/kgVc、60mg/kg大黄素+700mg/kgVc。连续投喂60d后,检测团头鲂生长、肌肉成分、血液和肝脏生化指标以及两种热休克蛋白70s(HSP70s)mRNA的表达水平,并统计团头鲂感染嗜水气单胞菌后的成活率,以综合评价大黄素、高剂量Vc及其配伍对团头鲂的作用效果。结果表明,与对照组相比,大黄素、Vc组显著提高了鱼体增重率和特定生长率,血清中总蛋白(TP)、溶菌酶(LSZ)和碱性磷酸酶(AKP)的水平,肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和诱导型HSP70 mRNA的基础表达水平,降低了饵料系数、死亡率、血清中皮质醇(COR)、甘油三酯(TG)以及肝脏丙二醛(MDA)的含量(P<0.05);配伍组虽然血清中TP、LSZ的含量以及肝脏HSP70 mRNA水平显著升高,肝脏MDA的含量也显著降低(P<0.05),但均未表现出协同增效作用,其它指标与...     

高温胁迫下条斑紫菜叶状体HSP70基因的表达谱分析

采用实时荧光定量RT-PCR技术检测了条斑紫菜叶状体在25℃高温胁迫下PyHSP70-1基因的相对表达量变化。定量分析显示PyHSP70-1基因表达受到高温胁迫的显著诱导。在持续高温胁迫下,PyHSP70-1表达量在8 h时达到最大,此后一直维持在较高水平,且与对照差异显著。在短暂高温胁迫结束后PyHSP70-1表达量最大,随着恢复时间的增加,其mRNA量逐渐减少,在恢复的24 h时间内,mRNA量仍然显著高于对照。结果表明PyHSP70-1是诱导型HSP,受热激诱导表达,在热激胁迫中维持细胞蛋白与膜的稳定,对细胞具有重要的保护作用。     

真蛸热休克蛋白90基因(HSP90)的克隆及表达

为深入了解真蛸热应激响应机制,实验以真蛸的应激蛋白为研究对象,借助同源扩增和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得真蛸热休克蛋白90(HSP90)的cDNA全序列(2 709 bp),它包含119 bp的5’非编码区(untranslated regions,UTR)、454 bp的3’UTR和2 136 bp的开放阅读框(opening reading frame,ORF),ORF共编码711个氨基酸,推算其分子量为81.5 ku,理论等电点为5.09。同源分析显示,所推导的氨基酸序列高度保守,并且含有HSP90家族特有的5个保守信号序列区域。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在所有选取的组织中均有表达,肝组织中表达量最高。     

肌醇对氨氮应激下团头鲂幼鱼免疫的影响

为了研究氨氮应激下肌醇对团头鲂幼鱼免疫的影响,实验选择初均重为(3.40±0.07)g的健康团头鲂幼鱼450尾,随机分为6组,每组3个重复,分别投喂含肌醇0、101.2、202.3、404.8、809.1和1 616.4 mg/kg的精制饲料,实验期为90 d。结果表明:与对照组相比,氨氮应激前,404.8 mg/kg肌醇添加组显著提高了团头鲂幼鱼淋巴细胞百分比、补体3、补体4和血液呼吸爆发活性(P0.05);氨氮应激12 h,404.8和809.1 mg/kg肌醇添加组的血液白细胞、红细胞、淋巴细胞百分比、血红蛋白和血清补体3、补体4水平显著升高(P0.05),皮质醇水平显著降低(P0.05),202.3和404.8 mg/kg肌醇添加组的血细胞呼吸爆发活性显著提高(P0.05);氨氮应激72 h,404.8 mg/kg肌醇添加组的血液白细胞、红细胞、淋巴细胞百分比、血红蛋白、血清补体3和血细胞呼吸爆发活性显著升高(P0.05),皮质醇水平显著下降(P0.05),809.1 mg/kg肌醇添加组的血清补体4水平显著升高(P0.05)。研究表明,饲料中添加适量的肌醇(404.8 mg/kg)即可增强团头鲂幼鱼的免疫力,对团头鲂幼鱼抗氨氮应激起到了一定的保护作用。     

草鱼HSP70基因cDNA部分序列克隆及其组织表达差异

根据鲤热休克蛋白70(Heat shock protein,HSP70)序列(AY120894)设计并合成一对引物,以草鱼(Cteno-pharyngodon idella)肝胰脏组织总RNA为模板,RT-PCR扩增获得草鱼HSP70基因cDNA部分序列,并进行了组织表达差异性研究。结果显示:所获为序列为480 bp,获得GeneBank登陆号为FJ483832。序列测序结果显示,HSP70扩增序列与鲤、斑马鱼、鲋的同源性为:93%、91%、93%。另外,所获序列HSP70在草鱼脂肪、肌肉、肠、脑、粘液、性腺、鳔、肝胰脏、心脏、脾脏、鳃、鳍12个组织的表达存在差异,HSP70在草鱼这12个组织中均检测到表达,其中在鳍中表达最高,极显著高于其他组织(P<0.01);在鳔中表达次之,且与脑、心脏、性腺中表达差异不显著;在粘液中表达最低。     

脊尾白虾热休克蛋白HSP70基因的克隆及其表达分析

克隆了脊尾白虾热休克蛋白基因全长cDNA,并进行了序列分析。该基因由2 250 bp的碱基组成,开放阅读框长1 959 bp,编码由652个氨基酸组成的蛋白,基因两翼分别存在83 bp(5′端)和208 bp(3′端)的非翻译区,将该基因命名为Ec-HSP70。与其它物种HSP70s氨基酸序列进行同源性比较发现,与甲壳动物的同源性都在90%以上,表明该蛋白属于热休克蛋白HSP70家族。聚类分析表明,脊尾白虾热休克蛋白氨基酸序列与中国明对虾和凡纳滨对虾紧密聚为一支,之后聚类顺序依次为斑节对虾、日本囊对虾、刀额新对虾等。通过荧光定量RT-PCR对该基因在肝胰腺、肌肉的表达分析表明,温度、pH和氨氮胁迫都可以引起该基因的高表达,而且肝胰腺中的高表达时间相对肌肉中出现的较早。试验结果表明,温度、pH和氨氮胁迫对脊尾白虾HSP70基因表达有一定的诱导效果,但胁迫的时间过长则抑制其表达,肝胰腺对胁迫比肌肉较敏感。     

不同水平维生素E对高温应激及常温恢复后团头鲂血清生化指标、肠道抗氧化能力的影响

为研究饲料中添加不同水平的维生素E(VE)对急性热应激及常温恢复条件下团头鲂血清生理生化、激素及肠道抗氧化指标的影响,实验挑选180尾健康、规格一致的团头鲂(45.00±0.50)g,分成3组,每组4个平行,每组分别添加不同量维生素E(0、50和400 mg/kg饲料)。饲养90 d后,对团头鲂进行32℃应激1 d,并在25℃常温恢复7 d。结果表明:应激前,50 mg/kg VE组显著提高了肠道谷胱甘肽的活性(P<0.05);高温应激后,与对照组相比,50 mg/kg VE组在高温应激1 d后显著降低了谷丙转氨酶和皮质醇含量,常温恢复7 d后显著降低了谷草转氨酶、皮质醇的含量(P<0.05),显著提高了碱性磷酸酶、谷胱甘肽和超氧化物歧化酶活性(P<0.05);与对照组比,400 mg/kg VE添加组在32℃应激1 d及25℃恢复1 d后显著降低了谷丙转氨酶活性(P<0.05),常温恢复7 d后显著降低了皮质醇浓度,在应激1 d及恢复7 d后均显著降低了丙二醛浓度(P<0.05),400 mg/kg VE添加组在高温应激1 d后显著提高了碱性磷酸酶活性和三碘甲腺原氨酸含量,常温恢复7 d后显著提高了碱性磷酸酶活性(P<0.05)。因此,添加适量的维生素E(50～400 mg/kg)有利于调节血脂变化,提高团头鲂肠道抗氧化能力,并且可缓解高温应激对团头鲂血液指标波动的影响,减轻脂质过氧化水平,对团头鲂起到一定保护作用。     

大黄素、维生素C及其配伍对团头鲂感染嗜水气单胞菌后生理生化指标的影响

为综合评价大黄素、高剂量维生素C及其配伍对团头鲂(Megalobrama amblycephala Yih)抗嗜水气单胞菌感染能力的影响,选取1 200尾健康的团头鲂,体质量为(133.44±2.11)g,随机分成4组,其中1组为对照组,投喂基础日粮,另外3组在基础日粮中分别添加60mg/kg大黄素、700 mg/kg维生素C、60mg/kg大黄素+700mg/kg维生素C(配伍组).饲养60 d后,经腹腔注射感染嗜水气单胞菌,并在攻毒前后检测团头鲂血液和肝脏的生化指标以及肝脏2种热休克蛋白70s(HSP70s)mRNA的表达水平;另从各池中取10尾鱼进行同样的攻毒试验,统计攻毒后各时间点鱼的累积死亡率.结果表明,攻毒后,与对照组相比,大黄素、维生素C组不同程度地提高了血清总蛋白(TP)、溶菌酶(LSZ)和碱性磷酸酶(AKP)的水平,肝脏超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性以及HSC70和HSP70 mRNA的表达水平,降低了血清皮质醇(COR)、血糖(GLU)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、甘油三酯(TG)以及肝脏丙二醛(MDA)的水平;配伍组中,这些指标的变化趋势虽与上述类似,但大多与对照组的差异不显著(P＞0.05),且未表现出协同增效作用.此外,各组鱼血清胆固醇(CHOL)的含量在攻毒前后的差异均不显著(P＞0.05).统计也表明,大黄素和维生素C组鱼的累积死亡率在攻毒后24 h、48 h均显著低于对照组(P＜0.05),而配伍组试验鱼的累积死亡率与对照组差异均不显著(P＞0.05).由此可见,在基础日粮中添加大黄素60 mg/kg或维生素C 700 mg/kg,可提高鱼体的非特异性免疫力、抗氧化能力以及2种HSP70s mRNA的表达水平,增强鱼体抗病原菌感染的能力.二者配伍则效果不佳.     

菲在厚壳贻贝体内的富集与释放及其对HSP70 mRNA表达的影响

以厚壳贻贝(Mytilus coruscus)为研究对象,开展不同暴露浓度(4、20和100 µg/L)菲(phenanthrene, PHE)的富集(10 d)和释放(5 d)实验,分别利用高效液相色谱法和荧光定量qPCR法分析了厚壳贻贝内脏团、外套膜、闭壳肌对PHE的富集和释放实验及HSP70 mRNA表达量的变化。结果显示,在10 d的富集阶段,厚壳贻贝3个组织对PHE的富集能力大小表现为内脏团>外套膜>闭壳肌;3个组织对PHE的富集含量随时间的增加而增加,同时,也随暴露浓度的增加而增加;在释放实验阶段,厚壳贻贝3个组织中PHE含量在释放前期迅速下降,但在15 d时,3个组织中PHE残留量仍均高于对照组;PHE对厚壳贻贝体内HSP70 mRNA诱导表达具有组织特异性,其中外套膜中HSP70 mRNA表达量最高。研究结果可为PHE在贝类体内的富集动力学及致毒机制研究提供参考依据。     

温度突变对凡纳滨对虾己糖激酶和丙酮酸激酶活力以及热休克蛋白表达的影响

研究了水温从17℃突变为27℃对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)稚虾己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)活力及热休克蛋白(HsP70)表达的影响.主要结果如下:(1)温度突变后,凡纳滨对虾肝胰脏中己糖激酶活力逐渐增大,温度突变后3h达到最高,是温度突变前的2.54倍(P＜0.05).随后,对虾己糖激酶的活力逐渐下降,72h酶活力基本恢复到温度突变前的水平.(2)温度突变后1h,凡纳滨对虾丙酮酸激酶的活力降到最低,随后逐渐增大;6h达到最高,随后对虾丙酮酸激酶的活力逐渐下降并在72h恢复到温度突变前的水平.(3)温度突变0.5h后,凡纳滨对虾肌肉中HSP70的表达量迅速升高,1h达到最高,与温度突变前差异显著(P＜0.05),随后下降到比温度突变前稍高的水平并趋于稳定.实验结果表明,温度突然升高后,己糖激酶活力升高,随后恢复到起始水平;糖酵解过程先受到抑制,之后得以恢复;温度突变可导致凡纳滨对虾对环境的抗逆性提高.     

罗非鱼HSP70(tHSP70)蛋白的生物信息学分析、真核表达及质谱鉴定

运用生物信息学技术分析罗非鱼热休克蛋白70(tilapia heat shock protein,tHSP70)的理化特性、糖基化位点、跨膜区域、蛋白的细胞定位及信号肽与虹鳟等其他动物HSP70的相似性,以人工合成cDNA为模板,通过聚合酶链式反应扩增其完整CDS,并将此DNA片段与真核表达载体pGAPZa-A连接,构建pGAPZa-HSP70表达质粒,在毕赤酵母GS115中表达tHSP70蛋白,对表达上清液进行SDS-PAGE及Western-blotting分析后,采用Ni²⁺IDA层析脱盐纯化目的蛋白,并对所表达的蛋白进行糖基化PAS染色鉴定。对表达的蛋白进行SDS-PAGE后,将所获得的非预定大小(约100 ku)条带进行电离飞行时间质谱鉴定,并确定其蛋白种类。结果表明:tHSP70所含氨基酸数量为640,分子量为70 274.5 u,等电点为5.49。在哺乳动物网织红细胞(体外)的半衰期为30 h,在酵母内半衰期大于20 h,而在大肠杆菌内的半衰期也大于10 h,不稳定指数为36.64,脂肪族指数为85.58。可能分别含有6个N-和O-糖基化位点,所克隆tHSP70基因与目的基因完整编码区序列完全一致,所构建的pGAPZa-HSP70质粒能在GS115中成功表达,诱导表达上清液经SDS-PAGE及Western-blotting分析后发现,除70 ku目的蛋白外,还出现一条100 ku条带。经糖基化PAS染色证明,此100 ku蛋白可能是HSP70糖基化的结果,且能被人的兔抗HSP70抗体识别,质谱鉴定证明该条带即是tHSP70蛋白。本研究所表达tHSP70蛋白为后续罗非鱼细胞学及抗原提呈等免疫学研究奠定了基础。     

Physiological responses and HSP70 mRNA expression in GIFT tilapia juveniles,Oreochromis niloticus under short‐term crowding

Physiological responses and HSP70 mRNA expression to short‐term crowding were tested in juveniles genetically improved farmed tilapia (Oreochromis niloticus) (70.43 ± 4.43 g). Fish were kept at control group (5 g L^?1) and stress groups (low density 10 g L^?1, medium density 40 g L^?1 and high density 70 and 100 g L^?1) for 48 h. Each density was tested in triplicates. The effects of a short‐term exposure on the physiological responses of fish were determined before stress (0 h) and at 6, 12, 24 or 48 h post‐crowding. There was a significant increase in serum cortisol, total protein, lysozyme and aspartate aminotransferase (AST) activities in all stressed groups at 24 h post‐crowding (P < 0.05). Serum glucose and alanine aminotransferase (ALT) of 100 g L^?1 stressed group were lower than that of the control after 48 h of crowding stress (P < 0.05). The levels of serum triglyceride and cholesterol in crowding stress with high density were significantly decreased compared with the control group at 48 h. The mRNA expression data showed that hepatic HSP70 mRNA levels were markedly elevated at all stressed groups. HSP70 mRNA levels of 70 and 100 g L^?1 stressed groups decreased at 48 h compared with the 24 h post‐crowding. The protective ability of HSP70 was limited.     

团头鲂促甲状腺激素β亚基基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法（RACE）克隆团头鲂（Megalobrama amblycephala）脑下垂体中促甲状腺激素β亚基（TSHβ）基因，并对其基因结构和系统进化进行分析。该基因cDNA序列全长614bp；5’端非翻译区100bp；3’端非翻译区61bp；开放阅读框架（ORF）453bp，共编码150个氨基酸。其编码的氨基酸序列与鳙鱼（Aristichthys nobili5）、鲤鱼（Cyprinus carpio）、金鱼（Carassius auratus）、斑马鱼（Daniorerio）、鲑鱼（Salmo salar）、虹鳟（Oncorhynchus mysiss）、欧洲鳗鲡（A．nnguilla）的相似性分别为：99．3％、92％、92％、82％、62．6％、62．6％和56％。核苷酸序列分析显示，团头鲂与鳙鱼相似性最高，为98．23％；与欧洲鳗鲡相似性最低，为48．7％。说明唧亚基在长期的进化中相当保守。在所比较的9种鱼类该基因ORF氨基酸序列中都含有定位相同的12个半胱氨酸残基，它们在成熟肽中形成6个二硫键，这对保证促甲状腺激素的空间结构，维持促甲状腺激素的生理功能起着重要的作用。该基因的成功克隆不仅为TSHβ的分子进化和相似性比较研究提供了新的资料，而且对进一步研究该基因的功能、表达具有重要的意义。     

Physiological responses and HSP70 mRNA expression of GIFT strain of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) under cold stress

An investigation on the physiological responses and HSP70 expression under cold stress was conducted on Genetically Improved Farmed Tilapia (GIFT) strain of Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Tilapia were acclimated at 28°C as control and then the water temperature was reduced from 28°C to 15°C at a rate of 1°C h^?1, and serum biochemical indices, antioxidant enzymes and expression of HSP70 mRNA were analysed on days 0, 0.5, 1, 2, 3 and 5 after exposure to 15°C. The concentration of serum K, Na, Cl and Ca concentration showed instability during cold stress. Glucose rapidly increased on day 0 followed by a declining trend. Triglyceride, cholesterol, low density lipoprotein‐cholesterol signifi‐cantly decreased and high density lipoprotein‐cholesterol showed instability during cold stress. Aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase and lactate dehydrogenase activities were prominently elevated under cold stress. Superoxide dismutase and catalase activities showed a remarkable rise on day 0.5 under cold stress, and gradually decreased thereafter. HSP70 mRNA level significantly increased both in liver and muscle under cold stress, especially on days 0.5 and 1. These results suggest that cold influences several physiological responses of tilapia, and the cold resistance and cold tolerance of tilapia will benefit from the enhancement of antioxidant enzymes activities and upregulated HSP70 mRNA expression.