合成茶树咖啡碱相关的N-甲基转移酶基因家族的克隆及序列分析

咖啡碱是茶叶中重要的功能成分,它以黄苷为底物,以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体,通过N-甲基转移酶（NMT）类催化的一系列甲基化反应合成的产物。根据NMT基因高度相似的特性,利用长片段PCR法和侧翼序列克隆技术分离了白叶一号6种NMTs的基因组DNA全长,其中有2种为已报道的茶树咖啡碱合成酶基因TCS1、TCS2,1种为假基因,另3种基因分别被命名为TCS3、TCS4、TCS5,基因结构分析发现这6种基因均由4个外显子和3个内含子组成。山茶属植物的NMTs可聚为5类,其中TCS4和TCS5为与其他基因的相似性相对较低的一类。这些结果为今后更好地从基因组水平上剖析茶树咖啡碱的遗传机制提供有用参考。     

茶树氧甲基转移酶基因的克隆及原核表达

获得了一类茶树氧甲基转移酶基因cDNA全长并构建了该基因的原核表达载体。以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得氧甲基转移酶(O-methyltransferase)基因cDNA全长1 280 bp,其开放阅读框为1 068 bp,编码355个氨基酸,推测的蛋白分子量为39.1 kD,理论等电点为5.68。其氨基酸序列与葡萄和蓖麻氧甲基转移酶基因相似性分别为73%、71%。将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21后诱导重组蛋白的表达,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测到1条与预测融合蛋白分子量相符的外源蛋白。     

茶树DNA甲基转移酶基因CsDRM2的克隆及表达分析

DNA甲基化作为表观遗传修饰的主要途径之一,能够通过对基因组 DNA 的修饰参与植物对外界环境胁迫的响应, DNA甲基化需要DNA甲基转移酶的参与.实验室前期研究表明,茶树在冷驯化过程中发生了甲基化反应.通过RACE克隆,获得了茶树中DNA甲基转移酶CsDRM2基因的cDNA全长序列(NCBI登录号KR057963).CsDRM2序列全长2328bp,含1815bp的开放阅读框,编码604个氨基酸,预测蛋白质分子量为67.39 kD,理论等电点(PI)为4.85.生物信息学分析结果显示,茶树CsDRM2蛋白与芝麻和烟草的亲缘关系最近,CsDRM2的氨基酸序列与其他植物的DRM2相似性均高于65%.CsDRM2基因表达分析的结果发现,随着冷驯化的进行,CsDRM2基因的表达量呈现出增加的趋势,参与茶树冷驯化过程的甲基化响应.     

茶树CsMYB基因启动子的克隆与功能分析

以茶树新品系“1005”嫩芽为材料,克隆得到CsMYB基因gDNA全长序列1β828βbp,通过染色体步移技术,分离得到CsMYB基因启动子片段1β038βbp,命名为proMYB。生物信息学分析表明,CsMYB gDNA由2个内含子和3个外显子组成,该启动子含有与提高基因转录水平相关的5′UTR Py-rich stretch顺式作用元件、启动子核心元件TATA-box和CAAT-box,还存在有激素响应元件、光响应元件、逆境应答元件以及大量功能未知或功能特异的顺式作用元件,说明proMYB具有诱导型启动子特性,CsMYB基因在茶树植物体中可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号传导;通过烟草的瞬时表达结果表明,该启动子能驱动下游基因表达,具有启动子活性。     

咖啡碱合成N-甲基转移酶研究进展

咖啡碱是茶叶、咖啡等饮料的主要品质成分及功能成分之一。在植物体内咖啡碱生物合成的核心途径为：黄嘌呤核苷→7-甲基黄嘌呤核苷→7-甲基黄嘌呤→可可碱→咖啡碱,其中包括3步由N-甲基转移酶催化的转甲基化反应和1步由核糖核苷水解酶催化的脱核苷反应。N-甲基转移酶是参与咖啡碱生物合成的关键酶类。介绍了植物中咖啡碱的基本情况及其生物合成途径,重点综述了咖啡碱合成N-甲基转移酶的酶学特性、NMTs的克隆、基因结构与功能的关系以及基因表达调控研究等方面国内外的研究进展,并对未来该领域的研究重点进行了探讨和展望。     

茶树CsANS基因及其启动子的克隆与生物信息学分析

采用RACE技术,获得茶树武夷奇种C18叶片花青素合成途径中的花青素合成酶(ANS)基因的c DNA全长序列。采用染色体步移技术获得该基因的启动子序列。采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同遮光处理下的表达动态。结果表明,Cs ANS全长c DNA为1 000 bp,其中ORF(Open Reading Frame)为957 bp,编码320个氨基酸,含有DIOX-N和20G-Fell-Oxy保守功能结构域;分离得到Cs ANS基因上游调控序列1 010bp,其含启动子核心元件TATA-box及ACE、GT1-motif、Sp1(光响应元件)、circadian(生物钟相关元件)等与花青素合成途径相关的重要顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,该基因在全光照处理(CK)时表达量较高,75%遮光时表达量较低。说明该基因的表达受光照强弱的控制。     

不同茶树品种中CsNUDX1基因催化功能、启动子结构及功能分析

香叶醇是茶树中重要的萜烯类化合物,在不同茶树品种中的积累存在较大差异。茶树核苷二磷酸水解酶（Nucleosidediphosphatehydrolase,Nudix）基因CsNUDX1-cyto可促进香叶醇及其糖苷在茶树中的积累。为探究该基因在不同茶树品种中的催化功能及调控差异,分析了7个茶树品种中香叶醇的积累差异及CsNUDX1-cyto时空表达变化,同时分析了该基因的催化功能及其启动子结构和功能差异。结果显示,CsNUDX1-cyto表达量与香叶醇含量变化呈显著正相关（r=0.805）;香叶醇在中国变种茶树嫩梢中的含量显著高于阿萨姆变种茶树。农杆菌介导的本氏烟草遗传转化体系表明,不同茶树品种的CsNUDX1-cyto均能促进香叶醇的生物合成。启动子活性分析显示,云抗10号茶树品种中CsNUDX1-cyto的启动子活性较弱;结构分析表明,云抗10号茶树品种CsNUDX1-cyto启动子在转录起始位点–33处有185碱基的序列插入,使得增强元件CAAT-box位于–133处（其他品种CAAT-box均位于–47处）。研究结果表明不同茶树品种中的CsNUDX1-cyto均能够促进香叶醇的...     

茶树中甲基转移酶的研究进展

甲基转移酶普遍存在于茶树中,它与茶叶类黄酮物质及咖啡碱的形成、茶树冷驯化过程中DNA甲基化模式的变化和硒代半胱氨酸的形成有关。本文综述了茶树甲基转移酶的基因研究、原核表达和催化特性研究,为以后茶树体内的甲基化修饰提供理论依据。     

大豆根部特异性启动子的克隆及功能分析

利用PCR技术从大豆品种吉农17基因组DNA中分离得到大豆根部特异性启动子片段RSP,长度约为2.5kb.序列分析表明RSP与报道序列同源性达97%以上,将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pRSP-GUS后,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化炯草(Nicotiana tabacum)NC89.转基因植株的GUS活性检测表明,仅能在根中检测到GUS活性,而在茎、叶和种子等其它组织中都未检测到GUS活性,证实RSP片段具有根部特异性表达功能.     

大豆种皮特异性启动子的克隆及功能分析

采用PCR技术从大豆品种吉农17基因组DNA中分离得到大豆种皮特异性启动子片段SCSP,长度约为1268 bp.序列分析表明SCSP与报道序列同源性达97%以上.将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pSCSP-GUS后,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)NC89.转基因植株的GUS活性检测表明,仅能在种皮检测到GUS活性,而在茎、叶和花等其它组织中都未检测到GUS活性,证实SCSP片段具有种皮特异性表达功能.     

茶树胡萝卜素合成关键基因CsLCYb和CsLCYe的克隆与功能鉴定

胡萝卜素是茶树叶片色素重要的组分之一,具有参与光合作用、保护光合系统的功能。从茶树叶片转录组中获得两个胡萝卜素合成关键基因:番茄红素-β-环化酶基因(CsLCYb)和番茄红素-ε-环化酶基因(CsLCYe),它们分别含含1515bp和1524bp的开放阅读框,编码504和507个氨基酸残基,与其他植物的同源基因高度相似。利用多基因串联表达证明CsLCYb能够将番茄红素环化成胡萝卜素,而CsLCYe则无此活性。通过ELISA分析胡萝卜素生成效率,发现含有CsLCYb表达载体的菌落能够产生大量胡萝卜素,与阴性对照差异极显著,而含有CsLCYe表达载体的菌落则与阴性对照一致,无胡萝卜素产生。这与茶树中胡萝卜素的种类和含量水平一致,说明茶树主要是通过LCYb途径产生胡萝卜素。qRT-PCR分析表明,CsLCYb在黄化品种中黄2号的不同叶位中表达水平与其黄化程度呈正相关,与胡萝卜素含量水平相一致,并且该基因在正常叶色品种龙井43和中黄2号的相对表达结果也符合这一规律。这充分证明CsLCYb在黄化茶树叶片的胡萝卜素合成和叶色变化过程中扮演了重要的角色。本研究阐明了茶树胡萝卜素合成的关键基因和主要途径,为揭示茶树黄化的分子机理提供了重要的遗传基础。     

白鸡冠茶树CsPPH基因全长cDNA克隆与表达分析

脱镁叶绿素酶（Pheophytinase,PPH）是叶绿素降解过程中的一个关键酶,它能使脱镁叶绿素a转化为脱镁叶绿酸a,脱镁叶绿酸a是叶绿素降解途径中最后一个保持植物绿色的产物,被认为是叶片衰老和黄化的关键步骤。以新梢白化茶树白鸡冠叶片为材料,克隆获得CsPPH基因cDNA的全长序列（登录号：MK359094）,并对其进行生物信息学分析。结果表明,CsPPH全长为1 298 bp,包含的ORF序列为1 241 bp,编码413个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定疏水蛋白,其预测分子量为45 741.50 Da,理论等电点为6.12。预测该基因主要定位于叶绿体中。qRT-PCR结果显示,遮荫抑制白鸡冠叶片CsPPH的表达,叶绿素升高,叶色变绿;光照促进白鸡冠叶片CsPPH的表达,叶绿素降解,导致叶片白化。     

基于数字表达谱对茶树类黄酮合成、调控相关基因表达的研究

利用数字基因表达谱技术研究了茶树类黄酮合成及调控相关基因在花瓣、花粉、休眠芽、萌发芽中的表达情况。结果发现花瓣、休眠芽、萌发芽中类黄酮合成基因大量表达,而花粉中类黄酮合成基因表达量极少,这与茶树中类黄酮物质的分布规律一致。同时本研究在类黄酮调控相关MYB、bHLH、MADS、GST、WD40、Homeodomain基因家族中找到12个基因可能与花瓣中类黄酮物质合成调控有关,9个基因可能与芽中类黄酮物质合成调控有关。这些研究结果将为深入解析茶树类黄酮合成、调控机理打下基础。     

茶树PPO基因家族的鉴定与分析

多酚氧化酶（Polyphenol oxidases,PPO）是由核酸编码的一种以氧为受体的含铜金属酶,为一种末端氧化酶,在茶叶加工中也发挥重要的作用。从最新发布的茶树基因组数据库中获得了5条PPO基因：CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3、CsPPO4（GenBank登录号为GQ129142.1）、CsPPO5。本研究利用生物信息学方法,对5条基因的核酸序列和氨基酸序列进行分析,并对基因编码蛋白的理化性质和结构功能进行预测。结果表明,5个基因CDS区全长在597~1β839βbp之间,编码氨基酸数目198~612;系统进化树分析显示CsPPO1、CsPPO3、CsPPO4和CsPPO5具有较近的亲缘关系;编码的蛋白均属于亲水性不稳定类脂类结合蛋白,都不具有信号肽;无规则卷曲是蛋白质的主要结构元件,α-螺旋和β-折叠分散于整个多肽链中,CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3可能存在一个或多个跨膜螺旋;5个蛋白均含有PPO1_DWL（pfam12142）保守结构域,除了CsPPO2外,其余4个蛋白均预测到TYROSINASE功能结构域。实时定量PCR结果表明,PPOs基因在不同茶树品种间呈现出不同的表达模式。     

茶树无色花色素还原酶基因克隆及表达分析

采用EST测序技术和3′RACE技术,获得了茶树儿茶素代谢途径中的一个重要酶—无色花色素还原酶的全长基因,在GenBank的登录号为EF205148,序列全长1 301 bp,其中开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37.5 kD,理论等电点为5.81。将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树无色花色素还原酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约60 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。同源性分析表明茶树无色花色素还原酶基因编码的氨基酸序列与其他植物具有较高的相似性,例如与亚洲棉、草莓和葡萄的相似性分别为70%、68%、71%。利用半定量PCR技术检测总儿茶素含量不同的4个茶树品种中与类黄酮合成相关的黄酮醇合成酶(FLS)、二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)、无色花色素还原酶(LAR)、花色素合成酶(ANS)等7个基因的表达情况,结果表明DFR和LAR基因的表达量与茶树中总儿茶素含量呈一定的相关性,而其他基因则与其相关性不大。     

茶树CsMGTs基因的克隆及其镁转运功能分析

镁离子（Mg²⁺）作为叶绿素的中心成分,是植物细胞中含量最丰富的二价阳离子,也是多种酶的激活剂,特别是茶氨酸合成酶的活性依赖Mg²⁺,常被作为茶树专用肥的特征成分,因此对茶树的生长发育和茶叶的品质形成至关重要。MRS2/MGT家族镁转运蛋白在维持植物体内Mg²⁺的吸收转运、胞内平衡和耐逆性等方面起着重要的作用。为探究茶树MRS2/MGT家族镁转运蛋白基因的功能,以茶树品种陕茶1号为材料,克隆了4条MRS2/MGT镁转运蛋白基因,分别命名为CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3。生物信息学分析表明,这4个转运蛋白在C末端均含有2个跨膜结构域和1个保守的GMN三肽基序;系统发育分析显示,CsMGT1属于Clade C成员,而CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3属于Clade B成员,所编码蛋白与木本植物柑橘MGT家族的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析表明,CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3在茶树的根、茎、叶、花中呈组成型表达,且根和叶对Mg²⁺浓度均表现出不同程度的响应。鼠伤寒沙门氏菌镁转运缺失突变株MM281功能互补试验表明,CsMGT1和CsMGT2均具有Mg²⁺转运功能,且CsMGT1的Mg²⁺转运功能优于CsMGT2,而CsMGT2.1和CsMGT3几乎没有镁离子转运功能。本研究结果丰富了茶树CsMGTs家族的生物学功能,为进一步阐明茶树通过镁转运功能机制实现对镁离子的利用奠定了前期研究基础。     

茶树查尔酮异构酶基因克隆及序列分析

茶叶是世界上最流行的无酒精饮品之一,含有许多有价值的次生代谢产物,如儿茶素类物质。分离和克隆重要的茶树功能基因,对利用基因工程技术进行茶树遗传调控具有重要意义。本文采用EST测序技术和T4RNA连接酶介导的5′RACE技术,获得了一个茶树儿茶素代谢中的重要基因—查尔酮异构酶（CHI）基因,在GenBank登录（DQ904329）,其序列全长1 163 bp,其中开放阅读框长723 bp,编码240个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为26.4 kD,理论等电点为5.19。序列分析表明它与番茄CHI基因序列的亲缘关系比较近。     

茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因的克隆、表达及功能分析

茶树二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是儿茶素合成途径中的关键酶。本研究采用RT-PCR技术,获得了茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因(CsDFR)的开放阅读框,它编码含347个氨基酸的蛋白质,推测分子量为38.69 kD,等电点为6.02。成功地将该基因重组到表达载体SUMO上,并在大肠杆菌BL21中进行原核表达;优化了原核表达中诱导时间、诱导温度、IPTG浓度;纯化出目的蛋白。利用HPLC-MS方法对重组蛋白进行了体外酶活检测,结果表明目的蛋白具有DFR酶活性,可催化DHQ和DHM的还原反应。     

茶树CsCDF1基因克隆及表达分析

采用SMART-RACE技术克隆了茶树Dof（DNA binding with one finger）基因CsCDF1的全长cDNA序列,并利用在线生物信息学软件对其进行了分析。采用实时荧光定量PCR分析该Dof基因在茶树不同组织间的表达差异和昼夜表达规律,及其在氮饥饿处理2周后对不同浓度氮素诱导的响应。该cDNA序列全长1β606βbp,包含1个编码464个氨基酸的完整开放阅读框,含有高度保守的DOF结构域,推导的蛋白分子量为50.8βkDa,理论等电点（PI）为5.52;其编码的蛋白序列与茸毛烟草、马铃薯和美花烟草的CDF蛋白（Cycling dof factor）相似性分别为69%、67%、68%。系统发育分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥CDF蛋白聚为一类,因此将其命名为CsCDF1;CsCDF1在3个不同茶树品种根系中的表达量均高于一芽二叶和成熟叶;在一天中,该基因的表达呈现出昼夜节律变化;在氮饥饿后重新供氮,不同组织中该基因对不同浓度氮素的响应均为上调。