小麦中miR164的靶基因鉴定及其在衰老过程中的表达

miR164是植物中一种重要的非编码RNA,对植物的生长发育具有重要作用。为了解miR164靶基因与小麦衰老的关系,本研究通过在线软件对小麦中miR164家族成员进行了鉴定并对其进行生物信息学和表达分析。结果表明,从小麦中共鉴定出13个miR164家族成员,其不均匀分布在9条染色体上。系统进化分析表明,13个小麦miR164与同属于禾本科单子叶植物的水稻亲缘关系较近。13个Tae-miR164均能形成稳定的二级结构,成熟序列碱基具有高保守性,仅有3个Tae-miR164成员在第21位存在差异,成熟序列产生于前体中具有碱基高保守性的第1～21位。Tae-miR164的靶基因中,有18个为NAC转录因子,占所有靶基因总数的75%,表明Tae-miR164的主要靶基因为NAC转录因子。Tae-miR164家族成员在小麦叶片中的表达量明显高于其他组织;在小麦叶片衰老过程中,与其他Tae-miR164靶基因相比,有3个Tae-miR164靶基因表达差异显著,其ID分别为TraesCS4A02G225100、TraesCS5B02G054800和TraesCS5A02G04910,其中TraesC...     

茶树miR156a靶基因SPL6和SPL9的克隆及表达分析

MicroRNA156a-SQUAMOSA promoter binding-like protein(miR156a-SPLs)参与植物生长阶段转变、叶片形态建成和逆境胁迫等复杂的生理过程。基于茶树转录组数据,从茶树中克隆出2个SPL家族成员——CsSPL6和CsSPL9。CsSPL6 cDNA全长2 318 bp,ORF框长1 668 bp,编码555个氨基酸;CsSPL9 cDNA全长1 954 bp,ORF框长1 116 bp,编码371个氨基酸;CsSPL6和CsSPL9都有典型SBP结构域和Csn-miR156a识别位点。时空表达特性分析表明,Csn-miR156a在芽中表达量最高,第7叶中最低,与CsSPL6和CsSPL9呈负调控关系;不同品种(系)表达特性分析表明,Csn-miR156a的表达模式与新梢生长量、光合指标结果一致,与CsSPL6和CsSPL9表达模式相反,说明Csn-miR156a、CsSPL6和CsSPL9参与茶树生长过程,Csn-miR156a和CsSPLs可作为初步判断品种生长势强弱的分子手段;高温处理4个品种(系)表达特性表明Csn-miR156a与CsSPL9呈负相关,推断茶树在高温胁迫下Csn-miR156a可能通过负调控CsSPL9来增加耐高温性。Csn-miR156a负调控CsSPLs在茶树生长发育、逆境胁迫中发挥作用,为茶树生长和抗逆机制提供理论依据。     

缺磷对茶树磷吸收及miR399a表达量的影响

磷素缺乏是我国及世界农业的普遍问题.本研究通过不同磷浓度胁迫处理茶树,发现根、新叶、老叶中磷含量都随着处理浓度的下降而降低,其中老叶中磷含量变化急剧,而新叶变化较缓慢.在缺磷条件下(100μmol·Lˉ1、10μmol·Lˉ1),老叶中的磷元素会重新转运到新生组织,实现磷元素的再次利用,而在过量磷浓度供应条件下(3000μmol·Lˉ1),磷元素则大量存储于老叶中,以维持体内磷平衡.茶树根部提取的总RNA量普遍比叶片低,但根部和叶片提取的RNA质量都符合反转录要求.试验通过荧光定量PCR方法,检测正常(1000μmol·Lˉ1)和低磷(10μmol·Lˉ1)胁迫下叶片和根中miR399a的表达量,发现在低磷胁迫下,miR399a在叶片和根中的表达量都显著提高,其中叶片提高约2.77倍,根提高约3.82倍,该结果与拟南芥、水稻等植物研究结果相一致.     

茶树CsASR基因的克隆及其表达分析

逆境胁迫影响茶树生长发育及茶叶品质,ASR(abscisic acid,stress,ripening-induced)基因在植物抗逆响应中具有重要功能。本研究以龙井43品种茶树为材料,从中克隆了CsASR基因的全长cDNA序列、基因组序列及其启动子序列,分析了该基因的生物信息学特征及在组织间和不同胁迫处理下的表达模式。结果显示,CsASR的cDNA序列全长875 bp,含有546 bp的ORF序列,编码181个氨基酸,蛋白质分子量19.89 kD,理论等电点5.69;CsASR蛋白结构序列中74.5%的序列为无序结构,是一种无序蛋白;CsASR的C-端含有ABA/WDS功能结构域,主要定位于细胞质和细胞核中;茶树CsASR与海枣的ASR相似性最高,为87%,而在进化树中与枣的关系最近。CsASR基因含2个外显子,第1个外显子长363 bp,第2个外显子长183 bp,内含子较大为2 750 bp,内含子中含7种简单重复序列和2种DNA转座子序列。克隆获得起始密码子ATG上游2 554 bp的启动子区序列,该启动子上含有干旱、低温、高温以及ABA等相关的顺式作用元件。CsASR在根中的表达量最低;ABA抑制CsASR的表达,而干旱、NaCl和低温胁迫能够显著上调CsASR的表达。表明CsASR基因可能与茶树抗逆密切相关。     

大豆miR10193家族成员鉴定及其结瘤相关表达分析

miR10193是在大豆中和线虫侵染等相关的一个miRNA家族,其在大豆共生结瘤中的作用仍不清楚。为系统鉴定大豆miR10193家族成员并分析其在共生固氮过程中的表达模式,本研究在全基因组水平上鉴定大豆miR10193家族成员并进行生物信息学分析,采用qRT-PCR方法分析其在不同大豆组织和根瘤菌侵染早期的表达模式。结果显示：共鉴定出12个miR10193成员,分别位于第3、4、7、8、10、13、16、19和20号染色体上。miR10193家族成员成熟序列和星标序列高度保守,它们的前体序列均可生成稳定的二级结构。miR10193家族前体序列的进化分析可将miR10193家族成员分为两个亚家族,其中gma-miR10193c和gma-miR10193h存在串联复制。顺式调控元件分析发现该家族成员可能参与植物激素、胁迫、生长和发育等过程。miR10193家族成员在不同组织的表达量分析结果表明,多个miR10193家族成员在根瘤中表达最高,表明其可能参与大豆共生结瘤的调控。除gma-miR10193d/j/k/l外,其它miR10193家族成员均在根瘤中高表达,并发现miR10193家族成员均显著响应根瘤菌的侵染。靶基因预测表明BTB/POZ结构域蛋白和2OG-Fe(Ⅱ)氧化酶家族蛋白可能是miR10193的靶基因。本研究为研究大豆miR10193家族及其在豆科结瘤固氮过程中的功能和机制提供了理论基础。     

茶树SRO基因家族的鉴定及表达分析

SROs(Similar to rcd one)是植物特有的基因家族。本研究利用生物信息学方法从茶树基因组中鉴定获得9个茶树SRO基因家族成员,分别命名为CsRCD1-4和CsSRO1-5。9个茶树SRO基因的编码蛋白均具有特征结构域PARP和RST,具有相似的保守基序。系统进化树分析聚分为3组,Ι组包含CsRCD1-4,Ⅱ组包含CsSRO1和CsSRO2,Ⅲ组包含CsSRO3-5。基因结构分析表明每个CsSRO基因含有4至9个外显子。8个茶树组织转录组数据分析表明,CsRCD1、CsRCD3和CsRCD4可能在茶树不同发育阶段具有重要作用;大多数CsSRO基因在根和成熟叶中较高表达。上游启动子区域分析发现大量与植物发育、激素及胁迫响应密切相关的顺式作用元件,进一步对CsSRO基因在干旱和脱落酸处理下的表达模式进行分析发现,9个CsSRO基因均被诱导表达,CsSRO基因可能与茶树抗旱密切相关。     

蓖麻miR396基因家族及其靶基因GRF生物信息学分析及鉴定

MiR396-GRF在调控植物的生长发育和生物胁迫及非生物胁迫过程中发挥着重要作用,目前关于蓖麻miR396和GRF的研究还很少.本研究中利用BLASTP和Pfam在蓖麻基因组中鉴定到4个miR396和11个GRF成员.分析发现,RcGRFs转录因子蛋白长度在318-619aa之间,理论等电点在5.54-9.34之间,...     

基于 EST 和 GSS 序列的茶树 miRNA 及其靶基因数据挖掘

microRNA（miRNA）是一类长 19~24 个碱基的小分子内源性非编码单链 RNA,通过介导靶基因的裂解或抑 制靶基因的翻译,在植物的发育、新陈代谢、应激响应等方面起着重要的调控作用,在进化上具有高度的保守性。据 此本研究以 miRBase 注册的全部成熟植物 miRNA 序列为探针,基于 NCBI 数据库中茶树表达序列标签（EST）和基因 组勘测序列（GSS）进行同源搜索和 miRNA 二级结构分析,总共发现 7 条茶树的 miRNA,分属于 6 个不同的 miRNA 家族。通过靶基因的预测分析表明,这些 miRNA 可能调节 28 种靶标基因,功能涉及新陈代谢、生长发育、胁迫应答 及转录,为茶树 miRNA 的试验鉴定和功能研究提供更详细精确的范围,为进一步探究茶树 miRNA 的调控机理奠定 基础。     

茶树钙依赖性蛋白激酶基因CsCDPK17的鉴定及表达分析

钙依赖型蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs或CPKs)是植物细胞中重要的钙离子信号受体,普遍参与了植物生长发育和胁迫响应等调控过程。本研究从茶树龙井43中克隆到1条CDPK基因,经测序验证该序列包含1611bp的完整ORF,编码536个氨基酸。结合序列比对和进化分析发现该蛋白N-末端具有豆蔻酰化位点,具备钙依赖性蛋白激酶的保守结构域,并且与拟南芥AtCDPK17的同源关系最近,因此命名为CsCDPK17(Genbank登录号为:MK238482)。蛋白质理化特性分析发现其蛋白分子量为59.9kD,理论等电点pI为5.43,属无跨膜结构域的亲水性蛋白。使用水稻原生质体和烟草叶片两种瞬时表达的方法均证明CsCDPK17是细胞质膜和细胞核双定位蛋白。对克隆到的CsCDPK17上游2000bp的启动子区分析发现了多个与基因转录、光、激素(ABA、SA、MeJA等)相关的顺式作用元件。表达分析显示,CsCDPK17在成熟叶和种子中表达水平较高,而在根中的表达水平最低;在龙井43、大面白等4个品种冷驯化过程中,该基因的表达随着冷驯化过程显著上调,随着脱驯化过程下调;同时还发现CsCDPK17能够不同程度地响应低温(最高5.1倍)、干旱(最高2.3倍)、渗透(最高2.4倍)胁迫。本研究的结果表明CsCDPK17在茶树的生长发育和低温、干旱、渗透等非生物胁迫响应的过程中均发挥一定的调控作用。     

茶树NUDIX基因家族的鉴定及表达分析

NUDIX水解酶属于焦磷酸酶,在信息传递、植物生长协调和响应逆境胁迫等方面起着重要作用。基于茶树（Camellia sinensis）基因组鉴定出43个NUDIX家族基因,并运用生物信息学和实时荧光定量PCR等方法对其分析。结果表明,43个CsNUDXs蛋白质分子量介于11.8~89.2 kDa,氨基酸长度为102~342个,理论等电点为4.49~9.26,18.6%的蛋白为稳定性蛋白;根据进化关系将CsNUDXs分为6个亚家族;启动子顺式作用元件分析发现CsNUDXs具有许多与激素响应、逆境胁迫和生长发育等调控相关的作用元件;对CsNUDXs家族基因在不同器官表达模式进行分析,发现CsNUDX3、CsNUDX7在果实中表达量较高,而CsNUDX22、CsNUDX25在果实中表达量极低,CsNUDX30在老叶中表达量极低;不同处理组的实时荧光定量PCR结果表明,1 mmol·L^-1茉莉酸甲酯（MeJA）处理下CsNUDX1、CsNUDX2和CsNUDX33等表达量呈现先升后降再升的趋势,而1 mmol·L^-1水杨酸（SA）处理下CsNUDX4、CsNUDX12和CsNUDX22等表达量则呈现先降后升再降的趋势,300 mmol·L^-1 NaCl处理下CsNUDX2、CsNUDX4和CsNUDX22等表达量呈现先升后降的趋势。本研究应用生物信息学技术初步解析了CsNUDXs的基本特征和功能,发现CsNUDXs可响应高盐胁迫和MeJA、SA处理。     

茶树CsGPX基因全基因组鉴定和表达分析

为明确茶树谷胱甘肽过氧化物酶(CsGPX)基因与非生物胁迫的关系,本研究利用生物信息学手段在茶树基因组中筛选得到3条CsGPX基因,对其编码蛋白理化性质、基因结构、系统进化树、顺式作用元件进行了分析。结果表明,CsGPX包含完整GPX结构域和3段保守序列,都具6个外显子。预测启动子上有参与植物激素和非生物胁迫响应的顺式作用元件。使用实时荧光定量PCR测定该基因的表达谱,发现它们在不同组织中的表达有显著差异。进一步分析表明,CsGPX被低温、ABA、盐以及干旱处理上调表达,但CsGPX2和CsGPX3的表达受低温抑制。本研究为茶树CsGPX家族基因克隆和功能验证提供基础。     

茶树无色花色素还原酶基因克隆及表达分析

采用EST测序技术和3′RACE技术,获得了茶树儿茶素代谢途径中的一个重要酶—无色花色素还原酶的全长基因,在GenBank的登录号为EF205148,序列全长1 301 bp,其中开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37.5 kD,理论等电点为5.81。将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树无色花色素还原酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约60 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。同源性分析表明茶树无色花色素还原酶基因编码的氨基酸序列与其他植物具有较高的相似性,例如与亚洲棉、草莓和葡萄的相似性分别为70%、68%、71%。利用半定量PCR技术检测总儿茶素含量不同的4个茶树品种中与类黄酮合成相关的黄酮醇合成酶(FLS)、二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)、无色花色素还原酶(LAR)、花色素合成酶(ANS)等7个基因的表达情况,结果表明DFR和LAR基因的表达量与茶树中总儿茶素含量呈一定的相关性,而其他基因则与其相关性不大。     

茶树牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CsGGDPS的克隆及表达分析

以铁观音芽叶为材料,验证从茶树转录组数据库中筛选到的1条牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGDPS)的编码全长序列c DNA。该c DNA全长1 661 bp,含有1个1 137 bp完整的开放阅读框,命名为Cs GGDPS。该基因编码378个氨基酸,氨基酸序列具有类异戊二烯合成酶家族的5个保守域和2个特征功能域;序列分析显示,该c DNA与其他植物GGDPS高度保守,与三七(Panax notoginseng)的亲缘关系最近。Cs GGDPS属于不稳定、亲水蛋白,可能定位到叶绿体中,不存在跨膜结构,无信号肽,发生磷酸化的位点可能有20个;二级结构主要由α-螺旋构成,三级结构与拟南芥GGPPS11匹配度最高。实时荧光定量PCR结果表明,在茶树发育过程和不同叶位Cs GGDPS的表达量随芽叶成熟度的增加呈上升趋势,随着做青过程的进行,Cs GGDPS的表达量逐渐升高;Cs GGDPS在父本黄旦、母本铁观音和子一代金观音中均有表达,但表达量存在差异。     

茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子基因CsPPT的克隆与表达分析

以白叶1号为试验材料,通过RT-PCR和RACE技术克隆获得茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子基因CsPPT（GenBank登录号：KJ652972）。CsPPT完整ORF长度为1β227βbp,编码408个氨基酸,蛋白分子量为44.7βkDa,理论等电点为10.16;无信号肽位点,属于非分泌型蛋白;建立了茶树CsPPT蛋白的系统发育树;磷酸化修饰预测该蛋白质多肽链中共有26个磷酸化位点;TMHMM预测表明CsPPT蛋白为跨膜蛋白;亚细胞定位发现,CsPPT蛋白定位于叶绿体上,推测CsPPT蛋白可能定位于叶绿体膜上。荧光定量PCR结果表明CsPPT基因在茶树花中表达量最高,其次为芽、叶和嫩茎,根中最低。     

茶树丝氨酸羧肽酶基因的克隆及表达分析

近年来,人们发现丝氨酸羧肽酶类蛋白(SCPL)参与植物次生代谢产物的酰基转移过程,即具有转酰基功能。本研究采用RT-PCR技术,获得了3个茶树丝氨酸羧肽酶基因的全长序列;生物信息学分析表明,3个CsSCPL蛋白均包含了1个底物结合位点、3个催化作用保守区和多个N-糖基化位点,及其Ser-Asp-His三联体催化中心等SCPL家族的典型特征;进化树分析表明,3个CsSCPL可能具有酰基转移酶的功能。实时荧光定量PCR结果表明3个基因在芽叶茎根中都有表达,其中,CsSCPL1和CsSCPL3在叶中的相对表达量明显高于茎和根,而CsSCPL2则在根中高表达。本研究成功地将CsSCPL重组到表达载体pET32a(+)上进行原核表达,并对诱导时间及诱导温度进行了优化;经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,目标蛋白条带分子量为70 kD,与预测大小相符。     

茶树亲环素基因cDNA全长的分析鉴定与原核表达

通过对茶树新梢cDNA文库大量随机测序,获得了一个编码亲环素的全长基因,在GenBank登录,登录号为DQ904327。茶树亲环素基因cDNA全长949 bp,其中开放阅读框全长495 bp,编码蛋白质含有164个氨基酸,分子量约为17.47 kD,等电点约为8.54,它具备5’端非编码区的“CAAT”标志及3’端非编码区的”AATAAA”poly-A加尾信号。其推测的氨基酸序列经与26条其他生物亲环素蛋白氨基酸序列进行CLUSTAL W多序列联配并以Neighbor-Joining法进行进化树构建后,发现与水稻和小麦的相似性较高,达到85%以上。根据亲环素基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达载体pET/Csin-Cyp,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个分子量为23 kD的亲环素融合蛋白。     

茶树查尔酮异构酶基因克隆及序列分析

茶叶是世界上最流行的无酒精饮品之一,含有许多有价值的次生代谢产物,如儿茶素类物质。分离和克隆重要的茶树功能基因,对利用基因工程技术进行茶树遗传调控具有重要意义。本文采用EST测序技术和T4RNA连接酶介导的5′RACE技术,获得了一个茶树儿茶素代谢中的重要基因—查尔酮异构酶（CHI）基因,在GenBank登录（DQ904329）,其序列全长1 163 bp,其中开放阅读框长723 bp,编码240个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为26.4 kD,理论等电点为5.19。序列分析表明它与番茄CHI基因序列的亲缘关系比较近。     

茶树CsCDF1基因克隆及表达分析

采用SMART-RACE技术克隆了茶树Dof（DNA binding with one finger）基因CsCDF1的全长cDNA序列,并利用在线生物信息学软件对其进行了分析。采用实时荧光定量PCR分析该Dof基因在茶树不同组织间的表达差异和昼夜表达规律,及其在氮饥饿处理2周后对不同浓度氮素诱导的响应。该cDNA序列全长1β606βbp,包含1个编码464个氨基酸的完整开放阅读框,含有高度保守的DOF结构域,推导的蛋白分子量为50.8βkDa,理论等电点（PI）为5.52;其编码的蛋白序列与茸毛烟草、马铃薯和美花烟草的CDF蛋白（Cycling dof factor）相似性分别为69%、67%、68%。系统发育分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥CDF蛋白聚为一类,因此将其命名为CsCDF1;CsCDF1在3个不同茶树品种根系中的表达量均高于一芽二叶和成熟叶;在一天中,该基因的表达呈现出昼夜节律变化;在氮饥饿后重新供氮,不同组织中该基因对不同浓度氮素的响应均为上调。     

茶树肉桂酸4-羟基化酶基因的克隆及表达分析

肉桂酸4-羟基化酶（Cinnamate 4-hydroxylase, C4H）是茶树苯丙烷代谢途径中的关键酶,能够影响木质素和类黄酮等次级代谢物的生物合成。本文采用5′-RACE技术,克隆了茶树肉桂酸4-羟基化酶基因（CsC4H）的全长序列,其中开放阅读框长1β518βbp,编码505个氨基酸,推测蛋白分子量为58.15βkD,理论等电点为9.29。利用基因组步移技术克隆得到该基因上游1β840βbp的启动子序列。该启动子区域除了分布有TAAT-box和CAAT-box等基本转录元件外,还存在多个诱导型和组织特异型的顺式作用元件。实时荧光定量PCR结果表明该基因在芽、叶、茎、根中都有表达。将该基因重组至表达载体pYES-DEST52上,并在酿酒酵母WAT11中进行真核表达。利用LC-MS方法检测酶反应产物,结果表明目的蛋白能够催化肉桂酸生成p-香豆酸。