非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备非洲猪瘟病毒（ASFV）p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化（IHC）检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示：基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。     

非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化(IHC)检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示:基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的单克隆抗体,以原核表达的重组p30蛋白为免疫原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选,获得2株能稳定分泌抗ASFV p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2株杂交瘤细胞从第10代开始均能稳定分泌抗体,细胞上清抗体效价均为1∶6 400。亚型鉴定结果显示,2株单克隆抗体的重链均属于IgG1,轻链均为κ型。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,2株单克隆抗体均能与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞发生特异性反应。试验结果为p30蛋白生物学和诊断方法研究提供了技术支持。     

非洲猪瘟病毒H240R蛋白单克隆抗体的筛选与鉴定

为制备抗非洲猪瘟病毒(ASFV)H240R蛋白单克隆抗体,首先构建原核表达质粒pET-29b-H240R,再进行蛋白表达与纯化,随后免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术制备、间接ELISA方法筛选获得单克隆抗体。结果显示,共获得4株杂交瘤细胞株,腹水效价均高于1∶40 000;亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体(12D6、21G3、8G7)重链亚类为IgG2b, 13D2重链亚类为IgG1,轻链亚类均为k。Western blot和Dot blot鉴定结果表明,21G3、13D2株单克隆抗体识别的抗原表位为线性表位,而12D6和8G7识别的是构象表位。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,4株单克隆抗体均能特异性识别HEK293T细胞中表达的H240R蛋白。制备了ASFV H240R蛋白单克隆抗体,为H240R蛋白的表位和功能研究奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单抗制备及B细胞线性抗原表位鉴定

以原核系统表达的非洲猪瘟病毒p54重组蛋白为免疫原接种BALB/c小鼠,经过细胞融合、间接ELISA筛选和多次亚克隆获得了3株能够稳定分泌抗p54蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为2A4、5F6和RH15。3株单克隆抗体的重链均属于IgG1亚类,轻链均为Kappa型。Western blot和免疫荧光试验(IFA)证明3株单克隆抗体具有良好的反应性,可以用于靶抗原的特异性检测。通过噬菌体展示肽库筛选,确定了单克隆抗体2A4、5F6识别的抗原表位为¹⁵⁷NTASQ¹⁶¹,RH15识别的抗原表位为¹⁷⁰RQRNTYTHKDL¹⁸⁰,进一步完善了靶抗原的B细胞线性抗原表位信息。     

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体的筛选及免疫学特性鉴定

为制备非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体,并探究其免疫学特性,以真核表达的CD2v蛋白免疫BALB/c小鼠,经两次免疫后采集小鼠血清,以间接ELISA检测小鼠多抗血清效价。对血清效价最高的小鼠进行加强免疫后,取脾脏进行细胞融合。通过有限稀释法筛选能够稳定分泌CD2v单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用小鼠体内诱生腹水法和辛酸-硫酸铵法获得纯化的CD2v单克隆抗体,对其进行免疫学特性检测。间接ELISA试验显示,4号小鼠血清效价最高(1:72 900),选取该小鼠脾脏进行细胞融合,经过筛选得到4株杂交瘤细胞,分别命名为21D10、21G8、36A3和38G8,亚型鉴定均为IgG₁/κ,经检测36A3 ELISA效价最高,可达1:2.187×10⁵。免疫荧光试验显示,36A3抗体能与细胞内表达的CD2v蛋白发生特异性反应,而与携带His标签的p30蛋白无交叉反应;特异性鉴定结果显示,36A3抗体特异性良好,与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及非洲猪瘟病毒p72蛋白均无反应;亲和力检测显示,36A3抗体亲和力较高,亲和...     

猪圆环病毒2型ORF2单克隆抗体的制备与鉴定

以杆状病毒表达系统表达PCV2ORF2重组蛋白为免疫原,旨在获得针对PCV2的特异性单克隆抗体。用Sf9细胞表达PCV2ORF2重组蛋白,通过层析柱和超滤管浓缩法纯化PCV2ORF2重组蛋白。将纯化的PCV2ORF2重组蛋白免疫6周龄的雌性Balb/c小鼠,3次免疫后,取免疫后小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA筛选,经过3次亚克隆获得4株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,命名为1H9、4C11、5B8和4F12株。IFA和Western blot试验说明,4株杂交瘤细胞分泌的抗体能与ORF2重组蛋白作用。特异性试验表明,4F12株单克隆抗体与猪圆环病毒2型(PCV2KQ22株)发生特异性反应,经抗体亚型鉴定1H9、4C11和5B8 3株亚型为IgG1/Kappa,4F12株为IgG2b/Kappa,1H9、4C11、5B8和4F12株小鼠腹水效价分别为105、104、106和105。表明获得了与PCV2特异性作用的单克隆抗体。     

非洲猪瘟病毒p11.5蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

为了制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p11.5蛋白的特异性单克隆抗体,利用大肠杆菌表达系统,将密码子优化后的ASFV p11.5基因序列连接表达载体pET28a-SUMO,构建pET28a-SUMO-p11.5原核表达质粒,获得了可溶性的ASFV p11.5蛋白。经Western blot鉴定,重组ASFV p11.5蛋白可被ASFV标准阳性血清特异性识别,表明其具有良好的反应原性。将纯化后的p11.5蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞法,制备了4株可稳定分泌抗ASFV p11.5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单克隆抗体重链亚类为IgG1,1株重链亚类为IgG2a,轻链亚类均为κ。采用p11.5蛋白为包被抗原的间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价均不低于1∶102.4×10~4。经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,4株单克隆抗体,均不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒发生交叉反应,但均能与ASFV反应,表明单克隆抗体具有良好的特异性和反应性。本试验为p11.5蛋白结构功能、免疫学特性及ASFV诊断试剂产品的研究提供了重要的生物材料。     

非洲猪瘟病毒pK205R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

非洲猪瘟(ASF)传播对我国生猪养殖造成重大危害,开发用于ASF诊断产品已刻不容缓。本研究为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)pK205R蛋白单克隆抗体,构建了能表达ASFV pK205R蛋白的工程菌BL21/pET-pK205R。经IPTG诱导,可表达可溶性的pK205R蛋白。经SDS-PAGE检测,获得的蛋白大小为25 kDa左右。经Western blot鉴定,纯化后的蛋白可与ASFV阳性血清发生特异性反应。以纯化的ASFV pK205R蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备了12株针对ASFV pK205R蛋白的单克隆抗体。经间接ELISA方法鉴定,单克隆抗体的效价均不低于1∶80 000。单克隆抗体重链亚类分别为IgG1及IgG2b,轻链亚类均为κ。通过间接免疫荧光试验(IFA)测定12株单克隆抗体均不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒存在交叉反应,且均能与ASFV反应。本研究为建立快速检测非洲猪瘟病毒感染的诊断方法奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒CP312R蛋白的真核表达及单克隆抗体制备

为制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)CP312R蛋白的单克隆抗体,以真核表达ASFV的CP312R蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,并通过间接免疫荧光法(IFA)对获得的单克隆抗体进行反应性鉴定。结果利用杆状病毒表达系统(baculovirus expression system, BES)构建获得重组转移载体pOET3-CP312R,与杆状病毒基因组flashBAC^TM ULTRA共转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒AcMNPV-CP312R,且该病毒以胞内可溶形式表达出重组ASFV CP312R蛋白质。通过蛋白质印迹法鉴定显示重组CP312R蛋白可以与ASFV阳性血清发生特异性反应。此外,筛选获得2株针对重组CP312R蛋白的单克隆抗体(McAb),间接ELISA方法鉴定抗体滴度不低于1∶1 024 000。IFA试验检测表明,单克隆抗体与非洲猪瘟抗原发生特异性反应。本研究为非洲猪瘟亚单位疫苗研发及血清学检测方法的建立提供物质储备。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备

本研究利用已构建的基因工程重组菌表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2编码的Cap蛋白,纯化后作为免疫原,免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。经间接免疫荧光试验(IFA)筛选及有限稀释法进行3次亚克隆后,本试验最终获得5株稳定分泌抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为3D12、4D5、4B9、4C9和4G10。其中4D5为IgG2b亚型,其余4株单克隆抗体均为IgG1亚型,轻链类型均为κ。Western blotting鉴定结果表明获得的5株单克隆抗体均不能特异性的识别47 ku重组PCV2 Cap蛋白;对病毒感染细胞进行IFA试验,结果显示5株单克隆抗体均特异性的识别病毒抗原,表明5株单克隆抗体识别的抗原表位均为构象表位。中和试验结果表明,5株单克隆抗体均有中和活性。本试验结果为进一步探索ORF2基因的结构、功能及建立快速准确的诊断方法奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体制备与鉴定

为获得猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白单克隆抗体,选择原核表达的重组gE蛋白免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,将其脾细胞与SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,结果获得了2株能稳定分泌抗PRV gE蛋白的杂交瘤细胞,命名为E3B8和E5C11。间接ELISA检测2株杂交瘤细胞的培养上清液抗体效价为1∶6.4×10~3,腹水的抗体效价分别达到1∶3.28×10~6和1∶6.55×10~6。2株杂交瘤细胞的染色体数分别为105和108。E3B8亚类鉴定重链为IgG1,轻链为κ链;E5C11亚类鉴定重链为IgG2b,轻链为κ链。Western blot检测显示2株单克隆抗体腹水均能与PRV重组gE蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验(IFA)检测显示2株单克隆抗体均能与PRV分离毒株感染的BHK-21细胞发生特异性反应,交叉反应性检测显示2株单克隆抗体与常见病毒不发生交叉反应。表明制备的2株gE蛋白单克隆抗体效价高、特异性强,为gE蛋白结构与功能分析以及PRV免疫诊断试剂盒的开发奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的特异性单克隆抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达p54蛋白,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用纯化的p54蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。经4次亚克隆后,取杂交瘤细胞上清进行单克隆抗体亚型鉴定,利用体内诱生法制备单克隆抗体并进行纯化。间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价,利用交叉反应性试验、间接免疫荧光试验和蛋白印迹对所获单克隆抗体的特异性进行鉴定。根据预测的p54蛋白二级结构,采用逐步截短法分析鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域,并在p54的三级结构中进行标注。结果显示：成功筛选了6株分泌p54单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为28G12-1、31G7-1、31G7-2、35F10-1、35F10-2、38D3-1。其中28G12-1、31G7-1、31G7-2重链为IgG2a型,35F10-1、35F10-2、38D3-1重链为IgG1型;轻链均为κ链。单克隆抗体的最低效价为1∶25 600,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪急性腹泻综...     

A型塞内卡病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗A型塞内卡病毒(SVA)VP1蛋白的单克隆抗体,并初步应用于A型塞内卡病毒的检测,本研究构建了SVA VP1原核重组表达质粒pET30a-GST-VP1(528 bp)。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞并大量表达VP1重组蛋白,利用纯化的VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)进行融合,经过细胞亚克隆筛选,获得杂交瘤细胞。将其选为腹水生产细胞株,最后纯化单克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光试验对其进行鉴定。结果显示,本研究获得1株能够稳定分泌抗VP1重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,其亚型重链为IgG2a、轻链为Kappa链;Western blotting和间接免疫荧光检测显示,该单克隆抗体能够特异性识别SVA病毒粒子。本研究成功制备的抗SVA VP1蛋白单克隆抗体可为进一步研究A型塞内卡病毒VP1蛋白的生物学功能及A型塞内卡病毒致病机制提供有效途径。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及其单克隆抗体制备

本研究以猪流行性腹泻病毒(PEDV)全基因组为模板,利用RT-PCR方法扩增PEDV S基因的亲水区,将其克隆至pMAl-c2E原核表达载体,获得重组质粒pMAl-c2E-PEDV-S。经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切测序鉴定后,转化BL21菌,经IPTG诱导,成功表达了约74 kDa的重组蛋白MBP-PEDV-S,亲和层析法纯化重组蛋白。将重组蛋白免疫3只健康的6～8周龄雌性BALB/c小鼠,将小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,获得了4株能稳定分泌抗PEDV S蛋白抗体的杂交瘤细胞株1B11、1B10、1C8、3L3,其腹水效价都高于1∶100 000。获得的4株单克隆抗体与PEDV经IFA和Western blot检测,结果显示均具有良好的反应性。而且3株单克隆抗体重链为IgG2a,1株重链为IgG2b;3株轻链为Kappa,1株轻链为Lambda。本研究表达了PEDV S蛋白并制备了单克隆抗体,为研究S蛋白的结构和功能提供了条件,为揭示PEDV致病机制奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p72重组蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

为了建立一种快速检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的方法，试验利用GenBank中ASFV的p72基因(登录号为MK128995.1)序列构建原核重组表达质粒pGEX-6P-1-p72和真核重组表达质粒pCAGGS-myc-p72,通过大肠杆菌原核表达系统获得p72重组蛋白，将其纯化后免疫小鼠，获得阳性杂交瘤细胞，通过Western-blot和间接免疫荧光鉴定筛选单克隆细胞株，并用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定各单克隆抗体的亚型。通过对p72兔源多克隆抗体包被浓度及纯化的3株单克隆抗体稀释度进行优化，初步建立检测ASFV的双抗体夹心ELISA方法，并用该方法测试纯化的3株单克隆抗体分别与p72兔源多克隆抗体两两组合后所能检测的p72重组蛋白的灵敏度。结果表明：p72重组蛋白大小为99 ku;以纯化的原核表达的p72重组蛋白作为抗原免疫3只小鼠，抗体效价均大于1∶10 000;经细胞融合、克隆和筛选共获得5株阳性杂交瘤细胞，将其分泌的单克隆抗体分别命名为2C4C8、2C4B8、5C11F11、5C11D12、7D10C9,5株单克隆抗体与真核...     

副流感病毒5型SH蛋白单克隆抗体的制备

为获得副流感病毒5型SH蛋白的单克隆抗体，将构建的重组表达质粒pET43a-SH转化BL21(DE3)plys，经IPTG诱导表达、过镍柱纯化后将重组蛋白作为免疫原，免疫8周龄Balb/c雌性小鼠，并按常规方法制备杂交瘤细胞。通过间接免疫荧光方法进行筛选，获得3株杂交瘤细胞株，命名为5B9、3G8、4E11，并进行了培养特性、分泌抗体活性、分泌抗体亚类的鉴定。结果显示：3株细胞株连续传代10代均稳定分泌单克隆抗体，细胞上清液IFA效价稳定，分泌单克隆抗体亚型均为IgG2a。制备并纯化了1株(5B9)单克隆抗体，浓度为4.26 mg/mL，纯度不低于90%，IFA效价不低于1∶2000，与猪牛等常见病毒均无交叉反应。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

用基因工程表达的牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白免疫Balb／C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选,获得3株稳定分泌抗BVDVNS3蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株（1A9、2C3和5D5）,其细胞培养上清液ELISA效价分别为1：256、1：128和1：256,腹水ELISA效价分别为1：128000、1：64000和1：128000。亚型鉴定表明,1A9、2C3和5D5分别为IgG1、IgG2a和IgG1、ELISA结果显示,3株单克隆抗体仅与BVDVNS3蛋白和BVDV反应,不与其它相关病毒反应,表明3株单克隆抗体特异性良好。这3株单克隆抗体的获得为建立BVDV免疫学检测方法奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Rep蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

本研究旨在制备猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白单克隆抗体。PQE30-PCV2Rep蛋白在IPTG的诱导下表达,用SDS-PAGE对表达产物进行检测。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,ELASA法鉴定抗体亚型及效价。结果显示重组蛋白PQE30-PCV2Rep得到高效表达,筛选获得了3株稳定分泌抗Rep蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系1G4、2G4和6H12,其分泌的抗体分别为IgG2a、IgG2b、IgG2b亚型。其中,6H12抗体效价为256K,浓度为0.47mg/mL,纯度90%。本研究制备的单克隆抗体有较好的生物学特性,为PCV2的研究及快速诊断提供了新的方法。     

鸭呼肠孤病毒p18重组蛋白表达、纯化及其单克隆抗体制备

研究旨在制备DRV p18蛋白单克隆抗体。试验通过原核表达并纯化DRV p18重组蛋白,经BCA蛋白浓度测定后免疫BALB/c小鼠;通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞,获得的p18单克隆抗体通过ELISA、IFA和Western blot试验进行鉴定,并将杂交瘤细胞腹腔注射小鼠获得单抗腹水,通过Western blot试验验证其特异性。结果显示：纯化的重组p18蛋白浓度为1.37 mg/mL,经过三轮亚克隆获得4株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E3、2C4、4A2和4D4,亚型鉴定1E3和4D4重链为IgG1型、2C4重链为IgM型、4A2为IgG2b型,轻链均为κ型;4株单克隆抗体均能使感染DRV的BHK-21细胞发出特异性荧光,并在18 ku处存在特异性条带;4D4腹水ELISA效价为1∶409 600,Western blot效价达1∶102 400,IFA效价为1∶51 200;4D4与DRV反应,而不与其他禽源常见病毒反应。研究成功制备了抗DRV p18蛋白的单克隆抗体,为进一步研探究p18蛋白的功能奠定基础。