冠突散囊菌和植物乳杆菌联合发酵对绿茶液态饮料品质的影响

为了抑制冠突散囊菌发酵绿茶液态饮料中儿茶素的降解,本研究采用植物乳杆菌和冠突散囊菌对绿茶液态饮料进行联合发酵,试验通过响应面法优化了联合发酵绿茶液态饮料工艺,并采用高效液相色谱（HPLC）法和顶空固相微萃取串联气质联用（HS-SPME/GS-MS）法分别检测了联合发酵绿茶液态饮料中儿茶素含量和香气成分。结果表明,在干茶添加量10βg·L^-1、冠突散囊菌添加量10βmL·L^-1的前提下,联合发酵绿茶液态饮料的最佳工艺条件为植物乳杆菌添加量20βmL·L^-1、蔗糖添加量75βg·L^-1、30℃下静置发酵3βd。在此工艺下联合发酵绿茶液态饮料中总儿茶素含量为1β419.94βμg·mL^-1,与冠突散囊菌发酵绿茶液态饮料（848.72βμg·mL^-1）相比,显著增加（P<0.05）;且醇类化合物（30.27%）、醛类化合物（15.25%）、烃类化合物（11.35%）、酯类化合物（9.86%）和酮类化合物（9.01%）含量与未发酵绿茶液态饮料相比均显著增加（P<0.05）。     

超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法测定茶叶中21种农药残留量

采用超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱,建立了茶叶中21种农药残留量的检测方法。茶叶样品经甲醇和水（V_甲醇∶V_水=1∶1）提取后,采用乙二胺-N-丙基硅烷和强阳离子交换剂作为混合吸附剂进行萃取净化。以C₁₈色谱柱进行色谱分离,采用Full Scan扫描模式进行定性、定量分析。结果显示,21种农药在0.5~200βμg·L^-1范围内均呈良好的线性关系,相关系数（r²）大于0.99。在10、50、100βμg·kg^-1 3个加标水平下,平均回收率为70%~125%之间,相对标准偏差（RSD）小于15%,定量限为10βμg·kg^-1。本方法操作简单快速,灵敏度高,适用于茶叶中21种农药残留检测。     

茶氨酸生物合成工程菌构建

通过PCR扩增E.coli DH5α的γ-ggt基因,产物经纯化后用Kpn I和Xho I双酶切,回收γ-谷氨酰转肽酶基因目的片断,并与经相同双酶切的表达载体pET-32a连接,得到重组质粒pET-GGT。将重组质粒转化到E.coli BL21中,获得工程菌。工程菌株经0.05βmol/L IPTG,32℃诱导表达,湿菌体的酶活达到2.0βU/g,大约是出发菌株E.coli DH5α的15倍。工程菌催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的产量达到29.40βg/L,L-Gln的转化率为48.22%,其催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的能力比出发菌株E.coli DH5α提高了100多倍。     

大规模悬浮培养茶叶细胞合成茶氨酸培养基组成优化研究

婺源绿茶嫩叶用MS培养基（加IBA 2βmg/L,6-BA 4βmg/L,盐酸乙胺25βmmol/L）进行茶叶愈伤组织悬浮培养,采用正交试验设计研究了培养基不同组成条件对茶叶细胞大规模悬浮培养过程中细胞生长与茶氨酸合成的影响。结果显示,整个培养周期中,细胞收获量和茶氨酸积累量峰值出现时间为培养的第19~22βd;在NH₄⁺/NO₃^- 1.0/60.0βmmol/L、K⁺ 100.0βmmol/L、Mg²⁺ 3.0βmmol/L、H₂PO₄^- 3.0βmmol/L、蔗糖30.0βg/L、水解酪蛋白2.0βg/L条件下,茶叶细胞生长量和茶氨酸积累量分别可达到16.33βg/100βml培养液和3.357βg/100βml培养液;提高培养基中水解酪蛋白浓度可使细胞对数生长期和稳定期得到延长,并有利于茶氨酸积累;H₂PO₄^-浓度主要影响细胞生长速率和茶氨酸积累速率的同步性,低H₂PO₄^-浓度环境中茶氨酸积累速率峰值滞后于细胞增长速率峰值,高H₂PO₄^-浓度环境中早于细胞生长速率峰值出现时间;K⁺ 和蔗糖对细胞生长的影响均不明显;Mg²⁺对细胞生长产生明显的影响;NH₄⁺/NO₃^-对茶氨酸合成具有非常显著的影响。从生产效率考虑,培养周期以19~22βd为宜。     

固相萃取-GC/LC-MS/MS测定茶叶中79种农药残留

建立了一套以一次固相萃取前处理方法,运用气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）两种检测技术,测定茶叶中79种农药残留的可靠、快速、高通量检测方法。该方法用20βmL乙腈一次均质提取,分取提取液10βmL,用乙腈+甲苯（3∶1）20βmL洗脱过Carbon/NH₂小柱净化,用5βmL乙腈定容混匀,于GC-MS/MS和LC-MS/MS同时检测。结果表明,79种农药在0.01~0.40βmg·L^-1范围内线性良好,相关系数（R²）在0.995以上;高、低、中3种水平加标回收率在67.3%~130.8%内;相对标准偏差（RSD）在15%内;98.7%的农药定量限（LOQ）≤0.01βmg·kg^-1;使用多种类茶叶实际检测,结果均合格。因此,该方法能同时检测含有机磷、有机氯、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类和有机杂环类5大类农药,更有利于大批量茶叶样品的多农残检测。     

LED黄光对工夫红茶萎凋过程香气相关酶基因表达及活性影响

将政和大白茶鲜叶置于LED黄光下照射萎凋16βh,以室内萎凋为对照,按工夫红茶工艺制成毛茶。对萎凋过程中萎凋叶的β-葡萄糖苷酶基因（CsBG1、CsBG2）、β-樱草糖苷酶基因（CsBP）的相对表达量、β-葡萄糖苷酶的活性,及毛茶挥发性香气组分进行分析,结合感官审评,研究黄光萎凋对工夫红茶品质的影响。结果表明,在LED黄光萎凋下,CsBG1、CsBG2表达量明显提高,萎凋第6βh CsBG2相对表达量最高,显著高于对照组;CsBP在黄光萎凋全过程呈上调表达。LED黄光前期促进萎凋叶香气相关酶基因上调表达,在萎凋后期调控β-葡萄糖苷酶活性提高,最终使得工夫红茶甜花香显现,品质提升。     

发酵豆乳主要乳酸菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测发酵豆乳中主要乳酸菌植物乳杆菌、副干酪乳杆菌含量,建立实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法。根据植物乳杆菌、副干酪乳杆菌保守区域设计特异性引物和探针,验证建立的实时荧光定量PCR法的特异性、灵敏度和重复性,并与国标法进行比较。结果表明:引物特异性强,实时荧光定量PCR法特异性及重复性较好;植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的检验灵敏度分别达到1.3×10^-4和1.0×10^-5 ng·μL^-1。分别建立植物乳杆菌和副干酪乳杆菌标准菌株的实时荧光定量PCR检验法的标准曲线,得出R²分别为0.994 3和0.999 6,表明线性关系较好,可进行发酵豆乳中2种菌株含量的检测,测得供试发酵豆乳中植物乳杆菌与副干酪乳杆菌比例为4∶1。实时荧光定量PCR法测得发酵豆乳中乳酸菌总量为(5.5±0.26)×10⁹ CFU·mL^-1,国标法检测为(5.3±0.43)×10⁹ CFU·mL^-1,2种方法检测结果无差异(P>0.05...     

毛细管电泳分析茶黄素的方法研究

研究了毛细管电泳分析茶黄素类组分的最佳条件。结果表明：在250βmmol/L H₃BO₄、10βmmol/L KH₂PO₄、0.75βmmol/L SDS和20％(v/v)乙腈组成的pH7.5电泳介质中,选择25βkV电压、20℃柱温和200βnm波长检测,可在10βmin以内将茶叶中的四种主要茶黄素单体分离,并获得较高的检测灵敏度。四种茶黄素单体浓度与峰面积值之间的相关系数r=0.9945~0.9990,检测下限在0.53~0.64βμg/ml之间,加标回收率为92.50%~108.36%,变异系数≤2.67%。本方法快速、准确,可用于实际样品的测定。     

茶树CsMDHAR基因的克隆与非生物胁迫响应分析

基于茶树转录组数据,以龙井43茶树cDNA为模板,克隆得到开放阅读框（ORF）长度为1β305βbp,编码434个氨基酸的茶树单脱氢抗坏血酸还原酶基因,命名为CsMDHAR。蛋白序列特征和基因表达模式分析表明,CsMDHAR蛋白含有FAD结合功能域,属于FAD依赖的吡啶核苷酸-硫基氧化还原酶（Pyr-redox-2）家族。该蛋白有两个无序化区域,而且包含有32个磷酸化位点,理论相对分子量为47.21βkDa,pI为5.99,属于亲水性蛋白;CsMDHAR蛋白二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。通过PlantCARE和PLACE对启动子上游调控元件进行分析预测,结果显示,CsMDHAR基因启动子上游1β000βbp中含有多个与光、激素以及植物抗逆有关的顺式作用元件。利用荧光定量PCR方法检测龙井43和迎霜的CsMDHAR、CsAO和CsAPX在4种不同非生物胁迫下的表达水平,结果表明,在低温（4℃）胁迫下,两个茶树品种的CsMDHAR、CsAO和CsAPX的表达均受抑制,且品种间的差异较小;在高温（38℃）和干旱（200βg·L^-1 PEG）胁迫下龙井43中的CsMDHAR表达均上调,分别在8βh和2βh时达到最大值,为对照的1.49倍和1.85倍;盐（200βmmol·L^-1 NaCl）胁迫下,CsAO和CsAPX在两种茶树品种中的表达量变化趋势相似,但变化幅度不同,可能与品种间不同的抗逆性有关。     

陈年茯砖茶多酚类对老年人肠道菌群的影响研究

为了揭示陈年茯砖茶多酚类对老年人肠道菌群多样性及结构的影响,从陈放1年及7年的茯砖茶中提取、纯化茶多酚,将等量茶多酚的提取物分别加入含有65岁老年人的肠道菌群混合培养基中进行体外静态厌氧培养,在0βh、4βh、8βh、12βh及24βh时对7年陈茶多酚组（O组）、1年陈茶多酚组（N组）及空白组（B组）进行茶多酚和短链脂肪酸（SCFAs）的含量测定,并进行肠道菌群的高通量测序,对测序结果进行生物信息学分析。结果显示,7年陈茯砖茶的茶多酚类在与老年人肠道菌群的体外互作下,SCFAs的含量较对照组显著提高,老年人肠道菌群的丰度及多样性水平也有所提升。在4βh及12βh时,能明显降低埃希氏菌属（Escherichia）及γ-变形菌纲_B38（γ-Proteobacteria_B38）的相对丰度,同时提高拟杆菌属（Bacteroides）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）及普拉梭菌属（Faecalibacterium）的相对丰度。研究表明,7年陈茯砖茶的茶多酚类比1年陈茯砖茶的茶多酚类更有益于改善老年人的肠道菌群结构,在老年人的营养保健方面更具潜在的价值。     

茶树Na+/H+逆向转运蛋白基因CsNHX1、CsNHX2的克隆及表达分析

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白（Na⁺/H⁺ antiporter,NHX）在植物生长发育与逆境响应过程中扮演着重要角色。本研究以龙井长叶茶树品种为材料,克隆获得了茶树CsNHX1和CsNHX2基因cDNA全长序列,GeneBank登录号分别为：MG722977和MG515211。生物信息学分析结果显示,CsNHX1和CsNHX2的cDNA全长分别为1β691βbp和1β757βbp,均包含1个1β626βbp的开放阅读框,编码541个氨基酸,预测分子量为59.5βkD和59.7βkD,理论等电点为7.07和8.79;蛋白序列分析结果显示,CsNHX1和CsNHX2属于典型的跨膜蛋白,均含有保守的Na⁺/H⁺ Exchanger结构域;进化树分析显示,CsNHX1和CsNHX2均为IC类中定位于液泡膜上的Class I成员。qRT-PCR结果显示,干旱、低温和盐胁迫能够显著诱导CsNHX1和CsNHX2上调表达;外源ABA处理下,CsNHX1和CsNHX2表达水平整体变化趋势不显著;高温胁迫处理下,茶树CsNHX1表达水平显著降低,而CsNHX2表达水平逐渐增加,表明茶树CsNHX1和CsNHX2参与了茶树对多种环境胁迫的响应过程,但对于不同逆境胁迫的应答模式存在一定差异。     

茶树细胞色素P450基因CYP71A26与CYP71B34的克隆及差异表达特征分析

利用NCBI茶树转录组数据库,以铁观音芽叶为材料,克隆了茶树细胞色素P450基因CYP71A26与CYP71B34的cDNA全长。CYP71A26与CYP71B34的cDNA全长分别为1β879βbp和1β764βbp,分别含有1β539βbp（编码513个氨基酸）和1β533βbp（编码511个氨基酸）的完整开发阅读框。氨基酸序列比对结果显示,CYP71A26与CYP71B34的同源性为42.47%,为2个亚家族基因。氨基酸结构分析表明,2个基因均具有植物P450的螺旋C（Helix C）、螺线I（Helix I）、螺线K（Helix K）、“Meander”区域序列和血红素结合域（Heme binding domain）的典型结构。进化树分析显示,CYP71A26与CYP71B34在分子进化树上分属两大分支,2个基因与其他物种亲缘关系的远近不同。三级结构模拟与功能域分析显示,CYP71A26与CYP71B34主要由N端的β折叠和C端的α螺旋结构组成,且2个基因均具有一个P450蛋白结构域（Pfam domain）。荧光定量PCR结果表明,CYP71A26与CYP71B34基因在不同茶树害虫为害的叶片中,分别表现出上调和下调表达的现象。而在冷热环境下,CYP71A26与CYP71B34基因分别表现出下调和上调表达的现象。表明茶树CYP71A26与CYP71B34基因均参与了生物（害虫）与非生物（温度）的胁迫响应,但两个基因表达相反,参与环节可能相反。     

茶树PPO基因家族的鉴定与分析

多酚氧化酶（Polyphenol oxidases,PPO）是由核酸编码的一种以氧为受体的含铜金属酶,为一种末端氧化酶,在茶叶加工中也发挥重要的作用。从最新发布的茶树基因组数据库中获得了5条PPO基因：CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3、CsPPO4（GenBank登录号为GQ129142.1）、CsPPO5。本研究利用生物信息学方法,对5条基因的核酸序列和氨基酸序列进行分析,并对基因编码蛋白的理化性质和结构功能进行预测。结果表明,5个基因CDS区全长在597~1β839βbp之间,编码氨基酸数目198~612;系统进化树分析显示CsPPO1、CsPPO3、CsPPO4和CsPPO5具有较近的亲缘关系;编码的蛋白均属于亲水性不稳定类脂类结合蛋白,都不具有信号肽;无规则卷曲是蛋白质的主要结构元件,α-螺旋和β-折叠分散于整个多肽链中,CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3可能存在一个或多个跨膜螺旋;5个蛋白均含有PPO1_DWL（pfam12142）保守结构域,除了CsPPO2外,其余4个蛋白均预测到TYROSINASE功能结构域。实时定量PCR结果表明,PPOs基因在不同茶树品种间呈现出不同的表达模式。     

混菌发酵绿茶产脂肪酶及其对酯型儿茶素的水解作用分析

微生物的发酵作用导致黑茶加工过程中儿茶素的生物转化和总茶多酚含量的下降,这一转化过程的代谢途径和调控机制尚不清楚。通过添加冠突曲霉(Aspergillus cristatum)菌株PE-1和黑曲霉(A. niger)菌株PE-4混合发酵绿茶,采用鉴别培养基平板检测、酶活性测定和酶蛋白分离纯化,研究脂肪酶活性及其对酯型儿茶素的水解作用。两个菌株单菌发酵和混合菌种发酵绿茶条件下均可以检测到脂肪酶活性,混菌发酵酶活力高于两个菌株单菌发酵的酶活力。混菌发酵条件下获得一个分子量约为37 kDa的脂肪酶,对EGCG和ECG有不同的生物转化作用。UPLC检测结果表明,该脂肪酶对EGCG有较好的底物选择性,EGCG的水解率为94.46%,EGC的产率为63.33%;ECG的水解率为15.45%,EC的产率为4.15%。脂肪酶对EGCG和ECG的生物转化将为儿茶素代谢途径的研究和单体儿茶素的生产起到促进作用。     

冠突散囊菌LJSC.2005对茯茶主体黑毛茶发花品质影响

为探究冠突散囊菌LJSC.2005对湖南茯茶主体黑毛茶发花品质的影响,通过感官审评、生化成分分析和顶空固相微萃取法（HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术,对由湖南主要茶树品种制成的6个黑毛茶及其通过冠突散囊菌LJSC.2005统一发花获得的发花散茶进行品质分析。感官审评结果表明,与黑毛茶相比,发花散茶金花满披、色泽加深,条索更加平伏、卷紧,茶汤颜色加深,滋味由涩味转为醇和,香气由晒青毛茶花果香、七星灶松烟香转化为浓郁纯正的菌花香。生化成分分析表明,发花散茶黄酮、茶多酚、游离氨基酸、儿茶素和槲皮素等滋味成分含量较黑毛茶普遍下降,可溶性糖和杨梅素有下降趋势。HS-SPME/GC-MS分析结果中,所有茶样共检测到71种香气成分,其中碳氢化合物14种、醇类16种、醛类10种、酮类10种、酯类6种、酚类4种、内酯类1种、含氮化合物6种、含氧化合物4种。苯乙烯和异丁酸叶醇酯为黑毛茶共有香气成分;(E)-芳樟醇3,7-氧化物、异植物醇和苯乙酮为发花散茶共有香气成分。与黑毛茶香气成分相比,水杨酸甲酯、(E)-氧化芳樟醇（呋喃类）、(E)-芳樟醇3,7-氧化物、β-紫罗兰酮、异丁酸叶醇酯等16种成分为冠突散囊菌LJSC.2005发花后特征香气组分。     

信阳茶区柿广翅蜡蝉越冬种群的发生与为害规律

不仅调查了粗放和精细两种管理模式茶园内柿广翅蜡蝉越冬产卵刻痕对茶枝的为害情况,还调查统计了其越冬产卵时对茶枝直径的选择情况,以及在茶枝上越冬产卵部位、产卵刻痕长度和相应的着卵量。研究表明,两个粗放管理茶园内茶枝的受害率（9.86%、13.79%）均显著高于精细管理茶园,柿广翅蜡蝉成虫偏向于在直径为0.20~0.30βcm的茶枝上产卵越冬,而且产卵刻痕顶端至茶枝芽头的平均距离为7.22βcm,产卵刻痕长度平均值为1.35βcm。此外,柿广翅蜡蝉越冬产卵刻痕长度（x）与刻痕内着卵量（y）之间呈显著正相关关系,满足方程：y=17.83x+1.12（F=3β652,df=1β145,R²=0.96,P<2.2×10^-16）。建议每年10月初到次年3月下旬,应及时剪除受越冬卵刻痕为害的茶树嫩枝条并加强茶园管理,以实现柿广翅蜡蝉越冬种群的区域性控制。本研究为信阳茶区柿广翅蜡蝉越冬种群的预测预报和生态防控提供了理论依据,对减少茶园农药用量以及提高“信阳毛尖”的产量和品质具有非常重要的意义。     

茶鲜叶中多环芳烃类化合物的分布特性研究

利用高效液相色谱法分析了不同季节、不同茶树品种、不同部位茶鲜叶中16种多环芳烃（PAHs）的分布特性。结果表明,3个茶树品种,以政和大白茶鲜叶原料中PAHs的含量和标准偏差值最小,平均含量为126.92 μg·kg^-1,偏差值为17.59 μg·kg^-1;不同部位茶鲜叶中PAHs含量及标准偏差值表现为芽<第二叶<第四叶<第六叶,芽头PAHs含量为119.13 μg·kg^-1,标准偏差值为14.36 μg·kg^-1;不同季节茶鲜叶中PAHs含量及标准偏差值呈现秋<春<夏的分布特性,秋季茶鲜叶中PAHs的含量为112.75 μg·kg^-1,标准偏差值为11.97 μg·kg^-1;同时茶鲜叶中16种PAHs主要以2、3环PAHs为主,占PAHs总量的80%左右,4~6环PAHs相对较少。