茶树CsMDHAR基因的克隆与非生物胁迫响应分析

基于茶树转录组数据,以龙井43茶树cDNA为模板,克隆得到开放阅读框（ORF）长度为1β305βbp,编码434个氨基酸的茶树单脱氢抗坏血酸还原酶基因,命名为CsMDHAR。蛋白序列特征和基因表达模式分析表明,CsMDHAR蛋白含有FAD结合功能域,属于FAD依赖的吡啶核苷酸-硫基氧化还原酶（Pyr-redox-2）家族。该蛋白有两个无序化区域,而且包含有32个磷酸化位点,理论相对分子量为47.21βkDa,pI为5.99,属于亲水性蛋白;CsMDHAR蛋白二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。通过PlantCARE和PLACE对启动子上游调控元件进行分析预测,结果显示,CsMDHAR基因启动子上游1β000βbp中含有多个与光、激素以及植物抗逆有关的顺式作用元件。利用荧光定量PCR方法检测龙井43和迎霜的CsMDHAR、CsAO和CsAPX在4种不同非生物胁迫下的表达水平,结果表明,在低温（4℃）胁迫下,两个茶树品种的CsMDHAR、CsAO和CsAPX的表达均受抑制,且品种间的差异较小;在高温（38℃）和干旱（200βg·L^-1 PEG）胁迫下龙井43中的CsMDHAR表达均上调,分别在8βh和2βh时达到最大值,为对照的1.49倍和1.85倍;盐（200βmmol·L^-1 NaCl）胁迫下,CsAO和CsAPX在两种茶树品种中的表达量变化趋势相似,但变化幅度不同,可能与品种间不同的抗逆性有关。     

茶树生长素受体基因CsTIR1的克隆与表达分析

吲哚-3-乙酸（又称IAA或生长素）,在植物生长发育中具有重要的调控作用,其作用主要通过信号转导途径来完成。生长素受体是其信号转导的关键元件之一。本研究通过RACE克隆,获得了茶树中生长素受体CsTIR1基因的cDNA全长序列（NCBI登录号：JX050147）。CsTIR1序列全长2β315βbp,含1β746βbp的完整开放阅读框,编码581个氨基酸,预测分子量65.18βkD,理论等电点（pI）5.64。茶树CsTIR1与烟草TIR1的相似性最高达82%,亲缘关系最近。CsTIR1含有1个F-box结构域和6个LRR结构域,三级结构形如“蘑菇状”。CsTIR1在茶树的根、茎、叶和花中具有组织表达特异性;其表达受IAA诱导,3种不同浓度的IAA均能诱导CsTIR1上调表达,且在50βμmol·L^-1浓度下表达量最大;ABA、GA3、MeJA和BR等激素也能够显著上调其表达;CsTIR1在越冬休眠芽中的表达量低,在活跃期中上调表达。     

茶树细胞色素P450基因CYP71A26与CYP71B34的克隆及差异表达特征分析

利用NCBI茶树转录组数据库,以铁观音芽叶为材料,克隆了茶树细胞色素P450基因CYP71A26与CYP71B34的cDNA全长。CYP71A26与CYP71B34的cDNA全长分别为1β879βbp和1β764βbp,分别含有1β539βbp（编码513个氨基酸）和1β533βbp（编码511个氨基酸）的完整开发阅读框。氨基酸序列比对结果显示,CYP71A26与CYP71B34的同源性为42.47%,为2个亚家族基因。氨基酸结构分析表明,2个基因均具有植物P450的螺旋C（Helix C）、螺线I（Helix I）、螺线K（Helix K）、“Meander”区域序列和血红素结合域（Heme binding domain）的典型结构。进化树分析显示,CYP71A26与CYP71B34在分子进化树上分属两大分支,2个基因与其他物种亲缘关系的远近不同。三级结构模拟与功能域分析显示,CYP71A26与CYP71B34主要由N端的β折叠和C端的α螺旋结构组成,且2个基因均具有一个P450蛋白结构域（Pfam domain）。荧光定量PCR结果表明,CYP71A26与CYP71B34基因在不同茶树害虫为害的叶片中,分别表现出上调和下调表达的现象。而在冷热环境下,CYP71A26与CYP71B34基因分别表现出下调和上调表达的现象。表明茶树CYP71A26与CYP71B34基因均参与了生物（害虫）与非生物（温度）的胁迫响应,但两个基因表达相反,参与环节可能相反。     

茶树CsMYB基因启动子的克隆与功能分析

以茶树新品系“1005”嫩芽为材料,克隆得到CsMYB基因gDNA全长序列1β828βbp,通过染色体步移技术,分离得到CsMYB基因启动子片段1β038βbp,命名为proMYB。生物信息学分析表明,CsMYB gDNA由2个内含子和3个外显子组成,该启动子含有与提高基因转录水平相关的5′UTR Py-rich stretch顺式作用元件、启动子核心元件TATA-box和CAAT-box,还存在有激素响应元件、光响应元件、逆境应答元件以及大量功能未知或功能特异的顺式作用元件,说明proMYB具有诱导型启动子特性,CsMYB基因在茶树植物体中可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号传导;通过烟草的瞬时表达结果表明,该启动子能驱动下游基因表达,具有启动子活性。     

茶树CsPAL3基因cDNA全长克隆及其表达分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）由多基因家族编码,是花青素等多酚物质合成途径的起始酶,对其合成具有调控作用。本研究以紫化茶树武夷奇种C18茶树为材料,采用RACE技术克隆获得CsPAL基因cDNA,命名为CsPAL3（登录号为KY865305）,分析其生物信息学特征,并检测不同叶色茶树品种（系）中的花青素总量及茶树PAL家族成员基因的表达情况。结果表明,获得CsPAL3基因全长cDNA为2β518βbp,包含一个完整的2β130βbp开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,编码709个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定亲水性蛋白,预测分子量为77.40βkD,理论等电点为6.26;Blast分析序列发现CsPAL3与芒果的MiPAL相似性最高,为87%。而在同源进化树分析中与芍药的PiPAL亲缘关系较近。紫化茶树的花青素总量和CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因表达量均高于常规绿叶茶树和白化茶树。这表明茶树CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因上调表达可能促进茶树花青素合成积累,使得茶树叶片呈现紫色。     

茶树GAGP基因克隆及表达分析

采用SSH技术分析了VA菌根处理后福鼎大白茶根系基因差异表达情况,获得了差异序列,序列比对显示,在下调表达序列中可能包含了10种未知功能的基因;在上调表达序列中可能包含了5种可能的基因。采用RACE技术获得GAGP基因长3β146βbp（GenBank,登录号KJ946251）,具有2β769βbp开放阅读框（1^st~2β769^th）,编码923个氨基酸。分子生物信息学分析表明,GAGP蛋白分子量约106.9βkD,等电点为8.42,定位于线粒体内。定量PCR分析表明,GAGP在茶树叶片中表达强度存在明显的品种差异,GAGP对生物性和非生物性胁迫均有明显响应。     

茶树小G蛋白CsRAC5基因的克隆与低温胁迫下的表达分析

小G蛋白是一类重要的信号转导蛋白,参与植物的各项生命活动,但目前在茶树中的研究尚少。本研究以茶树品种龙井长叶为实验材料,克隆获得1个小G蛋白基因,命名为CsRAC5。序列分析显示,CsRAC5含有597βbp,编码198个氨基酸,具有Rho蛋白的保守结构域;序列多重比对发现,该序列与其他物种序列的一致性高达95.96%。CsRAC5蛋白质的相对分子质量为21.79βkDa,为亲水性蛋白;烟草瞬时表达实验显示,CsRAC5定位于细胞膜和细胞核中。荧光定量PCR结果显示,CsRAC5在茶树中的表达具有明显的组织特异性,其中在叶片中的表达最高,在花粉中的表达最低;低温（4℃）胁迫抑制茶树叶片中CsRAC5的表达。     

茶多酚诱导铜绿假单胞菌交叉耐受性研究

检测了亚致死浓度的茶多酚（Tea Polyphenols,TP）处理对铜绿假单胞菌交叉耐受性的诱导作用。铜绿假单胞菌暴露于1βmg·mL^-1茶多酚1βh后能够显著增强细菌对多种环境条件的耐受性,包括氧化剂（1βmmol·L^-1 H₂O₂）、高温（47℃）,及酸性溶液[磷酸缓冲液（pH4.0）、含有有机酸（60βmmol·L^-1柠檬酸、60βmmol·L^-1乳酸、80βmmol·L^-1乙酸）的磷酸缓冲液（pH4.0）]。另外,通过荧光定量RT-PCR技术分析了茶多酚诱导下铜绿假单胞菌胁迫相关基因的表达情况。研究发现,茶多酚能够显著诱导铜绿假单胞菌氧化胁迫相关基因katB、sodM、ohr、lexA和recN的表达,以及热激蛋白基因dnaK、groEL、htpG、grpE和groES的表达。这些胁迫相关基因的表达很可能在细菌交叉耐受性形成过程中起到重要作用。以上研究结果表明,虽然茶多酚作为天然食品添加剂具有较高的安全性,但在实际应用过程中应充分考虑茶多酚诱导细菌交叉耐受性所导致的潜在风险,以优化食品保鲜策略。     

茶树CsbHLH2基因克隆及表达分析

植物bHLH（碱性螺旋环螺旋）转录因子是植物体内一类重要的转录因子,在植物的生长发育以及胁迫应答过程中发挥着重要的调控作用。本研究以茶树品种陕茶一号为材料,采用同源克隆法从陕茶一号叶片cDNA中克隆了1个bHLH转录因子CsbHLH2。生物信息学分析表明,CsbHLH2开放阅读框（ORF）为714βbp,编码1个297个氨基酸的蛋白,预测分子量58.4βkD,等电点为5.14,氨基酸序列比对显示该蛋白与其他高等植物的bHLH蛋白具有较高同源性。拟南芥原生质体亚细胞定位表明,CsbHLH2编码蛋白定位在细胞核上。实时荧光定量PCR结果分析表明,CsbHLH2基因在茶树不同组织部位中均有表达,但是在幼叶中表达量最高;不同激素处理结果显示,CsbHLH2受SA、ETH、MEJA诱导。     

冠突散囊菌和植物乳杆菌联合发酵对绿茶液态饮料品质的影响

为了抑制冠突散囊菌发酵绿茶液态饮料中儿茶素的降解,本研究采用植物乳杆菌和冠突散囊菌对绿茶液态饮料进行联合发酵,试验通过响应面法优化了联合发酵绿茶液态饮料工艺,并采用高效液相色谱（HPLC）法和顶空固相微萃取串联气质联用（HS-SPME/GS-MS）法分别检测了联合发酵绿茶液态饮料中儿茶素含量和香气成分。结果表明,在干茶添加量10βg·L^-1、冠突散囊菌添加量10βmL·L^-1的前提下,联合发酵绿茶液态饮料的最佳工艺条件为植物乳杆菌添加量20βmL·L^-1、蔗糖添加量75βg·L^-1、30℃下静置发酵3βd。在此工艺下联合发酵绿茶液态饮料中总儿茶素含量为1β419.94βμg·mL^-1,与冠突散囊菌发酵绿茶液态饮料（848.72βμg·mL^-1）相比,显著增加（P<0.05）;且醇类化合物（30.27%）、醛类化合物（15.25%）、烃类化合物（11.35%）、酯类化合物（9.86%）和酮类化合物（9.01%）含量与未发酵绿茶液态饮料相比均显著增加（P<0.05）。     

基于4300 DNA分析系统的茶树SSR发掘方法优化与建立

简单序列重复（Simple sequence repeats, SSR）在茶树遗传与育种研究中具有重要的作用,基于4300 DNA分析系统的SSR发掘具有通量高、准确和灵敏等特点,已被用于许多物种的分子标记研究,但在茶树的相关研究中尚未见报道。本研究应用单因素试验和L₉(3⁴)正交设计试验对影响茶树SSR-PCR的主要参数进行优化,建立了适合于4300 DNA分析系统的茶树SSR-PCR反应体系：1.0 μL DNA（25 ng·μL^-1）,0.2 μL M13F-F、0.2 μL R和0.4 μL IR-M13F,0.8 μL dNTPs（25 mmol·L^-1）,1.0 μL 10×Buffer（含Mg²⁺）,0.1 μL Ex-Taq聚合酶（5 U·μL^-1）,无菌水定容至10 μL。所有引物浓度均为1 μmol·L^-1。同时,本研究还证明,可以以自行配制的6.5%聚丙烯酰胺凝胶溶液（acry:bis=29:1）替代4300 DNA分析系统指定凝胶溶液,检测SSR位点。     

茶树PPO基因家族的鉴定与分析

多酚氧化酶（Polyphenol oxidases,PPO）是由核酸编码的一种以氧为受体的含铜金属酶,为一种末端氧化酶,在茶叶加工中也发挥重要的作用。从最新发布的茶树基因组数据库中获得了5条PPO基因：CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3、CsPPO4（GenBank登录号为GQ129142.1）、CsPPO5。本研究利用生物信息学方法,对5条基因的核酸序列和氨基酸序列进行分析,并对基因编码蛋白的理化性质和结构功能进行预测。结果表明,5个基因CDS区全长在597~1β839βbp之间,编码氨基酸数目198~612;系统进化树分析显示CsPPO1、CsPPO3、CsPPO4和CsPPO5具有较近的亲缘关系;编码的蛋白均属于亲水性不稳定类脂类结合蛋白,都不具有信号肽;无规则卷曲是蛋白质的主要结构元件,α-螺旋和β-折叠分散于整个多肽链中,CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3可能存在一个或多个跨膜螺旋;5个蛋白均含有PPO1_DWL（pfam12142）保守结构域,除了CsPPO2外,其余4个蛋白均预测到TYROSINASE功能结构域。实时定量PCR结果表明,PPOs基因在不同茶树品种间呈现出不同的表达模式。     

茶鲜叶中多环芳烃类化合物的分布特性研究

利用高效液相色谱法分析了不同季节、不同茶树品种、不同部位茶鲜叶中16种多环芳烃（PAHs）的分布特性。结果表明,3个茶树品种,以政和大白茶鲜叶原料中PAHs的含量和标准偏差值最小,平均含量为126.92 μg·kg^-1,偏差值为17.59 μg·kg^-1;不同部位茶鲜叶中PAHs含量及标准偏差值表现为芽<第二叶<第四叶<第六叶,芽头PAHs含量为119.13 μg·kg^-1,标准偏差值为14.36 μg·kg^-1;不同季节茶鲜叶中PAHs含量及标准偏差值呈现秋<春<夏的分布特性,秋季茶鲜叶中PAHs的含量为112.75 μg·kg^-1,标准偏差值为11.97 μg·kg^-1;同时茶鲜叶中16种PAHs主要以2、3环PAHs为主,占PAHs总量的80%左右,4~6环PAHs相对较少。     

信阳茶区柿广翅蜡蝉越冬种群的发生与为害规律

不仅调查了粗放和精细两种管理模式茶园内柿广翅蜡蝉越冬产卵刻痕对茶枝的为害情况,还调查统计了其越冬产卵时对茶枝直径的选择情况,以及在茶枝上越冬产卵部位、产卵刻痕长度和相应的着卵量。研究表明,两个粗放管理茶园内茶枝的受害率（9.86%、13.79%）均显著高于精细管理茶园,柿广翅蜡蝉成虫偏向于在直径为0.20~0.30βcm的茶枝上产卵越冬,而且产卵刻痕顶端至茶枝芽头的平均距离为7.22βcm,产卵刻痕长度平均值为1.35βcm。此外,柿广翅蜡蝉越冬产卵刻痕长度（x）与刻痕内着卵量（y）之间呈显著正相关关系,满足方程：y=17.83x+1.12（F=3β652,df=1β145,R²=0.96,P<2.2×10^-16）。建议每年10月初到次年3月下旬,应及时剪除受越冬卵刻痕为害的茶树嫩枝条并加强茶园管理,以实现柿广翅蜡蝉越冬种群的区域性控制。本研究为信阳茶区柿广翅蜡蝉越冬种群的预测预报和生态防控提供了理论依据,对减少茶园农药用量以及提高“信阳毛尖”的产量和品质具有非常重要的意义。     

茶树CsMGTs基因的克隆及其镁转运功能分析

镁离子（Mg²⁺）作为叶绿素的中心成分,是植物细胞中含量最丰富的二价阳离子,也是多种酶的激活剂,特别是茶氨酸合成酶的活性依赖Mg²⁺,常被作为茶树专用肥的特征成分,因此对茶树的生长发育和茶叶的品质形成至关重要。MRS2/MGT家族镁转运蛋白在维持植物体内Mg²⁺的吸收转运、胞内平衡和耐逆性等方面起着重要的作用。为探究茶树MRS2/MGT家族镁转运蛋白基因的功能,以茶树品种陕茶1号为材料,克隆了4条MRS2/MGT镁转运蛋白基因,分别命名为CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3。生物信息学分析表明,这4个转运蛋白在C末端均含有2个跨膜结构域和1个保守的GMN三肽基序;系统发育分析显示,CsMGT1属于Clade C成员,而CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3属于Clade B成员,所编码蛋白与木本植物柑橘MGT家族的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析表明,CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3在茶树的根、茎、叶、花中呈组成型表达,且根和叶对Mg²⁺浓度均表现出不同程度的响应。鼠伤寒沙门氏菌镁转运缺失突变株MM281功能互补试验表明,CsMGT1和CsMGT2均具有Mg²⁺转运功能,且CsMGT1的Mg²⁺转运功能优于CsMGT2,而CsMGT2.1和CsMGT3几乎没有镁离子转运功能。本研究结果丰富了茶树CsMGTs家族的生物学功能,为进一步阐明茶树通过镁转运功能机制实现对镁离子的利用奠定了前期研究基础。     

闽中某县茶园土壤-茶树-茶汤中镉含量及健康风险评价研究

以闽中某县8个代表性茶园为研究对象,采集茶园土壤和茶树各器官样品,分析镉在茶园土壤-茶树中积累和分布规律,并探讨其受土壤理化性质的影响;同时测定茶汤中镉含量并算出茶叶中镉的溶出率,利用美国国家环保署（USEPA）推荐的健康风险评价模型进行人体致癌健康风险评价。结果表明,茶园土壤全镉含量均值为112.74βμg·kg^-1,是福建省土壤背景值的2.06倍,茶园土壤镉积累明显;茶园土壤有效镉含量均值为26.44βμg·kg^-1,镉活化率均值为24.86%,有效程度较高。土壤pH和有机质是影响土壤镉及其有效性的主要因素,土壤全磷和速效磷是影响镉活化率的主要因子;茶树主根和侧根与土壤全镉、有效镉和有机质呈显著正相关（P<0.05）,新叶镉含量与土壤有效镉和全磷呈显著正相关（P<0.05）。茶树各器官镉含量分布规律为：侧根（1β253.89βμg·kg^-1）>主根（382.20βμg·kg^-1）>主茎（167.25βμg·kg^-1）≈侧茎（154.65βμg·kg^-1）>老叶（30.60βμg·kg^-1）≈新叶（27.13βμg·kg^-1）,茶树根部镉富集系数显著大于其他器官（P<0.05）,新叶和老叶镉富集系数较低,镉大部分被根和茎固定,向叶的迁移能力较低。茶汤中镉含量均值为192.28βng·L^-1,远低于《生活饮用水卫生标准》中镉含量,茶叶中镉溶出率均值为15.29%;茶汤和茶叶中镉致癌健康年风险分别为6.33×10^-7和4.42×10^-6,比国际辐射防护委员会推荐的化学有害物最大可接受水平（5×10^-5）低约1~2个数量级,说明可以安全饮用。